专利名称：小肽tff3治疗代谢综合征的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及代谢相关疾病的治疗领域。具体而言，本发明涉及小肽TFF3在治疗高血糖、胰岛素抵抗、脂肪肝、肥胖症及心血管相关代谢疾病中的用途。
背景技术：
代谢综合征好发于现代文明社会，许多个体同时表现出有多种心血管疾病的危险因素，包括糖代谢障碍(空腹血糖受损、糖耐量异常、II型糖尿病)，脂代谢异常(血甘油三脂浓度升高、极低密度脂蛋白浓度升高、高密度脂蛋白胆固醇水平降低)，高血压，向心性肥胖等。20世纪60年代将糖耐量异常和高血压称为“富裕综合征”。1989年又将以高胰岛素血症为基础的内脏性肥胖、糖耐量异常、高甘油三脂血症、高血压作为冠心病的危险因素，概括为“死亡四重奏”。1991年将这组代谢性心血管疾病症候群命名为“胰岛素抵抗综合征”。另外也有称代谢综合征为“四高一低”(即高血糖或糖耐量异常、高甘油三脂血症、 高血压、高密度脂蛋白胆固醇水平降低)等。而最近报道认为代谢综合征是高血压、血糖异常、血脂紊乱和肥胖症等多种疾病在人体内集结的一种状态，直接导致糖尿病、脂肪肝和严重心血管疾病的发生，并造成死亡。代谢综合征以中老年为多发，美国调查发现20岁以上人群患病率为23.7%，我国统计病学调查为14% -15%，而且随着年龄的增加而增加。全世界每年死于心脑血管病达1550万，占总死亡人数的近30%。我国占世界人口 1/5，2000年我国城市冠心病死亡 71. 3/10万，农村31. 6/10万，每年死于心血管病约350万人，据预计，患有代谢综合征的病人，在未来7年里，每8个人就会有1人因代谢综合征死亡，因此代谢综合征是21世纪人类面临的最严重的公众健康问题之一，其发病率逐年递增，严重威胁人类健康，并且给全世界带来了沉重的负担。目前认为代谢综合征为心血管事件的危险因素，中心环节为胰岛素抵抗，而脂肪肝是其根源。胰岛素抵抗使葡萄糖利用能力的下降，由于葡萄糖利用减少引起血糖水平升高，继而胰岛素代偿性增多，表现为高胰岛素血症，能够导致感染、心脏病变、脑血管病变、肾功能衰竭、双目失明、下肢坏疽等而成为致死致残的主要原因。并且通过对内皮功能的损害，加速动脉粥样硬化的进程。胰岛素抵抗个体的内皮功能障碍表现为粘附因子增多、平滑肌细胞增生以及血管扩张功能下降。这一系列改变是促进动脉粥样硬化形成的重要因素。胰岛素抵抗还引起凝血和纤溶状态的失衡，出现高凝状态由于纤维蛋白原、纤溶酶原激活剂抑制因子I(PAI-I)水平明显增加，一旦体内发生血液凝固，患者不能正常启动纤溶过程，极易造成血栓的形成。内脏脂肪堆积是代谢综合征的另一重要特征，也是导致胰岛素抵抗的主要原因。在内脏脂肪堆积的个体中，首先受累的脏器是肝脏。当肝内脂肪沉积过多时，可使肝被膜膨胀、肝韧带牵拉，而引起右上腹剧烈疼痛或压痛、发热、白细胞增多，可以有腹水和下肢水肿、电解质紊乱如低钠、低钾血症等。脂肪囊泡破裂时，脂肪颗粒进入血液也可引起脑、肺血管脂肪栓塞而突然死亡；若肝细胞脂肪堆积压迫肝窦或小胆管时， 门静脉血流及胆汁排泄受阻，出现门静脉高压及胆汁淤积，而过多游离脂肪酸的沉积即可导致脂肪肝，并会引起肝酶水平升高，甚至肝脏结构的改变，而引起的脂肪肝有可能导致脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。由于代谢综合征病因复杂，临床上使用的药物，大多数有治疗失效和不良反应等缺点。本研究发现TFF3小肽可明显改善代谢综合征的相关症状，且无不良反应发生，在未来可能成为治疗代谢综合征的有效新药。
发明内容
TFF3是一种小分子肽，发明人研究发现这种小分子肽可以通过调节肝脏与糖代谢相关的重要基因例如GP6C、PEPCK、PGC-I α而具有降低血糖的功能，同时TFF3能够调节肝脏内脂代谢相关基因来降低肝脏内三油甘脂的含量从而改善脂肪肝症状。另一方面TFF3 在糖尿病模型DB/DB鼠中通过影响肝脏内一系列复杂的糖脂代谢通路在改善葡萄糖耐受性以及增加胰岛素敏感性方面效果亦十分明显，因此TFF3小肽可以用于改善II型糖尿病人血糖水平，改善脂肪肝，改善葡萄糖耐受性以及增加胰岛素敏感性方面的作用，从而达到治疗II型糖尿病、脂肪肝、肥胖症、心血管等代谢综合征方面的疾病。种属人的TFF3氨基酸序列如下EEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF(SEQ ID No :1)。因此，本发明一方面涉及小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途。在本发明中，代谢综合征包括脂肪肝和肥胖症等。在本发明中，小肽TFF3可降低高血糖患者的血糖浓度。在本发明中，小肽TFF3可增加患者中胰岛素的敏感性。在本发明中，小肽TFF3可降低患者肝脏甘油三酯的含量。