专利名称：一种基因治疗肝癌的双靶向性载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因载体，尤其涉及一种用于携带治疗肝癌目的基因的基因载体，以及该基因载体的制备方法。
背景技术：
肝癌是很常见的肿瘤之一，在全球发病率日益上升，严重危害人类的生命健康。目前治疗肝癌的方法主要是化疗、手术、介入等手段，但效果都不够理想。随着基因科学和技术的日益发展，基因治疗肝癌成为了可能。基因治疗的关键问题是携带基因的载体问题，目前该领域技术发展迅速，常用的肝癌基因治疗载体主要有病毒载体、脂质体、质粒、阳离子聚合物等。病毒载体效率高，但特异性差，且由于安全性问题，应用一直不理想。脂质体安全， 但特异性差。在众多的阳离子聚合物中，聚乙烯亚胺(PEI)具有极高的正电荷密度，可以与 DNA形成紧密的络合体，是近年来体内外细胞转染中研究最广，转染率最高的高分子载体。 但是高正电荷密度同时使PEI表现出很大的细胞毒性，而且载体的特异性也不强。如何实现基因治疗的特异性，即靶向性，是肝癌基因治疗的关键问题。从生物相容性和生物降解性考虑，设计低细胞毒性，高靶向性的载体成了亟待解决的问题。选择能够直接杀伤肝癌细胞而不损伤正常肝细胞，也就是特异定向于肝癌细胞的靶向性治疗基因载体体系，成为今后研究的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗肝癌的基因载体，使其具有良好的肝细胞靶向性， 对肝癌细胞有极大的杀伤作用，但不会杀伤正常的肝细胞，同时，本发明还提供了该基因载体的制备方法。以下是实现本发明的技术方案
一种基因治疗肝癌的双靶向性载体，是由乳糜微粒与含AFP启动子和自杀基因的真核表达质粒载体组成的复合物，且真核表达质粒载体与乳糜微粒的配比为每mL乳糜微粒中加入2yg质粒载体。本发明还提供了上述基因治疗肝癌的双靶向性载体的制备方法，具体包括以下步骤
1)配置浓度为50μ g/mL的含AFP启动子和自杀基因的真核表达质粒载体；
2)将乳糜微粒置于超声破碎仪中超声10次，每次15s，超声功率150w；
3)按照每mL乳糜微粒中加入2yg质粒载体的比例，将步骤1)和步骤2)的产物混合， 涡旋震荡30s，静置30min，得到本发明的基因治疗肝癌的双靶向性载体。乳糜微粒中含有载脂蛋白E (apoE)，而肝细胞和肝癌细胞膜表面均存在apoE受体，可以特异的识别和结合apoE，因此，乳糜微粒可以特异性的携带质粒载体定向于肝细胞和肝癌细胞，而不被身体的其它细胞所摄取，这就构成了本发明载体的第一个靶向性。而且
3乳糜微粒最终会在肝细胞和肝癌细胞中代谢，无细胞毒性问题。本发明使用的乳糜微粒购自北京启维益成科技有限公司。其中，所述的真核表达质粒载体是pAFP-TK-IRES2-EGFP，购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司，该质粒载体的质粒图谱如图1，其上含有启动基因表达的甲胎蛋白(AFP) 启动子，AFP启动子只能在特定的AFP启动环境下才能被启动，进而启动其下游的基因表达，该质粒载体上还携带有自杀基因TK (胸苷激酶基因)，该基因被启动后可以在肝癌细胞特异表达胸苷激酶，这种酶使能进入肝癌细胞的一种叫更昔洛韦的药物转变成为可以杀灭肝癌细胞的药物，同时还能产生“旁观者效应”，即杀死邻近的肝癌细胞。该效应只在肝癌细胞中产生，这就构成了本发明载体的第二个靶向性。本发明设计了双靶向性的基因治疗载体，其一，乳糜微粒是纯天然的生物提取物， 含有载脂蛋白apoE，并且乳糜微粒最终被代谢，绝对无毒副作用，无残留物。其二，根据只有肝癌细胞高表达甲胎蛋白(AFP)的特点，也就是肝癌细胞内存在能够启动AFP基因表达的环境，采用的质粒载体上含有AFP启动子，也就是说，该质粒载体只有在肝癌细胞中才能被启动表达，表达自杀基因并使肝癌细胞自杀，具有显著的肝细胞靶向性和对肝癌细胞显著的杀伤力。
图1是真核表达质粒载体PAFP-TK-IRES2-EGFP的质粒图谱。图2是乳糜微粒包裹质粒载体pAFP-TK-IRES2-EGFP的扫描电镜图(X 100000)。图3是乳糜微粒对质粒载体保护作用的琼脂糖凝胶电泳图。图4是本发明双靶向性载体介导EGFP在肝癌细胞株MHCC97中的特异性表达 (X300)。
