专利名称：疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及疫苗及其制备方法。
背景技术：
狂犬病是一种人畜共患的病毒性传染病，人一旦被病畜咬伤发病，病死率为100%，及时注射疫苗及预防接种是临床上可有效刺激机体产生抗狂犬病病毒抗体，防治狂犬病的唯一有效手段。目前各国广泛应用的疫苗有以下几种:人二倍体细胞狂犬病疫苗、鸡胚细胞狂犬病疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗和地鼠肾细胞狂犬病疫苗。而目前我国自行生产的疫苗只有VeiO细胞狂犬病疫苗和地鼠肾细胞狂犬病疫苗。鸡胚细胞狂犬病疫苗于1984年在德国研制成功，多年的临床研究结果表明该疫苗具有很高的免疫原性，仅产生轻微的局部和全身反应，且无抗鸡胚细胞蛋白质抗体。该疫苗于1997年通过了美国食品和药品监督管理局的认证，是唯一获得WHO资格预审证书的狂犬病疫苗，目前已在全球40多个国家注册，用来进行狂犬病暴露前和暴露后的预防接种。2003年该疫苗原装进口中国，由于价格原因，目前的市场份额非常有限。但它是国家食品药品监督管理局设定的最高质量标准，以及国内狂犬病疫苗研发的主要方向。然而目前狂犬病疫苗的制备方法仍有待改进
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:目前国内制备人用狂犬病疫苗时采用的贴壁培养系统有转瓶和微载体。转瓶培养是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式，具有结构简单、投资少、技术成熟、容易扩大等优点，但同时也存在着细胞生长密度低、细胞容易脱落导致收获次数减少、转瓶间细胞生长差异大、劳动强度大、占用空间大、能耗高、水耗量大 等缺点。而微载体培养细胞则需要在生物反应器内进行，具有细胞生长密度大、有害代谢产物浓度低、收获期长的优点，但该培养方式的缺点是前期投入大、对人员要求高、剪切力大、放大困难、验证复杂。而细胞工厂做为一种病毒疫苗的培养方式，同时具备了转瓶和生物反应器的部分优点，已用于多种病毒疫苗的培养，但应用于人用狂犬病疫苗未见报道。为此，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，该制备疫苗的方法包括以下步骤:从鸡胚提取成纤维细胞，以便获得鸡胚成纤维细胞悬浮液；将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集病毒的培养液；从所述培养液分离所述经过富集的病毒；对所述病毒进行灭活处理；以及对所述经过灭活的病毒进行纯化，以便获得所述疫苗。由此，根据本发明的方法，可以高效的制备疫苗。根据本发明的实施例，上述制备疫苗的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本发明的一个实施例，所述疫苗为狂犬病疫苗，优选所述病毒为狂犬病Flury-LEP株病毒。由此，根据本发明的实施例的制备疫苗的方法，能够有效地用于生产狂犬病疫苗，降低狂犬病疫苗的生产成本。
根据本发明的一个实施例，所述鸡胚为选自无特定病原体鸡胚，优选所述鸡胚为7-9日龄。由此，可以进一步提高制备疫苗的方法的效率。根据本发明的一个实施例，所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养是在细胞工厂中进行的。由此，可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的具体示例，所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤:将所述鸡胚成纤维细胞悬浮液在细胞工厂中在38摄氏度下培养24小时，再加入含有病毒的细胞维持液在33摄氏度下进行培养。优选所述含有病毒的细胞维持液中病毒的接种比例为1: 500，即500ml维持液接种Iml病毒。根据本发明的另一具体示例，所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤:在所述成纤维细胞悬浮液中加入病毒，以便获得含有病毒的成纤维细胞悬浮液；以及将所述含有病毒的成纤维细胞悬浮液在37摄氏度下培养48小时后，添加维持液并且在35摄氏度进行培养。优选所述含有病毒的细胞维持液中病毒的接种比例为1: 20，即20ml维持液接种Iml病毒。根据本发明的实施例，所述细胞工厂为适于单层细胞培养的培养容器。由此，可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施 例，所述从所述培养液分离所述经过富集的病毒是通过超滤浓缩进行的。