在本发明中，小肽TFF3可通过降低肝脏葡萄糖-6-磷酸酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或PGC-I α的mRNA表达水平从而治疗代谢综合征。另一方面，本发明还涉及小肽TFF3在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。优选地，本发明中小肽TFF3所治疗的糖尿病为胰岛素抵抗型糖尿病而非胰岛功能损伤型糖尿病。另一方面，本发明还涉及小肽TFF3在制备治疗高血糖相关疾病的药物中的用途， 所述的高血糖相关疾病可以是高血糖导致的感染、心脏病变、脑血管病变、肾功能衰竭、双目失明、下肢坏疽。本发明所定义的TFF3包括单体和二聚体形式，以及其同型类似物，同型类似物可以是与天然的TFF3氨基酸序列不同或者发生糖基化，乙酰化，磷酸化，羧基化等修饰作用但是氨基酸序列并未发生改变的情况，或者两者都存在。同型类似物的氨基酸序列包括与天然的TFF3氨基酸序列相似程度至少在60%，或相似程度更高的70%，或相似程度更高的 80 %，或相似程度更高的90 %，或相似程度更高的95 %甚至99 %。优选地，本发明中的小肽TFF3为a.氨基酸序列为SEQ ID No :1，或b.在a中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且活性不变的由 a衍生的多肽。
在上述b中所述的经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且活性不变的由a衍生的多肽的序列可以是下述任一序列的多肽AEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQETECTF(SEQ ID No 8)YVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF(SEQ ID No
9)ADEEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQET(SEQ ID No
10)上述序列的多肽可通过例如人工合成或根据氨基酸序列设计相应的编码多核苷酸序列并在宿主中通过表达载体表达该多核苷酸序列而制备。根据本发明，所制备的多肽的活性可通过，例如，检测肝原代细胞中G6PC、PEPCK, PGC-I α的mRNA水平而确定。
图1 在0Β/0Β肥胖鼠中TFF3的mRNA水平比野生型鼠下降了 7. 38倍。图2 :A，过表达TFF3小肽的肝原代细胞中，G6PC的mRNA水平比GFP组下降了 14. 5 倍；B，过表达TFF3小肽的肝原代细胞中，PEPCK的mRNA水平比GFP组下降了 6. 7倍；C，过表达TFF3小肽的肝原代细胞中，PGC-I α的mRNA水平比GFP组下降了 6. 1倍。图3 过表达TFF3小肽的肝原代细胞中甘油三酯含量比GFP组有所下降。图4 =A,饥饿16小时后按lg/Kg的剂量注射葡萄糖后，在0分钟，15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，90分钟的时候分别检测血糖，TFF3能够很好的增加胰岛素的敏感性 (n = 5) ；B，检测血清中葡萄糖含量，TFF3组比GFP组的血糖明显降低(n = 5) ；C，分别注射Ad-GFP和Ad-TFF3腺病毒10天后G6PC的mRNA水平TFF3组比GFP组明显降低。图5 :A，饥饿16小时后按Ig葡萄糖/Kg体重的剂量注射葡萄糖后，在0分钟，15 分钟，30分钟，45分钟，60分钟，90分钟的时候分别检测血糖，TFF3能够改善葡萄糖的耐受性(n = 4) ；B，注射TFF3腺病毒5天后的DB/DB鼠比GFP组的血糖有明显的下降；饥饿6Η 后按IU胰岛素/Kg体重的剂量注射胰岛素后，在0分钟，15分钟，30分钟，45分钟，60分钟， 90分钟，120分钟的时间点分别检测血糖，TFF3能够增加胰岛素的敏感性。
具体实施例方式实验材料载体pGEM-T EASY、实时定量PCR试剂盒购自于!Iomega公司；pcDNA4/ myc-His、TransScript II First-Strand cDNASynthesis SuperMix 试剂盒、转染试剂 Iipofectamine 2000 购自于 Invitrogen 公司；pAdTrack-CMV 禾口 pAdEasy-1 均购自于 Mratagene公司；各种内切酶均购自TAKARA公司；各类实验动物模型购自南京大学模式动物研究所；OneTouch Ultra 稳豪型血糖测试仪及相配套血糖试纸购自强生公司。实验方案1.克隆小鼠TFF3基因:按照hvitrogen公司Trizol试剂说明书提取C57BL/6J鼠肝脏细胞总RNA，使用 TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒将肝脏组织的总 RNA 逆转录成cDNA，以小鼠肝脏cDNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)，引物设计为