具体实施例方式实施例1 双靶向性载体的制备。1.配置浓度为 50 μ g/mL 的 pAFP-TK_IRES2_EGFP 质粒载体。2.将乳糜微粒置于超声破碎仪超声10次，每次15s，超声功率150w。3.按照质粒载体与乳糜微粒的比例(质量/体积)为2 μ g/mL,将步骤1和步骤2 的产物混合，涡旋震荡30s，静置30min，制得双靶向性载体。实施例2 乳糜微粒对质粒载体的包裹效果。采用扫描电镜对实施例1所得的双靶向性载体进行观测，结果显示在质粒载体和乳糜微粒的比例(质量/体积)为2 μ g/mL时，乳糜微粒对质粒载体的包裹效果最好，并且粒径均在200 300nm之间，如图2。实施例3 乳糜微粒对质粒载体的保护作用。在实施例1所得的双靶向性载体中加入牛胰脱氧核糖核酸酶I，使其终浓度为 20 μ g/mL, 37°C消化30min，以单纯的质粒载体做对照，琼脂糖凝胶电泳观察乳糜微粒对质粒载体的保护作用。观察结果见图3，泳道1显示单纯的质粒载体由于没有乳糜微粒的保护作用，被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解；泳道2显示双靶向性载体中乳糜微粒对质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解。结果显示双靶向性载体中乳糜微粒对质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被降解，因此双靶向性载体具有较高的稳定性。实施例4 双靶向性载体介导EGFP在肝癌细胞株中的特异性表达。用实施例1所得的双靶向性载体分别转染体外培养的肝癌细胞株MHCC97、正常肝细胞株L-02、心肌细胞株HCMa、正常肾细胞株HK-2、大肠癌细胞株HT-29、骨骼肌细胞株 HSkMC,事先将体外培养的细胞株配制成10000个/mL的细胞悬液，然后每IOmL细胞悬液中加入实施例1所得双靶向性载体lmL，混勻，置37°C培养。转染48小时后，用荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。结果显示实施例1所得的肝癌基因治疗双靶向性载体仅在肝癌细胞株MHCC97中表达绿色荧光蛋白(EGFP)(图4)，其它细胞中未观察到EGFP 的表达，证明实施例1所得的肝癌基因治疗双靶向性载体具有较高的靶向性。
权利要求
1.一种基因治疗肝癌的双靶向性载体，是由乳糜微粒与含AFP启动子和自杀基因的真核表达质粒载体组成的复合物，且真核表达质粒载体与乳糜微粒的配比为每HlL乳糜微粒中加入2yg质粒载体。
2.根据权利要求1所述的基因治疗肝癌的双靶向性载体，其特征是所述的真核表达质粒载体是 pAFP-TK-IRES2-EGFP。
3.制备权利要求1基因治疗肝癌的双靶向性载体的方法，包括以下步骤1)配置浓度为50μ g/mL的含AFP启动子和自杀基因的真核表达质粒载体；2)将乳糜微粒置于超声破碎仪中超声10次，每次15s，超声功率150w；3)按照每mL乳糜微粒中加入2μg质粒载体的比例，将步骤1)和步骤2)的产物混合， 涡旋震荡30s，静置30min，得到双靶向性载体。
全文摘要
一种基因治疗肝癌的双靶向性载体，是由乳糜微粒与含AFP启动子和自杀基因的真核表达质粒载体组成的复合物。乳糜微粒中含有apoE，而肝细胞和肝癌细胞膜表面均存在apoE受体，可以特异的识别和结合apoE，乳糜微粒可以特异性的携带质粒载体定向于肝细胞和肝癌细胞，而不被身体的其它细胞所摄取，真核表达质粒载体含有启动基因表达的AFP启动子，只能在特定的AFP启动环境下才能被启动，进而启动其下游的基因表达，因此，本发明的双靶向性基因治疗载体具有良好的肝细胞靶向性，只有在肝癌细胞中才能被启动表达，具有显著的肝细胞靶向性。
文档编号A61K48/00GK102198277SQ20111008218
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者于保锋, 刘志贞, 司海东, 向前, 弓韬, 张俊涛, 张小曼, 张悦红, 徐钧, 王惠珍, 程凯, 胡晓年, 解军, 赵虹 申请人:山西医科大学