专利名称：一种硫酸软骨素纳米硒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药纳米材料技术领域，涉及一种硫酸软骨素纳米硒及其制备方法。
背景技术：
硫酸软骨素是糖胺聚糖的一种，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β -1， 4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，并在N-乙酰氨基半乳糖的C-4位或C-6位 羟基上发生硫酸酯化。硫酸软骨素能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环， 加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除，在心血管疾病、关节病的防治等方面具有 重要的作用。硫酸软骨素除了作为药品外，大量的是作为改善关节病的补充品，作为健康食 品应用，在美国已经风行多年。经过多年的应用，已经证明硫酸软骨素对改善老年退行性关 节炎、风湿性关节炎有一定的效果。硫酸软骨素能发挥以下功效以缓解关节疼痛问题①提供垫衬作用，缓和行动时 的冲击和摩擦；能将水分吸入蛋白多糖分子内，使软骨变厚犹如海绵般并增加关节内的滑 液量。这样它便能提供“垫衬”作用以增强关节的减震能力，缓和行走或跳动时的冲击和摩 擦。②软骨素的重要功能之一就是作为输送管道，为软骨输送重要的氧和营养素，同时把二 氧化碳和废物加以排除。由于关节软骨并无血液供应，因此所有的充氧、滋养及润滑作用皆 来自滑液。因老化、受伤或疾病而导致软骨素流失会造成滑液流失，导致软骨营养不良、干 涸、变薄及脆弱。此外，软骨若缺少适当的营养，因受伤或日常磨损而造成的软骨损坏将更 加难以更生或愈合。③软骨素的其它功效抑制破坏软骨的酵素(例如胶原酶、弹性蛋白酶 和组织蛋白酶)，以免软骨被分解或溶解；并且能从问题的根源处着手，抑制C0X-2的活性， 以防止关节发炎。微量硒是人体必需的营养元素，在临床上亚硒酸钠用于防治癌症、高血压、冠心 病、心肌炎、克山病、大骨节病等，若服用过量硒可引起中毒，每日最大安全量为400yg，硒 及其化合物有剧毒，但纳米硒毒性比无机硒小，生物活性又高于无机硒，从而克服了传统含 硒物质有效剂量与中毒剂量相差不大的弱点。故随着纳米硒的研制成功，以及纳米硒在生 物安全性上面的深入研究，作为一种有效的补硒剂将得到广泛的认可和应用。可生物降解的聚合物纳米粒子，特别是基于多糖的纳米微球和纳米微囊作为新型 药物输送和控释载体，因其具有良好的生物相容性、超细粒径、合理的体内分布和高效的药 物利用率，近年来日益受到广泛关注。可生物降解聚合物纳米微粒不仅可增强药物的稳定 性、提高疗效、降低毒副作用，而且可有效地越过许多生物屏障和组织间隙到达病灶部位， 从而更有效地对药物进行靶向输送和控制释。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种硫酸软骨素纳米硒及其制备方法，是以硫酸软骨 素作为载体结合纳米硒的新型材料，其毒性小，生物活性高。本发明是通过以下技术方案来实现
一种硫酸软骨素纳米硒，以硫酸软骨素作为载体，纳米硒通过硫酸基团结合在硫 酸软骨素上所形成的颗粒，其中硒的质量分数为1 30%。所述的硫酸软骨素纳米硒在水或乙醇中分散后，自组装形成粒径为30 50nm的 纳米颗粒。一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法，包括以下步骤以质量份数计，将1份的硫酸软骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶解 ’然 后在搅拌下，逐滴加入含有2 5份维生素C的水溶液，直至不再有沉淀生成，抽滤并收集 沉淀，30 50°C真空干燥后得到硫酸软骨素纳米硒；或者，以质量份数计，将1份的硫酸软骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶 解；然后将所得溶液装入透析袋中，放入含有2 10份维生素C的水溶液中透析24 30h， 收集透析袋中的溶液，冷冻干燥后得到的红色粉末即为硫酸软骨素纳米硒。所述的硒化物为亚硒酸盐或硒代硫酸盐。所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠，所述的硒代硫酸盐为硒代硫酸钠。