优选所述超滤浓缩是使用截留分子量为300KD的超滤膜进行的。由此，可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，所述对所述病毒进行灭活处理是使用β -丙内酯进行的。由此，可以提高对病毒进行灭活的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，所述对所述病毒进行灭活处理是使用1: 2000-4000的β_丙内酷进行的。由此，可以进一步提闻对病毒进行灭活的效率，从而可以进一步提闻制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，在使用β-丙内酯灭活病毒后，进一步包括将经过灭活的病毒置于37摄氏度的水浴中，以便降解所述β-丙内酯。由此，可以净化所得到的灭活病毒，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，使用凝胶层析对所述经过灭活的病毒进行纯化。由此，可以提高净化病毒的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，使用S印harose 4FF凝胶层析进行所述纯化。由此，可以提高净化病毒的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是通过前述任一项所述的方法制备的。由此，根据本发明实施例的疫苗成本低，市场应用前景广泛。根据本发明的具体示例，所述疫苗包含:至少4.0IU的狂犬病Flurrry-LEP株病毒；IOmg人血白蛋白；IOmg明胶；50mg鹿糖；0.135mg磷酸二氢钾；0.809mg磷酸二氢钠；以及8.5mg氯化钠。根据本发明实施例的鸡胚细胞狂犬病疫苗质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定，与国外进口同类疫苗相比具有相同的预防效果。同时，成本较国外进口同类疫苗低廉
MTv ο本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明实施例的用于制备疫苗的方法的流程示意图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下面，参考图1对根据本发明实施例的制备疫苗的方法进行描述。如图1所示，根据本发明实施例的制备疫苗的方法包括:首先，从鸡胚提取成纤维细胞，以便获得鸡胚成纤维细胞悬浮液。根据本发明的实施例，可以用于提取成纤维细胞的鸡胚的类型并不受特别限制，根据本发明的具体示例。可以采用无特定病原体的鸡胚。由此，可以避免鸡胚所引起的疾病。另外，根据本发明的实施例，可以采用7-9日龄的鸡胚用于提取成纤维细胞。发明人惊奇地发现，当采用7-9日龄的鸡胚用于提取成纤维细胞时，可以显著地提高制备疫苗的方法的效率。接 下来，在获得鸡胚纤维细胞悬浮液之后，将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集病毒的培养液。根据本发明的实施例，通过在鸡胚纤维细胞悬浮液中接种病毒来富集病毒的方法，从而可以实现在鸡胚纤维细胞悬浮液中病毒增殖，从而富集病毒的目的。根据本发明的实施例，可以通过首先对鸡胚细胞例如鸡胚纤维细胞进行培养，再接种病毒，从而实现对病毒的富集。也可以首先在鸡胚细胞例如鸡胚纤维细胞中接种病毒，同时进行培养，从而实现对病毒的富集。根据本发明的实施例，可以接种的病毒的类型并不受特别限制。本领域技术人员可以根据制备疫苗的目的来选择所接种病毒的类型。根据本发明的实施例，所述疫苗为狂犬病疫苗，由此，优选所述病毒为狂犬病病毒，最优选Flury-LEP株病毒。发明人惊奇地发现，根据本发明的方法尤其适用于制备狂犬病疫苗。根据本发明的具体示例，可以采用单层感染法制备鸡胚细胞疫苗。即将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤:将所述鸡胚成纤维细胞悬浮液在细胞工厂中在38摄氏度下培养24小时，再加入含有病毒的细胞维持液在33摄氏度下进行培养。优选所述含有病毒的细胞维持液中病毒的接种比例为1: 500 (即500ml维持液接种Iml病毒)。在本文中所使用的术语“细胞工厂”指的是多层结构的能够进行细胞静置培养的容器。根据本发明的具体示例，可以采用适于单层细胞培养的培养容器。本领域技术人员可以在市场上获得这些可以适用的细胞工厂。