专利名称：一种抗vegf/ang2双特异性抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本专利涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的双特异性单克隆抗体药物。
背景技术：
早在一个多世纪以前，就有文献报道过肿瘤生长伴随着新生血管生成(!^errara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在着某种肿瘤来源的血管生长刺激因子为肿瘤的生长提供血管供应(Ide et al. 1939)。数年后，由于观察到血管密度的增高会先于肿瘤的快速生长，Algire等人认为“肿瘤的快速扩散取决于丰富的血管供给”(Algire et al. 1945)。在上个世纪六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al. 1968)和Ehrmann、Knoth (Ehrmann et al. 1968)两个研究小组的实验相继提供初步证据，证实肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞产生的某些可扩散因子介导。1971年，美国科学家福克曼(Judah Folkman)在《新英格兰医学杂志》中提出， 抗血管生成可能是一种有效的抗癌手段(Folkman 1971)。从七十年代早期开始，以这个前瞻性的假说为基础，福克曼及其研究小组致力于从人体和动物的肿瘤中分离某种‘肿瘤血管生成因子‘(Folkman et al. 1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌症的观点(Gullino 1978)。随后，多种血管源因子(如，表皮生长因子EGF，转化生长因子TGF-α、TGF-β，肿瘤生长因子TNF-α和血管生长素等)先后被发现(Folkman et al. 1987)。血管内皮生长因子(VEGF)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可写作 VEGF-A)是一个血管生成的关键调节因子，对于VEGF基因家族在血管生成调节中所扮演的角色，人们已经深入研究了十多年之久Perrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成员(VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor, P1GF) (Maglione et al. 1991)、 VEGF-B (Olofsson et al. 1996), VEGF-C (Joukov et al. 1996), VEGF-D (Orlandini et al. 1996)。其中VEGF-A是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的血管生长因子。VEGF 有3个高亲合性的酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为VEGFR-I (Flt-I) (Shibuya et al. 1990 ； de Vries et al. 1992)、VEGFR-2 (KDR、Flk-1) (Yoshiji et al. 1996 ；Ellis et al. 1998 ； Tomisawa et al. 1999)和 VEGFR3 (Flt_4) (Joukov et al. 1996)。KDR 是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1 2mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。原位杂交研究已经发现VEGF mRNA在多种人类肿瘤中都有表达，包括肺癌(Volmet al. 1997)、乳腺癌(Yoshiji et al. 1996)、胃肠癌(Ellis et al. 1998)、肾癌(Tomisawa et al. 1999)和卵巢癌(Sowter et al. 1997)。多家实验室使用多种抗VEGF的手段均已实现了肿瘤生长的抑制，这些方法包括针对VEGF或其受体(VEGFRs)的抗体、可溶性受体， VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制剂以及利用VEGF的突变异二聚体封闭其受体结合位点寸。1993年，费拉拉制备了 VEGF的鼠源性抗体，在体外实验中，鼠源性抗体可以显著抑制数种人类癌细胞系的生长。从此，VEGF抗体的临床应用价值开始显露。为了降低鼠源性抗体的免疫原性，费拉拉将鼠源抗体的骨架换做了人源抗体IgGl的部分，由此诞生了基因泰克公司“重磅炸弹级”药物一贝伐单抗(Avastin)。它是一种抗VEGF的人源化抗体(IgGl)，93 %的人源结构域和7 %的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004年2月美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准该药用于治疗转移性结肠癌(mCRC)、小细胞分子肺癌(GBM)和转移性肾癌。阿瓦斯汀区别于已有抗癌药物，以VEGF为药物靶点，加之抗体的特异性结合能力，使其临床疗效显著。在人体试验中，即使对于晚期的癌症患者，注射阿瓦斯汀也可延长寿命数月。2007年ASCO会议Souglakos报道Avastin联合靶向EGFR的单克隆抗体 Cetuximab (西妥昔单抗)可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。基因泰克公司正在用Avastin对超过40种癌症进行适应症研究，希望可以生产出更多的单抗延伸产品。