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒是以硫酸软骨素为载体，纳米硒通过硫酸基团 结合后形成的可生物降解的聚合物纳米粒子，在水或乙醇中分散后，形成自组装纳米颗粒。本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒具有较低的细胞毒性，不仅可以拮抗T-2毒素 诱导细胞凋亡的作用，而且硫酸软骨素纳米硒拮抗T-2毒素诱导细胞凋亡的效果强于p38 和JNK抑制剂对T-2毒素诱导细胞凋亡的作用。与作为常规的治疗大骨节病药物的亚硒酸钠相比，本发明提供的硫酸软骨素纳米 硒，结合了硫酸软骨素和纳米硒双重药理活性，降低了无机硒的毒性，提高其生物利用度的 同时结合硫酸软骨素的生物活性，可以更好的将其发展成为预防和改善骨关节病的新型纳 米材料。本发明利用硫酸软骨素、亚硒酸盐或硒代硫酸盐作为原料，在温和条件下通过维 生素C还原制得硫酸软骨素纳米硒，其工艺简洁、操作简单，是一种绿色环保的合成方法。 制备时硫酸软骨素和亚硒酸钠的相对量可以是一个较大的范围，而在加工成药品或保健品 时需要结合硒的生理需求量、界限中毒剂量、日建议膳食补充量和最高安全摄入量等数据 来综合考虑每日最适补充剂量。
图1为硫酸软骨素纳米硒(CSS)与硫酸软骨素(CS)的红外光谱对比谱图；图2为硫酸软骨素纳米硒(CSS)与硫酸软骨素(CS)的XRD衍射对比谱图；图3为硫酸软骨素纳米硒(CSS)的透射电镜图；图4为不同干预下软骨细胞的MTT图；图5为不同干预下软骨细胞的荧光显微镜图；图6为不同干预下软骨细胞流式细胞图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1称取硫酸软骨素Ig溶解于IOml蒸馏水中，再加入亚硒酸钠(Na2SeO3)O. 5g溶解， 得到无色透明溶液；然后在搅拌下，逐滴加入维生素C溶液(抗坏血酸溶液，抗坏血酸Ig溶 解于IOml蒸馏水中)，有红色沉淀生成，待红色沉淀不再生成时，抽滤，收集红色沉淀，30°C 真空干燥得红色粉末即为硫酸软骨素纳米硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米 硒中硒元素的含量为15.6%。实施例2称取硫酸软骨素5g溶解于20ml蒸馏水中，再加入亚硒酸氢钠(NaHSeO3) 1. 2g溶 解，得到无色透明溶液；然后在搅拌下，逐滴加入抗坏血酸溶液(抗坏血酸3g溶解于IOml 蒸馏水中)，有红色沉淀生成，待红色沉淀不再生成时，再将反应体系转入到透析袋中，并以 蒸馏水透析48小时，抽滤，收集红色沉淀，30°C真空干燥得红色粉末即为硫酸软骨素纳米 硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米硒中硒元素的含量为7.8%。实施例3称取硫酸软骨素2g溶解于5ml蒸馏水中，再加入亚硒酸氢钠0. 5g溶解后得到无 色透明溶液，然后将装有上述溶液的烧杯放在40KHZ，30°C条件下超声30min后转移到透析 袋中，将透析袋放入抗坏血酸溶液中(抗坏血酸5g溶解于50ml蒸馏水中)透析过夜，可见 透析袋中有红色絮状物，收集透析袋中的反应液，抽滤得红色物质，30°C真空干燥得红色粉 末即为硫酸软骨素纳米硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米硒中硒元素的含量 为 9. 3%。实施例4称取硫酸软骨素2g溶解于5ml蒸馏水中，再加入亚硒酸氢钠0. 2g溶解后得到无 色透明溶液，然后将装有上述溶液的烧杯放在40KHZ，30°C条件下超声30min后转移到透析 袋中，将透析袋放入抗坏血酸溶液中(抗坏血酸2. 5g溶解于50ml蒸馏水中)透析过夜，可 见透析袋中有红色絮状物，收集透析袋中的反应液，抽滤得红色物质，30°C真空干燥得红色 粉末即为硫酸软骨素纳米硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米硒中硒元素的含 量为2. 2%。实施例5称取硫酸软骨素0. 5g溶解于2ml蒸馏水中，再加入硒代硫酸钠(Na2SSeO3) 0. 