F 5' -GAATTCCCACCATGGAGACC-3，R 5' -CGAGAAATGTGCATTCTGTCT-3，将PCR产物连接到pGEM-T EASY载体上，测序序列正确，得到质粒pGEM_T EASY-TFF3。2.小鼠TFF3过表达载体的构建以pGEM_T EASY-TFF3模板，引物设计为F 5' -CGGAATTCCCACCATGGAGACC-3’ R 5 ’ -ACATACTCGAGAAATGTGCATTCTGTCT-3’将PCR产物分别用EcoRI和XholI双酶切，同样用EcoRI和XholI双酶切pcDNA4/ myc-His空载体，两者连接16°C过夜后转化到DH5 α大肠杆菌中，涂于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上培养，挑取的克隆用EcoRI和B10II双酶切鉴定，得到的阳性克隆即为 pcDNA4-TFF3-myc-His 表达质粒。3.小鼠TFF3腺病毒的构建与包装以pGEM-T EASY-TFF3为模板，引物设计为F 5' -ACAGATCTCCACCATGGAGACCAGAGCCCTCTGG-3’R :5’ -ACCTCGAGTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAAATGTGCATTCTGTCT-3’PCR产物分别用Bgl II和XholI双酶切，同样用Bgl II和XholI双酶切 PAdTrack-CMV空载体，两者连接16 °C过夜后转化到DH5 α大肠杆菌中，涂于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上培养，挑取克隆用Bgl II和B10II酶切鉴定得到阳性克隆 pAdTrack-CMV-TFF3 质粒。将 pAdTrack-CMV-TFF3_myc 用 PmeI 酶切线性化后与 pAdEasy-1 同源重组，若重组成功，用I^acI酶切鉴定时将出现301Λ，4. 5kb或31Λ条带。将重组成功的 pAd-TFF3质粒用I^cI线性化转染细胞，7_10天左右可用荧光显微镜观察到绿色荧光，至30% -50%细胞悬浮时收取细胞，50xg离心去上清，沉淀重悬于PBS中，液氮反复冻融三次用于再次扩增病毒。将上轮病毒再次感染细胞，24-48小时后细胞悬浮约50% 左右收细胞，收取细胞步骤同上。扩增病毒3次后小鼠TFF3腺病毒的包装完成，包装完成的腺病毒可用于细胞实验。采用氯化铯密度梯度离心的方法纯化包装完成TFF3腺病毒。 纯化后的腺病毒可用于动物实验。注射方式采用鼠尾静脉注射，注射剂量为C57BL/6J鼠 IxlO9Pfu ；DB/DB 鼠 dxK^pfu。4. C57BL/6J肝原代的分离分离肝原代前先给培养皿铺上鼠尾胶原，紫外灭菌2小时以上。使用0. 3 %异戊巴比妥钠按照0. 15ml/10g体重的剂量麻醉小鼠。解剖小鼠前先用乙醇擦拭皮肤消毒，然后呈 U字型剪开皮肤，打开腹腔。分离下腔静脉，打一假结，在假结靠下处插入导管套管，固定假结(建议打两个结以防止脱落。在打死第二个结前先固定下第一个结)。退出套管，留置导管。立即注入肝素0.2-0. :3ml。然后立即打开胸腔，结扎上腔静脉并剪开门静脉。向下腔静脉的导管缓慢注射灌流液I 2-3分钟。称取0.015g I型胶原酶溶于30ml 37°C预热的灌流液II (胶原酶终浓度0.05%)，混勻。向导管中缓慢注射灌流液II 5分钟至肝出现皲裂或水泡后将肝脏转移至75cm2大皿。撕破肝包膜，加入1640培养基。用镊子去除大的组织块，使用400目滤网筛选肝细胞(小心勿将含有组织块的液体滴落)。静置5分钟，沉降下来的则为肝细胞。上层液体中含有大量细菌，用枪吸走上层液体(不要直接倒上层液体， 否则细胞损失很多)，留少量液体将细胞转移至50ml离心管。使用1641培养基清洗细胞，50xg离心2分钟，弃上层液体，重复2-3次。然后使用台盼蓝计数活细胞数(活细胞数比例应达到70%以上才能达到实验要求)，100%接种细胞于先前铺过鼠尾胶原的培养皿中。5.各项指标检测实时定量PCR仪检测mRNA水平，反应条件为95°C 10分钟、95°C 30秒、57°C 30秒、 72°C30秒(捕捉荧光值)，循环45次，并作溶解曲线。数据分析软件由IQ5实时定量PCR 仪提供。甘油三酯等指标检测由北京协和医院完成。实验结果1.在0Β/0Β肥胖鼠中，TFF3的mRNA水平显著性下降，约为7. 38倍，说明TFF3小肽的下降可能与肥胖有着密切联系(图1)。2.