例如，可以采用美国CORNING公司出品的CellSTACK 10 层(636cm2/层)或者美国 CORNING 公司出品的 Cell STACK 40 层(636cm2/层)。根据本发明另一具体示例，可以采用混合接种感染法制备鸡胚细胞疫苗。即将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤:在所述成纤维细胞悬浮液中加入病毒，以便获得含有病毒的成纤维细胞悬浮液；以及将所述含有病毒的成纤维细胞悬浮液在37摄氏度下培养48小时后，添加维持液并且在35摄氏度进行培养。优选所述含有病毒的细胞维持液中病毒的接种比例为1: 20，即20ml维持液接种Iml病毒。根据该具体示例，也可以在细胞工厂中完成上述培养。在本文中，所使用术语“维持液”应作广义理解，只要其能够实现为病毒增殖提供适宜的营养物质，维持病毒培养过程作用的目的即可。根据本发明的实施例，可以通过更换维持液，多次收获增殖的病毒，从而显著地提高了制备疫苗的效率。另外，发明人惊奇地发现，通过采用细胞工厂，尤其是美国CORNING公司出品的Cell STACK 10层(636cm2/层)或者美国CORNING公司出品的Cell STACK 40层(636cm2/层)，可以显著地提高制备疫苗的效率。因为，在细胞工厂中，尤其是上述培养容器中，细胞生长更接近自然状态，可形成均一的细胞单层；由于细胞工厂使用材料对细胞的影响非常小，细胞的活力更强，病毒在细胞内生长更快，感染细胞率明显提高；细胞工厂与转瓶和反应器相比，采用静置培养，无剪切力，细胞不容易脱落，病毒收获期长，收获次数多；细胞与外界接触的机会更少，认为污染的几率更低；此外，还有体积小，节省空间，放大容易，工艺可控性好，对人员要求不高等优点。接下来，在获得富集病毒的培养液之后，从所述培养液分离所述经过富集的病毒。根据本发明的实施例，分离病毒的方法，并不受特别限制。根据本发明的具体示例，从所述培养液分离所述经过富集的病毒是通过超滤浓缩进行的。优选所述超滤浓缩是使用截留分子量为300KD的超滤膜进行的。由此，可以有效实现分离病毒，同时对病毒并不造成不利影响，因而可以进一步提高制备疫苗的效率。接下来，在分离病毒后，对所述病毒进行灭活处理。根据本发明的实施例，对病毒进行灭活的方式并不受到特别限制。在本文中所使用的术语“灭活”应作广义理解，其包括减毒处理，即与野生型的致病性病毒例如狂犬病毒相比，其在动物中的致病性得到减弱。根据本发明的一些实施例，可以使用β_丙内酯对所述病毒进行灭活处理。由此，可以提高对病毒进行灭活的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率，并且β -丙内酯容易通过简单处理例如加热可以被降解。优选地，对所述病毒进行灭活处理是使用1: 2000-4000的β-丙内酯进行的。由此，可以进一步提高对病毒进行灭活的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。 由此，在使用β_丙内酯对病毒进行灭活后，可以进一步包括将经过灭活的病毒置于37摄氏度的水浴中，以便降解所述β-丙内酯。由此，可以净化所得到的灭活病毒，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。最后，对所述经过灭活的病毒进行纯化，以便获得所述疫苗。根据本发明的实施例，使用凝胶层析对所述经过灭活的病毒进行纯化。由此，可以提高净化病毒的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。根据本发明的一个实施例，使用Sepharose 4FF凝胶层析进行所述纯化。由此，可以提高净化病毒的效率，从而可以进一步提高制备疫苗的效率。利用上述根据本发明实施例的方法制备疫苗，可以有效地制备狂犬病疫苗。并且至少具有下列优点之一:通过在细胞工厂中进行培养，细胞生长更接近自然状态，可形成均一的细胞单层；由于细胞工厂使用材料对细胞的影响非常小，细胞的活力更强，病毒在细胞内生长更快，感染细胞率明显提高；收获次数多；细胞与外界接触的机会更少，认为污染的几率更低；以及