5g溶 解后得到无色透明溶液，然后将装有上述溶液的烧杯放在40KHZ，30°C条件下超声IOmin后 装入透析袋中，将透析袋放入抗坏血酸溶液中(抗坏血酸2g溶解于30ml蒸馏水中)透析 过夜，然后将抗坏血酸溶液更换为蒸馏水，继续透析12h，收集透析袋的反应液，冷冻干燥后 得红色粉末即为硫酸软骨素纳米硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米硒中硒元 素的含量为18.4%。实施例6称取硫酸软骨素Ig溶解于IOml蒸馏水中，再加入硒代硫酸钠0. Sg溶解，得到无 色透明溶液；然后在搅拌下，逐滴加入维生素C溶液(抗坏血酸溶液，抗坏血酸2g溶解于 IOml蒸馏水中)，有红色沉淀生成，待红色沉淀不再生成时，抽滤，收集红色沉淀，30°C真空 干燥得红色粉末即为硫酸软骨素纳米硒。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素纳米硒中硒元素的含量为26.7%。对于所制备的硫酸软骨素纳米硒，下面对于其结构和生物活性进一步介绍。1、硫酸软骨素纳米硒的IR谱图硫酸软骨素的红外吸收光谱在3400CHT1 (-0H，存在多糖经基)，IeZOcnT1O C = 0)，1560cm"1 (C-N,存在乙酞氨基)，UOOcnT1至800CHT1间(存在硫酸基)有特征吸收峰。此 外，硫酸软骨素A和C还略有不同，一般购买的商品硫酸软骨素为A和C的混合物，硫酸软 骨素A在928cm—1及852cm—1有特征吸收峰，而硫酸软骨素C在lOOOcm—1及820cm—1处有特 征吸收峰。如图1所示的硫酸软骨素纳米硒(CSS)与硫酸软骨素(CS)的红外光谱对比谱图， 横坐标为波数，可以看到所制备的硫酸软骨素纳米硒红外图谱lOOOcnT1附近的峰位明显减 少和减弱，表明着纳米硒与硫酸软骨素结合的位置发生在硫酸基团处。2、硫酸软骨素纳米硒的XRD谱图如图2所示的硫酸软骨素纳米硒(CSS)与硫酸软骨素(CS)的XRD衍射对比谱图， 横坐标以2 θ表示衍射仪扫描角度，纵坐标为强度；可以看出，二者晶体衍射的峰位和强度 均发生较大的变化，CS的衍射图谱在很多峰位都有较强的吸收峰，每个峰位代表一个晶面， 经过修饰后的CSS的衍射图谱峰位减少，强度降低，说明形成了新的物质。3、硫酸软骨素纳米硒形态与粒径以无水乙醇分散硫酸软骨素纳米硒制成5%的溶液，超声IOmin后，置于透射电镜 下的观察(加速电压75kV，放大倍率50000 X)，其结果如图3所示，可见硫酸软骨素纳米 硒呈较规则球形，粒径在30nm-200nm，因为超声作用，图中可见少数硫酸软骨硒粒子团聚现 象。这表明硫酸软骨素纳米硒在分散后，自组装形成纳米颗粒。4、硫酸软骨素纳米硒的生物活性4. 1硫酸软骨素纳米硒细胞毒性检测将软骨细胞种于96孔板中培养1天后，按照预先设定的浓度梯度进行干预，3天 后采用MTT法测量490nm的OD值以检测细胞相对活力，具体的检测结果的如图4所示，横 坐标为作对照的组号，每组将硒的浓度换算一致，亚硒酸钠中硒的浓度为45. 6%，本试验用 硫酸软骨素纳米硒中硒元素的含量由原子荧光分光光度计测得26. 7% (从左到右算起，1 组 Na2SeO3 lng/ml，CSS 为 1. 7ng/ml ；2 组 Na2SeO3 为 2ng/ml，CSS 为 3. 4ng/ml ；3 组 Na2SeO3 为 5ng/ml，CSS 为 8. 5ng/ml 4 组 Na2SeO3 为 10ng/ml，CSS 为 17ng/ml ；5 组 Na2SeO3 为 20ng/ ml, CSS 为 34ng/ml ；6 组 Na2SeO3 为 50ng/ml，CSS 为 85ng/ml ；7 组 Na2SeO3 为 100ng/ml，CSS 为 170ng/ml ；8 组 Na2SeO3 为 200ng/ml, CSS 为 340ng/ml)。纵坐标为细胞活力(% )；结果 显示随着浓度的提高，亚硒酸钠处理过的细胞活力逐渐下降，尤其是从第6组增加到第7组 时，细胞活力下降尤为明显；与亚硒酸钠处理相比，硫酸软骨素纳米硒相同浓度处理后，细 胞活力要高于亚硒酸钠处理后的细胞，尤其是从第6增加到第7、8组时，细胞活力几乎没有 下降，细胞活力要远远高于亚硒酸钠处理后的细胞(75%> 20% )。这表明硫酸软骨素纳米 硒细胞毒性低于同剂量的亚硒酸钠，而且细胞活力衰减到50%所需要的浓度要远高于亚硒 酸钠的浓度。4. 2硫酸软骨素纳米硒对T-2毒素的拮抗效果4. 2.1免疫荧光检测