同时，他们也在研究将全抗体分子IgG切割之后，先将蛋白用原核细胞表达，然后再将其通过基因工程的手段连接为IgG。除了癌症外，VEGF也是治疗包括老年性黄斑变性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为了治疗这些疾病，在Avastin的基础上，基因泰克公司又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此成就另一药物一Avastin的孪生姊妹兰尼单抗(Lucentis)。 2006年，兰尼单抗被美国药监局批准用于治疗老年黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)，很快就成为治疗老年性黄斑变性，糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80%以上的份额。血管生成素2(Ang2)美国科学家福克曼(J.Folkman)在1971年提出，肿瘤的生长与转移依赖于血管的生成(Folkman 1971)。这个观点在随后的几十年中被许多研究所证实。血管生成素 (Angiopoietin, Ang)是第一个被确定的来源于人肿瘤组织具有促进血管生成作用的细胞因子。Ang是一种分泌型单链碱性蛋白，是促血管生成因子中唯一具有核糖核酸酶(foiase) 活性的物质。目前已知的Ang包括四个亚型，Angl, Ang2, Ang3和Ang4，其中Angl和Ang2 与血管的生成关系最为密切，而对Ang2的研究较多(李国灏et al. 2004)。人类Ang2基因位于8号染色体短臂区(8p23. 1)，转录生成的mRNA为1491bp， 编码496个氨基酸组成的蛋白，分子量为75kD。Ang2可与Tie2 (tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain 2)结合，是其天然的配体。Ang2主要由血管内皮细胞合成，通过自分泌作用与自身细胞膜上的Tie2受体特异性结合，可以竞争性抑制由Angl诱导形成的不稳定血管。实验证明，VEGF的存在可以提高Ang2 的表达(Gu et al. 2006)。
Ang2参与多种肿瘤的血管生成，且与肿瘤血管形成的数目、肿瘤的临床分期及预后关系密切。应用Ang2 cDNA转染人结肠癌细胞HD9建立小鼠荷瘤模型，Ahmad等人发现 Ang2转染的肿瘤体积明显变大，肿瘤内血管密度增高，肿瘤细胞增殖指数变高(Ahmad et al. 2001)。Koh等对胃癌病例的研究也发现，组织中Ang2高表达同时伴有血管密度增高、 成熟度下降，患者临床 M分期晚，术后生存率低(Etoh et al.2001)。用Ang2转染的胃癌细胞接种裸鼠，结果发现肿瘤转移率增高，且转染的胃癌细胞在体外VEGF存在的条件下， 能促进人脐静脉内皮细胞分泌更多的金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP) 和尿激酶等蛋白水解酶，这可能与Ang2促进肿瘤生长、转移有关。陈林莺等人的研究表明， Angl可以抑制胃癌组织血管的生成，而Ang2拈抗Angl的功能，对血管生成具有双向调节作用，并呈VEGF依赖性(陈林莺et al.2004)。张真真等人认为，Ang2/Angl的比值是决定胃癌组织血管生成和肿瘤生长的最终因素。当Ang2/Angl > 1时，促进胃癌组织血管生成， 反之则抑制其血管的生成。同时他们推测血管生成素及其受体在胃癌血管生成的调解作用是以Ang2为主导的(张真真et al. 2006)。Ang2在胃癌的发生，发展中起到了重要的作用，可以成为胃癌抗血管治疗的一个潜在靶标。另外，Ang2除了在胃癌肿瘤血管生成中的作用外，其表达还与胶质瘤，结肠癌，前列腺癌和乳腺癌等的侵袭和转移表型有关(Bach et al. 2001，Imanishi et al.2001)。除了以上提到的癌症外，Ang2还与非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织的血管新生和生长有密切的关系。邢丽华等和Takanami应用RT-PCR技术，检测了 NSCLC肿瘤细胞中ANG2 基因的表达水平，他们发现ANG2的mRNA量明显高于作为对照的正常细胞组织(邢丽华et al. 2003, Takanami 2004)。另外，Park等人及萧淑华等人分别用ELISA技术对136例及82 例NSCLC病人血液进行检测，发现相对于对照组，NSCLC病人血液中ANG2和VEGF的浓度明显高于前者(Park et al. 2007，萧淑华et al.2011)。国内张轩斌等人对37例NSCLC病人肿瘤样本进行了免疫组化(ICH)的检测，他们发现NSCLC病人肿瘤标本中ANG2，VEGF以及微血管密度(MVD)均明显高于用于对照的正常组织。因此他们认为Ang-2与非小细胞肺癌的浸润、进展密切相关；其对非小细胞肺癌肿瘤血管生成有促进作用，而且这种作用具有明显的VEGF依赖性(张轩斌et al. 2000) 0在最近发表的一项研究中，Andersen等人也提出了类似的观点。