专利名称：人类细胞因子ccdc134的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人类细胞因子的应用，具体地涉及人类细胞因子CCDC134的基因或该基因所编码的蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。
背景技术：
中国专利文献公开号CN101190944A(此处并入为本发明的参考文献)公开了一种人类新细胞因子及其用途，其中公开了人类细胞因子NS128(即人类细胞因子CCDC134 (Coiled-Coil Domain Containing 134))基因的核苷酸序列 SEQ ID N0.1 及该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列SEQ ID N0.2。该(XDC134在NCBI中对应的mRNA和蛋白质的记录号分别为NM_024821和NP_079097。人类细胞因子CCDC134(Coiled-Coil Domain Containing 134)是本发明人 2008年在国际上首先报道的具有功能活性的新分子。在前期工作中，已证实(XDC134是一个经典分泌蛋白，在MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)信号通路的转录调节中发挥重要负向调控作用(Huang J，et al.Cell Mol Life Sc1.2008.65(2):338-349) ；CCDC134 X可作为一个核蛋白，与其相互作用蛋白hADA2a(human Transcriptional Adaptor 2a)共同组成核蛋白复合物，发挥对p53基因转录活性的调节作用(Huang J,et al.Chinese SciBull.February, 2011.Vol.56.N0.4-5:397-405)。该基因在哺乳动物中进化保守，与已知的人类基因或蛋白没有同源性，编码229个氨基酸，蛋白分子量为26kDa，具有糖基化修饰位点，人与小鼠氨基酸序列同源性为89 %，而去掉信号肽的分泌形式，二者的氨基酸序列同源性更高达95%。(XDC134基因在多种正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个分泌蛋白(Huang J，et a`l.Cell Mol Life Sc1.2008.65(2):338-349)。前期在免疫系统中的研究结果(黄晶，北京大学博士研究生学位论文，2008年4月)表明:CCDC134在多种免疫细胞中存在表达，实时定量PCR的结果显示CCDC134在T细胞多个亚群中均有表达并且丰度不同，另外，在刺激活化的人外周血淋巴细胞(PBL)中，(XDC134表达和分泌增加，同样在用PHA刺激活化的人⑶8+T淋巴细胞中，(XDC134的表达也呈上升趋势；DC细胞活化和成熟时(XDC134表达上调，而B细胞活化时CCDC134表达下调(参考CNlOl 190944A)。细胞因子是由多种细胞所分泌的能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称。免疫系统细胞的增殖、分化和功能都受到一系列细胞因子的调节。我们知道细胞因子一般是小分子量的分泌蛋白，多数为多肽或糖蛋白，它们的来源广谱并且主要在免疫系统或造血系统中表达，另外，在静息状态下表达量低，细胞活化后表达量明显增加。CCDC134与细胞因子的许多共性相符，我们推测CCDC134可能为一个潜在的细胞因子，在免疫系统中发挥着重要作用。另外，(XDC134在正常组织，肿瘤组织中表达量有差别(参考CN101190944A)，提示(XDC134可能与肿瘤的发生，发展有关。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要途径，是一个由多种免疫细胞和细胞因子参与的复杂过程。而细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是体内特异性杀伤肿瘤最主要的免疫活性细胞。CTL诱导细胞凋亡的主要机制为由fas介导的细胞凋亡及由穿孔素(perforin)/颗粒酶(granzyme)介导的细胞凋亡过程。