对C57BL/6J分离出的肝脏原代细胞，分别加入能够过表达GFP和TFF3的腺病毒M小时后饥饿6小时，并继续用地塞米松(Dexamethasone)和福斯高林(R)rskolin)处理6小时后处理细胞。结果发现在过表达TFF3小肽的肝原代细胞中，与对照组(GFP)相比， 糖异生相关的重要基因例如葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)，过氧化物酶体增生物激活受体Y共激活因子1 α (PGC-1 α )的mRNA水平分别下降了 14. 5倍， 6. 7 倍，6. 1 倍(图 2)。3.在C57BL/6J分离出的肝脏原代细胞，分别加入能够过表达GFP和TFF3的腺病毒30小时后处理细胞，使用甘油三酯(Triglyceride)试剂盒测量TG含量发现，过表达 TFF3小肽的肝原代细胞TG含量明显比GPF组有所下降(图3)。4. C57BL/6J 动物实验葡萄糖耐受实验按照Ig葡萄糖/Kg体重的剂量给饥饿16小时后的C57BL/6J注射葡萄糖，检测血糖变化情况发现注射Ad-TFF3的C57鼠在15分钟后比GFP组血糖下降的更快，说明TFF3能够增加胰岛素的敏感性(图4中的A图)。注射Ad-GFP和Ad_TFF3腺病毒10天后检测的C57鼠血清中的葡萄糖含量发现， TFF3具有明显的降低血糖的功能(图4中的B图)。注射Ad-GFP和Ad-TFF3腺病毒10天后检测肝脏组织中G6PC的mRNA水平发现 G6PC的mRNA水平较GFP组下降了 3. 9倍，从分子水平说明了 TFF3的降糖功能(图4中的 C图)。5.糖尿病模型DB/DB鼠动物实验葡萄糖耐受实验按照Ig葡萄糖/Kg体重的剂量给饥饿16小时后的DB/DB鼠注射葡萄糖，在不同时间点检测血糖变化情况发现注射Ad-TFF3后的DB/DB鼠在单位时间内血糖上升速度比GFP组缓慢，在45分钟后比GFP组血糖恢复原水平更快，由此证明TFF3小肽能够降低葡萄糖的耐受性(图5中的A图)。胰岛素耐受性实验(ITT)按照IU胰岛素/Kg体重的剂量给饥饿6小时后的DB/ DB鼠注射胰岛素，在不同时间点检测血糖变化情况，数据显示注射Ad-TFF3后的DB/DB鼠在单位时间内血糖下降速度比GFP组快，尤其在15分钟时间点血糖下降更加明显，由此证明 TFF3小肽能够增加胰岛素的敏感性(图5中的B图)。
权利要求
1.小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途，其中代谢综合征包括脂肪肝、肥胖症。
3.根据权利要求1所述的小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途，其中小肽 TFF3降低患者的血糖浓度。
4.根据权利要求1所述的小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途，其中小肽 TFF3增加患者胰岛素的敏感性。
5.根据权利要求1所述的小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途，其中小肽 TFF3降低患者肝脏甘油三酯含量。
6.根据权利要求1所述的小肽TFF3在制备治疗代谢综合征的药物中的用途，其中小肽TFF3降低患者肝脏葡萄糖-6-磷酸酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或PGC-I α的 mRNA表达水平。
7.小肽TFF3在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的小肽TFF3在制备治疗II型糖尿病的药物中的用途，其中所述的糖尿病为胰岛素抵抗型糖尿病而非胰岛功能损伤型糖尿病。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述的小肽TFF3为a.氨基酸序列为SEQID No :1，或b.在a中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且活性不变的由a衍生的多肽。
全文摘要
本发明涉及小肽TFF3治疗代谢综合征的用途。发明人研究发现TFF3这种小分子肽能够治疗代谢综合征相关疾病，能够通过调节肝脏内糖代谢相关基因而具有降低血糖的功能，并且能够降低肝脏内甘油三酯含量，改善脂肪肝症状，在改善葡萄糖耐受性以及增加胰岛素敏感性方面效果亦十分明显。因此，小肽TFF3可用于改善II型糖尿病人血糖水平，改善脂肪肝症状，改善葡萄糖耐受性以及增加胰岛素敏感性，从而治疗代谢综合征如II型糖尿病、脂肪肝、肥胖症、心血管等疾病。
文档编号A61P3/10GK102526702SQ20101060337
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者左瑾, 常永生, 方福德, 薛源 申请人:中国医学科学院基础医学研究所