这些研究人员分别应用芯片(microarray)和免疫组化(ICH)的方法对随机抽取的335例NSCLC患者肿瘤样本进行了针对ANG和VEGF-A的检测，他们发现ANG2 和VEGF-A的表达量在肿瘤组织中有明显的增长，且两者的表达量密切相关，存在正相关的关系(Andersen et al.2011)o参考文献Ahmad A S, Lin W, Jung Y D, et al. The effects of angiopoietinl and 2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer [J]. Cancer Res,2001,61(4) 12551259.Algire, G. H. , Chalkley, H. W. , Legallais, F. Y. & Park, H. D. Vascular reactions of normal and malignant tissues in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl Cancer Inst.1945,6,73-85.Andersen S,Donnem T,Al-Shibli K,Al-Saad S,Stenvold H,Busund LT,Bremnes RM. Prognostic Impacts of Angiopoietins in NSCLC Tumor Cells and Stroma VEGF-AImpact Is Strongly Associated with Ang-2. PLoS One. 2011,6 (5) :el9773.Bach F，Uddin FJ, Burke D. Angiopoietins in malignancy [J]. Ear J Surg Oncol, 2007. 33 :7-15.de Vries,C.et al· The fms-like tyrosine kinase，a receptor for vascular endothelial growth factor. Science. 1992,255,989-991.Ehrmann，R. L. & Knoth，M.Choriocarcinoma. Transfilter stimulation of vasoproliferation in the hamster cheek pouch. Studied by light and electron microscopy. J. Natl. Cancer Inst. 1968，41，1329-1341.Ellis, L. M. et al. Vessel counts and vascular endothelial growth factor expression in pancreatic adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 1998,34,337-340.Etoh T，Inoue H，Tanaka S，et al. Angiopoietin2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma-possible in vivo regulation via induction of proteases [J]. Cancer Res，2001，61 (5) :21452153.Ferrara, N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nature Rev.Cancer. 2002，2，795-803.Folkman J. Tumor angiogenesis :therapeutic implication [J]. N Engl J Med, 1971,285(21) :11821186.Folkman, J. & Klagsbrun, Μ. Angiogenic factors. Science. 1987, 235,442-447.Folkman，J.，Merler, E，Abernathy, C. & Williams, G. Isolation of a tumor factor reaponaible for angiogenesis. J. Exp. Med. 1971，133，275-288.Greenblatt，M. & Shubick，P. Tumor angiogenesis :transfilter diffusion studies in the hamster by the transparent chamber technique. J. Natl Cancer Inst. 1968,41,111-124.Gu J，Yamamoto H，Ogawa M，et al. Hypoxiainduced upregulation of angipotietin2 in colorectal cancer[J]. Oncol Rep，2006，15 (4) :779783.Gullino，P. M. Angiogenesis and oncogenesis. J. Natl Cancer Inst. 1978，61， 639-643.Ide，A. G.，Baker，N. H. & Warren，S. L Vascularization of theBrown Pearce rabbit epithelioma transplant as seen in thetransparent ear chamber. Am. J. Roentgenol. 1939，42，891-899.Imanishi Y，Ho B，Jmzynka MJ, et al. Angiopoietin-2 stimulates breast cancer metastaaia through the{alpha}5{beta}t integrin-mediated pathway [J]. Cancer Res，2007. 67 :4254-4263.Joukov, V. et al. A novel vascular endothelial growth factor，VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases. EMBO J. 1996，15，1751.Maglione，D.，Guerriero，V.，Viglietto，G.，Delli-Bovi，P. & Persico， M.G. Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991，88，9267-9271.