效应细胞对肿瘤细胞的杀伤过程为:首先CTL表面T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别APC表面分子MHC-递呈的抗原肽，CTL被激活；接着活化的CTL的表面T细胞受体识别靶细胞表面的抗原肽一MHC-1类分子复合物，将细胞凋亡信息传递给靶细胞；凋亡信息的传入使细胞凋亡效应分子被激活，随即靶细胞将出现染色质浓缩、DNA降解、细胞崩溃，从而实现对靶细胞的杀伤。CTL细胞还可以通过活化后产生大量细胞因子，如TNF-a、IFN-Y、IL_2等干扰肿瘤细胞信号传导蛋白C途径和酪氨酸途径，直接诱导肿瘤细胞进入凋亡程序。CTL还可通过非细胞毒机制影响肿瘤细胞的生长，这主要和不同CTL亚群的细胞因子分泌类型及表达不同膜表面分子密切相关。不同的CTL亚群分泌的细胞因子通过影响临近淋巴细胞表面黏附分子、趋化性细胞因子受体和其他细胞表面分子的表达而影响其活化、分化和迁移，从而影响抗肿瘤免疫的性质和结果。如IFN-Y、TNF-α和IL-4可调节多种肿瘤细胞表面抗原的表达及生长动力学变化，引起肿瘤细胞免疫原性增强，抑制肿瘤细胞的增殖。TNF-α是迄今发现的抗癌作用最强的细胞因子，TNF-α可以直接杀伤肿瘤细胞(Old LJ.Science, 1985, 230:630-632 ；Lejeune FJ, et al.Curr Opin Immunol, 1998,10:573-580),能促进细胞内游离 Ca2+浓度升高，激活Ca2+依赖性核酸内切酶，引起DNA片段化和细胞凋亡。另外，TNF-α还能够阻滞细胞周期(cell cycle arrest) (Pusztai L, et al.Br JCancer, 1993,67:290-296 ；Hu X，et al.J Bio Chem，2002，277:16528-16537)以及诱导肿瘤细胞凋亡(Fukui T，et al.SurgToday，2003，33:847-853 ;Cullinan AE, et al.Mol Vis，2004，10:315-322)。 IFN-y 是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的多功能细胞因子，尤其以抗癌和免疫调节作用最引人注目，可使肿瘤细胞溶解，直接抑制或杀死癌细胞，其抗肿瘤机制是通过受体影响肿瘤细胞基因表达，抑制肿瘤细胞分裂，并可协同TNF杀伤肿瘤细胞，通过TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-1nducing ligand, TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡(Shin EC,et al.1nt J Ca ncer，2001，93:262-268 ；Abadie A, et al.Ann N Y Acad Sci，2003，1010:117-120)。在世界范围内，恶性肿瘤是危害人类生命健康的最严重疾病，其发病率和死亡率一直呈上升趋势，目前针对肿瘤手术、放疗、化疗三大常规治疗方法远远不能改变肿瘤治疗的现状，免疫治疗因其安全、有效、无毒副作用等特点，被公认为是21世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的一种治疗手段。而且其适合于多种实体肿瘤，包括肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、脑转移瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤等，有效率达80 %以上。肿瘤的免疫治疗要求效应细胞对肿瘤具有特异性，才能更好的发挥杀伤效能并保持机体内环境的稳定。因此，具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(CTL)成为免疫治疗中常用效应细胞而倍受关注，并且其具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点。但由于肿瘤发生机制尚未完全明了，除少部分肿瘤的免疫原性较强外，绝大部分肿瘤免疫原性极弱，且与正常组织有交叉，给免疫治疗带来很多困难。如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高免疫治疗效果的关键，也是长期以来是众多研究关注的热点。其中，利用基因工程技术生产的重组细胞因子作为CTL等免疫细胞的应答调节剂治疗肿瘤疗效良好，成为新一代的药物。