可以使用多层培养容器，实现体积小，节省空间，放大容易，工艺可控性好，对人员要求不高； 另外通过简单处理，可以对细胞工厂进行重复利用。根据本发明的第二方面，本发明提供了可以利用上述方法制备的疫苗。该疫苗具有上述制备方法的全部优点，在此不再赘述。根据本发明的一个实施例，疫苗为狂犬病疫苗，其含有至少4.0IU的狂犬病Flurrry-LEP株病毒；10mg人血白蛋白；10mg明胶；50mg鹿糖；0.135mg磷酸二氢钾；0.809mg磷酸二氢钠；以及8.5mg氯化钠。根据本发明实施例的鸡胚细胞狂犬病疫苗质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定，与国外进口同类疫苗相比具有相同的预防效果。同时，成本较国外进口同类疫苗低廉。根据本发明的实施例，狂犬病疫苗的形式不受特别限制，根据本发明的实施例，可以采用冻干形式的狂犬病疫苗。为了方便理解，下面提供具体的实施例以对本发明进行说明。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是为了以任何方式限制本发明的范围。需要说明的是，在下列实施例中所采用的材料均为市售可得的常规产品。实施例1选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 10层(636Gm2/层)，采用单层感染法制备鸡胚细胞狂犬病疫苗的制备工艺。主要步骤如下:I)制备鸡胚成纤维细胞悬浮液选择7日龄发育良好的无特定病原体(SPF)鸡胚，先用4%碘酒消毒气室部位，再用75%酒精脱碘，无菌取出鸡胚，用PBS缓冲液洗涤胚体，用无菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用PBS缓冲液洗涤3次后，按每胚4ml的比例加入0.25%的胰酶，38°C消化30min后，弃去胰酶，用PBS缓冲液洗涤3次，加入含10%小牛血清的MEM细胞生长液，分散细胞，静置后用100目无菌筛网过滤，再次加入细胞生长液，反复分散细胞，确认组织块被分散成单个细胞。按每个鸡胚加入IOOml的细胞生长液，制成每毫升含活细胞数80万的鸡胚成纤维细胞悬浮液，混合均匀后备用。2)接种及更换维持液将制备的鸡胚成纤维细胞悬浮液分装在细胞工厂中，每层200ml，盖好进液口盖，放38 °C的温室内静置培养。培养24h后弃去细胞生长液，加入含有比例为I: 500Flury-LEP株病毒的含1%人血白蛋白MEM细胞维持液(GIBC041500-034)，将维持液分匀拧紧瓶口，放入33 °C温室培养。3)收获培养7d，收获，收集上清液。每隔3d收获一次，收获9次。4)浓缩、灭活收获的病毒液采用截留分子量为300KD超滤膜(PALL OS 300C10)进行超滤浓缩；I: 4000β-丙内酯4°C灭活病毒24h，将灭活后病毒置37°C水浴中彻底降解β-丙内酯。5)纯化灭活后病毒采用S印harose 4FF(GE17-0149-05)凝胶层析纯化，收集样品待用。6)配制、分装和冻干将步骤5中待用样品，按组分依次加入终浓度为10mg/ml人血白蛋白、10mg/ml明胶、以及50mg/ml鹿糖, 充分混合配制成半成品，半成品按Iml装量分装到2ml西林瓶中，半加塞，放入冻干机中冻干为疫苗成品。7)清洗细胞工厂细胞工厂内按每层25ml加入0.1 %胰酶，使胰酶溶液与每层细胞充分接触，保持lOmin，使细胞全部脱落，弃去胰酶溶液。用消毒纯化水反复清洗细胞工厂4次，包装好，进行钴源照射后重复使用。实施例2选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 40层(636cm2/层)，采用混合接种感染法制备鸡胚细胞狂犬病疫苗的制备工艺。主要步骤如下:1)制备鸡胚成纤维细胞悬浮液:选择9日龄发育良好的无特定病原体(SPF)鸡胚，先用4%碘酒消毒气室部位，再用75%酒精脱碘，无菌取出鸡胚，用PBS缓冲液洗涤胚体，用无菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用PBS缓冲液洗涤3次后，按每胚6ml的比例加入0.25%的胰酶，38°C消化40min后，弃去胰酶，用PBS缓冲液洗涤3次，加入含5%小牛血清的MEM细胞生长液，分散细胞，静置后用100目无菌筛网过滤，再次加入细胞生长液，反复分散细胞，确认组织块被分散成单个细胞。按每个鸡胚加入80ml的细胞生长液，制成每毫升含活细胞数120万的鸡胚成纤维细胞悬浮液，混合均勻后备用。2)接种及更换维持液往制备的鸡胚成纤维细胞悬浮液中，按1: 20的比例加入Flury-LEP株病毒，分装在细胞工厂中，每层150ml，盖好进液口盖，放37°C的温室内静置培养。培养48h后，弃去细胞生长液，加入含0.3%人血白蛋白MEM细胞维持液，将维持液分匀拧紧瓶口，放入35°C温室静置培养。3)收获培养5d，收获，收集上清液。每隔3d收获一次，收获5次。4)浓缩、灭活收获的病毒液采用截留分子量为1000KD超滤膜进行超滤浓缩；1: 2000 β -丙内酯4°C灭活病毒24h，将灭活后病毒置37°C水浴中彻底降解β -丙内酯。5)纯化灭活后病毒采用Sepharose 4FF凝胶层析纯化,收集样品待用。6)配制、分装和冻干将步骤5中待用样品按组分配制成半成品，分装冻干。7)清洗细胞工厂细胞工厂内按每层50ml加入0.1 %胰酶，使胰酶溶液与每层细胞充分接触，保持5min，使细胞全部脱落，弃去胰酶溶液。用消毒纯化水反复清洗细胞工厂3次，包装好，进行钴源照射后重复使用。实施例3对实施例1和实施例2生产的鸡胚狂犬病疫苗进行检定，并与国外厂家生产的鸡胚狂犬病疫苗比较。疫苗抗原含量采用抗体中和法，其他检测项目检定方法及标准见中华人民共和国药典三部。各项检定结果见下表。