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发明内容
发明目的本发明提供抗VEGF-ANG2双特异性抗体，其运用基因工程等技术手段，将识别 VEGF和识别ANG2的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体。技术方案抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端通过(GGGGQ 3连接抗ANG2单链抗体构成。抗VEGF 单克隆抗体由 Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL 禾口 Fc 组成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH 的氨基酸序列表为 SEQ NO. UAnti-VEGF A Fab VL-CL 的氨基酸序列表为SEQ NO. 2、Fc的氨基酸序列表SEQ NO. 3。所述的抗ANG2 单链抗体由 Anti_ANG2 scFv VL 和 Anti_ANG2 scFv VH 通过 (GGGGS) 3连接而成组成；其中Anti-ANG2 scFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO. 4、Anti_ANG2 scFv VH的氨基酸序列表为SEQ NO. 5。抗VEGF/ANG2双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。有益效果1、本专利涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别 ANG2的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。2、本专利涉及的双特异性抗体可以特异性结合VEGF-A和ANG2分子，抑制其刺激新生血管生长的生物学功能。实验表明，该双特异性抗体单独结合VEGF-A或ANG2的能力与抗VEGF-A或抗ANG2单克隆抗体近似，并且其具有很强的同时与这两种抗原结合的能力。 实验表明，同时抑制VEGF-A和ANG2比单独抑制两者中的一种能够更好的抑制肿瘤血管的生长，因此使用该双特异性抗体即能有效的抑制肿瘤组织的生长，又能避免同时使用两种单克隆抗体时用药量的增加，给患者带来的不可预知的风险。
图1.抗VEGF-ANG2双特异性抗体结构示意图。该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗ANG2单链抗体(scFv)构成； 图2.抗VEGF-ANG2双特异性抗体重链表达载体；图3.抗VEGF Fab轻链表达载体；图4.抗VEGF-ANG2双特异性抗体(bsAb)同时结合hVEGF-A和ANG2测试 (Biacore)。第一步，流动相中的bsAb与固定相中的hVEGF-A结合；第二步，hVEGF-A-bsAb 复合物与流动相中的ANG2结合0nM ANG2 (蓝线)，500nM ANG2 (红线)。图5.抗VEGF-ANG2双特异性抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脑血管周细胞(HBVP)生长体外试验A.在2nM VEGF-A存在的条件下，HUVECs中分别加入anti_VEGF mAb (bevacizumab)，anti-VEGF scFv 和 anti-VEGF-PDGFR β bsAb,培养 48 小时；B.在 0. 4nM PDGFR β 存在的条件下，HBVP 中分别加入 anti-PDGFR ^mAb, anti-PDGFR β scFv 和 anti-VEGF-PDGFR 3bsAb。(η = 4);
图6. HUVECs和HBVP共培养，测试抗VEGF-PDGFR β bsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞-周细胞结合的抑制作用A. Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β 和ant i-VEGF-PDGFR β bsAb (同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的 Bevacizumab和anti_VEGF_ANG2 bsAb对新生血管生长的抑制效果。图7.重组双特异性单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达与生产流程图。构建好的表达载体转入细胞后，在96孔板中培养，筛选稳定表达的细胞株。筛选得到的细胞株逐级放大培养，最后在生物反应器中进行大规模生产。
具体实施例方式实施例11.抗VEGF-ANG2双特异性抗体(bsAb)核苷酸序列设计和合成根据该bsAb 重链 VHvegf-CH1vegf-CH2醫-CH3vegf_ (GGGGS) 3_VHANG2- (GGGGS) 3_VLANG2 的氨基酸序列和连接形式设计重链核苷酸序列，并在该序列5’端加入Mc I酶切位点，KOZAK 序列及前导序列，在其3’端加入B10 I酶切位点。设计3个3’端含EcoR I酶切位点的寡核苷酸引物，分别合成重链 VHvegf-CHIvegf, CH2VEGF-CH3VE(;F-(GGGGS)3 和 VHang2-(GGGGS)3-VLang2 片断，应用PCR直接连接法(SDL PCR)合成全长2118bp的bsAb重链基因。根据人抗VEGF-A IgGl轻链氨基酸序列，设计5，端含Not I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，3’端含hi I酶切位点的PCR引物，应用PCR法扩增全长639bp的人抗VEGF-A 轻链基因。2.抗VEGF_ANG2bsAb表达载体的构建将该bsAb重链基因用Me I和Xho I双酶切，将轻链基因用Not I,Psi I双酶切后，用T4连接酶将重链基因连接到经Mc I和B10 I处理的真核表达载体中；将轻链基因连接到经Not I和hi I处理的真核表达载体中。这两个表达载体(包含phoA启动子)接着被转入BL21感受态大肠杆菌菌株。转化后的BL21菌株选取阳性克隆，在含50ug/mL的LB培养基QmL)中于37°C过夜培养。之后菌株转入2L含50ug/mL的CRAP培养基中于30°C培养M小时。菌液3000转常温离心弃上清，所得的大肠杆菌用Qiagen公司的质粒提取试剂盒裂解并提取质粒，获得含重链和轻链的表达载体。3.抗VEGF-ANG2 bsAb的表达和分离纯化纯化后的两个表达载体用电穿孔法共转染FIp-^itmCHO细胞anvitrogen)，在 500ug/ml新霉素(neo)存在的条件下悬浮培养，筛选阳性细胞株。