重组细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。鼠EG7细胞是一种淋巴瘤细胞，由来源于C57BL/6 (H_2b)的淋巴瘤细胞EL4稳定转染OVA衍生而来。EG7细胞组成性合成和分泌0VA，用该细胞免疫小鼠可诱导针对0VA257_264这个短肽的特异性CTL的产生，它是在小鼠中研究MHC-1限制性的抗原特异性CTL免疫应答最常用的模型。黑色素细胞瘤是临床上常见的恶性肿瘤之一，可发生于皮肤及肛周，手术彻底切除难度较大，且对化疗、放疗等常规治疗方法不敏感，预后极差。近年来研究表明黑色素细胞瘤对免疫治疗敏感。特别值得关注的是，DudleyME等过继回输经体外筛选和培养扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrated lymphocyte, TIL),治疗对化疗及大剂量IL-2耐药的晚期黑色素瘤病人，取得了突破性进展。鼠B16黑色素瘤是发生于C57BL/6小鼠耳根部的一种自发性肿瘤，为弱免疫原性、高恶性、高转移性肿瘤，与发生于人的肿瘤相似，是研究肿瘤免疫、发病机制、抗肿瘤药物筛查中较为理想的动物模型。因此，在已知人类细胞因子(XDC134基因及所编码的蛋白质的基础上，致力于研究人类细胞因子CCDC134的基因及蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用，是本发明人需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是解决人类细胞因子CCDC134的基因或蛋白质在制备治疗肿瘤的药物中的应用的问题。为了达到上述目的，本发明提供了人类细胞因子(XDC134的基因或蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。进一步地，本发明所述的应用，其中所述的肿瘤是淋巴细胞瘤或黑色素细胞瘤。进一步地，本发明所述的应用，其中所述治疗肿瘤是通过免疫系统治疗肿瘤的。本发明的CCDC134作为细胞因子，通过免疫系统发挥抑制肿瘤，进而治疗肿瘤的效果。细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。为了更好地理解本发明，下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1:重组人(XDC134蛋白对人外周血分选获得的⑶8+T淋巴细胞活化分子和效应分子的影响。A为FACS的结果；B为ELISA的结果。图2:mCcdcl34相关生物信息学分析，在免疫细胞中表达情况以及表达纯化。A为信号肽分析；B为人，鼠氨基酸同源性比对，其中，框中为信号肽序列；C为在⑶8+T以及去掉⑶8+T淋巴细胞的脾细胞活化过程中的表达变化情况；D为pcDB-mCcdcl34-cmyc载体示意图以及纯化到的mCcdcl34真核蛋白的鉴定,其中，CC_cmyc为带标签的人CCDC134真核蛋白，mCc-cmyc为带标签的鼠mCcdcl34真核蛋白。图3:小鼠体系中(XDC134对⑶8+T淋巴细胞的作用。
A为小鼠(XDC134真核表达蛋白对小鼠脾脏中分选获得的⑶8+T淋巴细胞活化分子和效应分子的影响为重组人CCDC134蛋白对小鼠脾脏中分选获得的CD8+T淋巴细胞活化分子的影响。图4:重组人(XDC134蛋白对0T_1小鼠的⑶8+T淋巴细胞杀伤活性的影响。其中T-CC代表于99°C加热10分钟灭活后的CCDC134蛋白。图5:C57BL/6小鼠腹腔注射重组人(XDC134蛋白对B16细胞的抑制效应。A为肿瘤体积；B为14天处死小鼠时各组小鼠血清中IFN- Y和IgE的含量。图6:(XDC134转基因小鼠对肿瘤细胞的抑制效应。A为(XDC134转基因小鼠对B16细胞的抑制效应；B为(XDC134转基因小鼠对EG7细胞的抑制效应。WT表示野生型对照组，弱阳性表示(XDC134低拷贝转基因小鼠组，TG表示(XDC134高拷贝转基因小鼠组；(:为14天处死EG7成瘤小鼠时各组小鼠血清中IFN-Y和IgE的含量。图7:(XDC134的肿瘤抑制效应与免疫系统的关系。A为SCID-beige小鼠腹腔注射重组人CCDC134蛋白对B16细胞的抑制效应；B为在体外，重组人(XDC134蛋白对B16和EG7细胞增殖和凋亡的影响，其中显示的是细胞铺板48小时时的凋亡情况。图8:重组人(XDC134蛋白治疗对肿瘤组织中免疫细胞的募集情况。A为B16肿瘤模型的结果；B为EG7肿瘤模型的结果。