权利要求
1.一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从鸡胚提取成纤维细胞，以便获得鸡胚成纤维细胞悬浮液； 将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集病毒的培养液； 从所述培养液分离所述经过富集的病毒； 对所述病毒进行灭活处理；以及 对所述经过灭活的病毒进行纯化，以便获得所述疫苗， 其中， 优选所述疫苗为狂犬病疫苗，更优选所述病毒为狂犬病Flury-LEP株病毒， 优选所述鸡胚为选自无特定病原体鸡胚，更优选所述鸡胚为7-9日龄， 优选所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养是在细胞工厂中进行的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤: 将所述鸡胚成纤维细胞悬浮液在细胞工厂中在38摄氏度下培养24小时，再加入含有病毒的细胞维持液在33摄氏度下进行培养，优选所述细胞工厂为适于单层细胞培养的培养容器， 其中， 优选所述含有病毒的细胞维持`液`中病毒的接种比例为1: 500。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中培养进一步包括以下步骤: 在所述成纤维细胞悬浮液中加入病毒，以便获得含有病毒的成纤维细胞悬浮液；以及将所述含有病毒的成纤维细胞悬浮液在37摄氏度下培养48小时后，添加维持液并且在35摄氏度进行培养， 其中，优选所述细胞工厂为适于单层细胞培养的培养容器。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从所述培养液分离所述经过富集的病毒是通过超滤浓缩进行的， 其中，优选所述超滤浓缩是使用截留分子量为300KD的超滤膜进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述病毒进行灭活处理是使用β -丙内酯进行的，优选使用1: 2000-4000的β -丙内酯进行的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在使用β-丙内酯灭活病毒后，进一步包括将经过灭活的病毒置于37摄氏度的水浴中，以便降解所述β -丙内酯。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用凝胶层析对所述经过灭活的病毒进行纯化，优选使用Sepharose 4FF凝胶层析进行所述纯化。
8.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗是通过权利要求1-17任一项所述的方法制备的。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含: 至少4.0IU的狂犬病Flurrry-LEP株病毒； IOmg人血白蛋白； IOmg明胶； 50mg鹿糖； ` 0.135mg磷酸二氢钾；.0.809mg磷酸二氢钠；以及 .8.5mg氯化钠。
10.根据权 利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗呈冻干状态。
全文摘要
本发明公开了疫苗及其制备方法。其中，制备疫苗的方法，包括以下步骤从鸡胚提取成纤维细胞，以便获得鸡胚成纤维细胞悬浮液；将病毒在所述成纤维细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集病毒的培养液；从所述培养液分离所述经过富集的病毒；对所述病毒进行灭活处理；以及对所述经过灭活的病毒进行纯化，以便获得所述疫苗。根据本发明的方法，可以高效地制备疫苗。
文档编号A61P31/14GK103100083SQ201110355998
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者熊炜, 高杨, 刘俊生 申请人:北京佰康安生物科技有限公司