将软骨细胞分为3组，一组为作为对照的正常细胞，一组为T-2毒素(浓度为 20ng/ml)处理细胞，一组为加入硫酸软骨素纳米硒(200ng/ml，硒的含量为10. 1%)和T-2 毒素(20ng/ml)处理细胞；培养5天后，用Armexin-V-FITC和PI双标记细胞染色，荧光显 微镜下检测，结果如图5所示(上下两排分别为绿色和蓝色滤波片下的图像)，与正常组细 胞的细胞存活数量相比，T-2毒素处理细胞组的细胞存活量最少，而加入硫酸软骨素纳米硒 的T-2毒素处理细胞组的细胞存活量，要多于T-2毒素处理细胞组，这表明硫酸软骨素纳米 硒可以拮抗T-2毒素诱导细胞凋亡的作用。4. 2. 2流式细胞术检测将软骨细胞分为5组，其中一组做空白对照(A组)，其余4组分别为B组T_2毒素 (20ng/ml)和 p38 (SB203580,10 μ Μ)、C 组Τ_2 毒素(20ng/ml)和 JNK 抑制剂(SP600125， 10 μ Μ)、D组T-2毒素(20ng/ml)和硫酸软骨素纳米硒(200ng/ml，其中硒的浓度为20ng/ ml)和E组T-2毒素(20ng/ml)组；抑制剂和药物先于T-2毒素30min加入，培养3天后的 软骨细胞用0. 25%的胰酶消化后，用Armexin-V-FITC和PI双标记细胞凋亡试剂染色。处理完成之后，在流式细胞仪上检测细胞的存活数量，具体的检测结果如图6所 示，其中，正常组的检测结果图6-A所示，T-2毒素+p38抑制剂的检测结果图6-B所示，T-2 毒素+JNK抑制剂的检测结果图6-C所示，T-2毒素+硫酸软骨素纳米硒的检测结果图6-D 所示，T-2毒素处理的检测结果图6-E所示，作为显示检测目标的LL、LR分别代表正常细 胞和早期凋亡细胞，而其结果不仅显示浓度为200ng/ml的硫酸软骨素纳米硒可以拮抗T-2 毒素诱导细胞凋亡的作用，而且硫酸软骨素纳米硒拮抗T-2毒素诱导细胞凋亡的效果强于 P38和JNK抑制剂对T-2毒素诱导细胞凋亡的作用。
权利要求
1.一种硫酸软骨素纳米硒，其特征在于，以硫酸软骨素作为载体，纳米硒通过硫酸基团 结合在硫酸软骨素上所形成的颗粒，其中硒的质量分数为1 30%。
2.如权利要求1所述的硫酸软骨素纳米硒，其特征在于，所述的硫酸软骨素纳米硒在 水或乙醇中分散后，自组装形成粒径为30 200nm的纳米颗粒。
3.一种硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤以质量份数计，将1份的硫酸软骨素和0.1 1份的硒化物加入水中完全溶解；然后在 搅拌下，逐滴加入含有2 5份维生素C的水溶液，直至不再有沉淀生成，抽滤并收集沉淀， 30 50°C真空干燥后得到硫酸软骨素纳米硒；或者，以质量份数计，将1份的硫酸软骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶解； 然后将所得溶液装入透析袋中，放入含有2 10份维生素C的水溶液中透析24 30h，收 集透析袋中的反应液，冷冻干燥后得到的红色粉末即为硫酸软骨素纳米硒。
4.如权利要求3所述的硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于，所述的硒化物为 亚硒酸盐或硒代硫酸盐。
5.如权利要求4所述的硫酸软骨素纳米硒的制备方法，其特征在于，所述的亚硒酸盐 为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠，所述的硒代硫酸盐为硒代硫酸钠。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸软骨素纳米硒，以硫酸软骨素作为载体，纳米硒通过硫酸基团结合在硫酸软骨素上所形成的颗粒，其中硒的质量分数为1～30％。本发明利用硫酸软骨素、亚硒酸盐或硒代硫酸盐作为原料，在温和条件下通过维生素C还原制得硫酸软骨素纳米硒，其工艺简洁、操作简单，是一种绿色环保的合成方法。本发明提供的硫酸软骨素纳米硒，结合了硫酸软骨素和纳米硒双重药理活性，降低了无机硒的毒性，提高其生物利用度的同时结合硫酸软骨素的生物活性，可以更好的将其发展成为预防和改善骨关节病的新型纳米材料。
文档编号A61P9/00GK102145174SQ20111008403
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者张峰, 武世勋, 郭雄, 韩晶, 马玮娟 申请人:西安交通大学