具体实施例方式首先为明确CCDC134作为潜在细胞因子在免疫系统中的作用，发明人在体外探讨了重组CCDC134蛋白对不同免疫细胞活化，分化以及效应的影响，发现CCDC134具有促进CD8+T淋巴细胞活化以及增强其效应细胞CTL细胞毒作用的功能。发明人发现(XDC134作为潜在细胞因子，可增强CTL的细胞毒作用，发明人一方面利用EG7淋巴细胞瘤动物模型，确定了在肿瘤细胞抗原性较强的情况下CCDC134的抗肿瘤效应，另一方面，发明人建立了 B16黑色素细胞瘤动物模型，探讨了 CCDC134对自发性肿瘤的作用，以明确其作为细胞因子药物促进CTL功能从而发挥抗肿瘤效应的可能性。一、材料1.1主要材料(除了特别注明外均商购得到)1.1.1实验动物:6 8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠，5周龄雌性SPF级Balb/c小鼠;6 8周龄雌性SCID-beige鼠;0T_1小鼠；CCDC134转基因小鼠。1.1.2细胞系:小鼠黑色素瘤细胞系Β16及小鼠淋巴瘤细胞系EG7。1.2主要试剂(除了特别注明外均商购得到):1.2.1细胞培养试剂:小牛血清(FBS) DMEM, RPMI1640 培养基胰蛋白酶(trypsin),G418二甲基亚砜(DMSO)1.2.2RNA 提取及 RT-PCR 试剂
RT-PCR 二步法试剂盒琼脂糖，TrizolReagentDNA Marker氯仿，异丙醇，乙醇溴化乙啶(EB)引物合成1.2.3ELISA试剂盒及相关试剂人IFN- Y，TNF- α 试剂盒人perforin 试剂盒
鼠IFN- Y，TNF- a，Gran-B 试剂盒鼠IgE试剂盒鼠IgG, IgM 试剂盒H2SO4HRP-羊抗鼠 IgG1.2.4质粒构建试剂pcDNA3.l-Myc-his (_) B 载体pGEM-Teasy T 载体XhoI, HindIIIXL-1BlueDNA琼脂糖回收试剂盒核苷酸序列测定1.2.5FACS抗体及相关试剂抗人CD8，CD25，CD69 抗体抗人IFN- Y , TNF- a , perforin 抗体抗鼠CD8，CD4，TNF- a，CD69 抗体抗鼠⑶25，MHC-1OVA P印tide 抗体抗鼠CD3，B220，NKl.1, νβ 5.1 抗体抗鼠perforin, IFN- Y , Gran-B 抗体相应isotype 对照打孔封闭液1.2.6其他试剂福氏不完全佐剂；PEG(MW.4000) ;IRDye 偶联的所有二抗；proteinG，Percoll ;淋巴细胞分离液；人，鼠⑶8+T淋巴细胞磁珠分选试剂盒；BFA，DNA酶I ;抗人⑶3抗体(0KT3)，抗人CD28抗体(15E8)，抗鼠CD3抗体(0KT3)，抗鼠CD28抗体(15E8);非放射性细胞毒作用检测试剂盒；胶原酶I ;rhIL-2。OVA257^264短肽由杭州中肽公司合成。重组人类(XDC134蛋白由本实验室表达纯化(参考CNlOl 190944A)或委托中美冠科生物有限公司合成(见实施例1)，小鼠mCcdcl34真核表达蛋白由本实验室表达纯化(见实施例2),内毒素均小于lEU/mg。
1.3主要仪器与器材
权利要求
1.人类细胞因子CCDC134的基因或蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤是淋巴细胞瘤或黑色素细胞瘤。
3.根据权利要求1或2所述的应`用，其中所述治疗肿瘤是通过免疫系统治疗肿瘤的。
全文摘要
本发明公开了人类细胞因子CCDC134的基因或该基因所编码的蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。本发明的CCDC134作为细胞因子，通过免疫系统发挥抑制肿瘤，进而治疗肿瘤的效果。细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。
文档编号A61P35/00GK103100092SQ20111035573
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者黄晶, 肖 琳, 邱晓彦, 邵文威, 廖沁园, 巩晓婷 申请人:北京大学