重组抗体用亲和层析法(Protein Α)和分子筛层析分离提纯分子量为200kDa左右的完整双特异性抗体分子。提纯后的各个组分通过SDS-PAGE法鉴定。具体方法1.上样应用ftOtein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体，AKTA explorerlOO进行监测。收集放大培养筛选得到的细胞培养基上清液用0. 02M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释，以lml/min的流速上样。2.洗脱用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为lml/min。然后用0. 02M, pH4. O的柠檬酸缓冲液洗脱抗体。同时用AKTA explorerlOO进行监测，当出现洗脱峰时，取干净的离心管收集。每收集3ml后，立即用1Μ，ρΗ9.0的Tris-HCl缓冲液调整pH值至7.0。实施例2抗原抗体结合测试(ELISA法)1.包被用0. 05M pH9. 0轴碳酸盐包被缓冲液将抗原(hVEGF_A或ANG2)稀释至蛋白质含量为5yg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0. Iml稀释后的抗原，4°C过夜。次曰，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。2.加样加一定稀释的待检抗体(anti-VEGF Fab, anti_ANG2单抗或 anti-VEGF-ANG2 bsAb)0. Iml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育1小时。然后洗涤。 (同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体(羊抗人IgG-gamma):于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度)0. Iml0 37°C孵育0. 5 1小时，洗涤。4.加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. Iml, 37°C 10 30分钟。5.终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ + ”、“-”号表示。也可测0 · D 值在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔0 · D值，若大于规定的阴性对照OD值的2. 1倍，即为阳性。实验结果单独测试bsAb与VEGF或ANG2结合能力时，该双特异性抗体与抗原的结合能力与单一特异性的对应单抗于抗原的结合能力相同(图4，图5)。图6显示，该双特异性抗体能够特异性的同时结合VEGF和ANG2，而单一特异性的bevacizumab或抗ANG2单抗没有这种能力。实施例3抗VEGF-ANG2双特异性抗对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验取生长旺盛期的瘤组织剪切成1. 5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。 使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1 次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF-ANG2双特异性抗，每天1次， 阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式TV = 0.52 XaXb2其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/c(% )，计算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治疗组RTV ；Cetv 阴性对照组RTV表1.抗VEGF-ANG2双特异性抗对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
权利要求
1.抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端通过(GGGGQ 3连接抗ANG2单链抗体构成。
2.根据权利要求1所述的抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于抗VEGF单克隆抗体由Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL禾口Fc组成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH的氨基酸序列表为SEQ NO. UAnti-VEGF A Fab VL-CL的氨基酸序列表为SEQ NO. 2、 Fc的氨基酸序列表SEQ NO. 3。
3.根据权利要求1所述的抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于所述的抗ANG2单链抗体由Anti-ANG2 scFv VL和Anti_ANG2 scFv VH通过(GGGGS) 3连接而成组成；其中 Anti-ANG2 scFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO. 4、Anti_ANG2 scFv VH的氨基酸序列表为 SEQ NO. 5。
4.抗VEGF/ANG2双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血管生成素2(angiopoietin2,ANG2)的双特异性单克隆抗体药物；抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗ANG2单链抗体构成。本发明涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别ANG2的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。
文档编号A61P35/00GK102250247SQ201110160558
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者叶亚东, 朱文华, 滕凌, 潘鹂, 路易斯易格那罗, 霍世元 申请人:常州亚当生物技术有限公司