抗csf-1r抗体的制作方法

专利名称：抗csf-1r抗体的制作方法
抗CSF-1R抗体本申请要求于2010年4月I日提交的美国临时申请号61/319,896的权益。本申请涉及免疫学和癌症治疗的领域。更具体而言，本申请涉及结合人集落刺激因子-I受体(CSF-IR)的人抗体。集落刺激因子-I受体(CSF-IR)也被称为M-CSFR或CD-115，(人CSF-1R变体；SEQID NO :15)(人 CSF-IR ;SEQ ID NO :16 ;Uniprot 登录号 #P07333)，由 c_fms 基因编码，是在正常个体的巨噬细胞和粒细胞谱系上和癌症的肿瘤细胞上选择性表达的酪氨酸激酶受体。有两类已知的配体集落刺激因子-I (CSF-I)(人CSF-I ；SEQ ID NO :17) (Uniprot登录号#P09603)，也被称为M-CSF;和结合CSF-IR的细胞外结构域的IL-34(人IL-34 ；SEQ ID NO: 18) (Uniprot登录号#Q6ZMJ4)。CSF-I或IL-34结合时，CSF-IR 二聚化，诱导受体的转磷酸作用(trans-phosphorylation)和下游信号传递分子(例如MAPK和Akt)的活化。CSF-1R的磷酸化诱导(I)从造血祖先干细胞增殖和分化巨噬细胞，和(2)巨噬细胞在体内多个器官和组织(特别地肿瘤基质)的存活和迁移。CSF-IR还可以在肿瘤细胞表面表达。小鼠CSF-IR的抗体在人体内没有交叉反应，因此对于治疗人的癌症是无效疗法。PCT公开W02009/026303 (Brasel等人)中公开了 CSF-1R的人抗体。此类抗体不诱导针对被抗体结合的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。当抗体与表达抗原的细胞(靶细胞)结合，使抗体的Fe区可用于结合天然杀伤细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞(效应子细胞)上的Fe受体时，发生ADCC。Brasel中公开的抗体不能使靶细胞和效应子细胞结合以起始对靶细胞的杀伤。配体的抗体不是交叉反应性的。因此，CSF-I的抗体不抑制IL-34与CSF-IR结合，并且IL-34的抗体不抑制CSF-I与CSF-IR结合。配体与受体的结合可影响癌生长。此外，配体的抗体不内在化，也不诱导CSF-IR降解，也不刺激针对细胞的ADCC活性。需要这样的多功能抗体，其阻断配体与CSF-IR结合并且还诱导针对被抗体结合的细胞的ADCC活性。本发明的抗体比已知的抗体有利，因为本发明的抗体具有多种功能。本发明的抗体阻断CSF-I和IL-34与受体结合，从而阻止受体二聚化及由此导致的细胞内酪氨酸残基的磷酸化，这是阻止巨噬细胞诱导的肿瘤生长的关键功能。本发明的抗体内在化并诱导CSF-IR降解。重要的是，除阻断配体结合外，本发明的抗体通过刺激对肿瘤细胞和肿瘤相关性巨噬细胞和单核细胞的杀伤，来增强ADCC活性。本发明的抗体还同时影响在肿瘤发展中发挥重要作用的巨噬细胞活性。因为本发明抗体所具有的多种治疗功能，其相比本领域已知的抗体具有显著的优势。发明概述本发明的一个方面是特异性结合人CSF-IR变体(SEQ ID NO :15)的抗体或其片段，其包含含有序列 SYGMH (SEQ ID NO: I)的 CDRH1，含有序列 VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ IDNO 2)的CDRH2，含有序列⑶YEVDYGMDV(SEQ ID NO 3)的CDRH3，含有序列RASQGISNALA(SEQID NO 4)的 CDRLl，含有序列 DASSLES (SEQID NO 5)的 CDRL2，和含有序列 QQFNSYPWT (SEQID N06)的CDRL3。本发明的另一个方面是特异性结合人CSF-1R(SEQ ID NO. 16)的抗体或其片段，其包含含有序列SYGMH (SEQ ID NO: I)的CDRH1，含有序列VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQID NO 2)的 CDRH2，含有序列⑶YEVDYGMDV(SEQ ID NO 3)的 CDRH3，含有序列RASQGISNALA (SEQ ID NO 4)的 CDRLl，含有序列 DASSLES (SEQ ID NO 5)的 CDRL2，含有序列QQFNSYPWT (SEQ ID NO 6)的CDRL3。本发明的一个方面是特异性结合人CSF_1R(SEQID NO :15)的抗体或其片段，其包含含有序列SYGMH(SEQ ID NO 1)的CDRH1，含有序列VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 2)的 CDRH2，含有序列⑶YEVDYGMDV (SEQ ID NO 3)的CDRH3，含有序列 RASQGISNALA(SEQ ID NO 4)的 CDRLl，含有序列 DASSLES (SEQ ID NO 5)的⑶RL2，含有序列QQFNSYPWT (SEQ ID NO 6)的⑶RL3。本发明的抗体可还在所述⑶R序列之一中包含氨基酸替换。在另一个方面，上述CDR的CDR序列之一中不具有氨基酸替换。本发明的另一个方面是结合CSF-1R，并且包含含有下述氨基酸序列的VH QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS(SEQ ID NO 7),
或含有下述氨基酸序列的VL AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 8).的抗体或其片段。本发明的另一个方面是结合CSF-1R，并且包含含有SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重链的抗体或其片段。在本发明的另一个方面，抗体包含每条含有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的两条轻链，和每条含有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的两条重链。此类抗体的CSF-IR结合片段也是本发明的一部分。本发明还提供了编码上述抗体或其片段的分离的DNA和多核苷酸/多核酸，包含所述多核苷酸的表达载体，和包含所述多核苷酸的宿主细胞。本发明进一步提供了纯化抗 体或其片段的方法。本发明还提供了只包含本发明的抗体或其片段、多核苷酸、载体或宿主细胞或具有可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明提供了包含本发明的抗体或其片段连同可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。此外，本发明涉及通过施用有效量的抗体，抑制哺乳动物的癌细胞生长的方法，和治疗白血病、乳腺癌和前列腺癌的方法。本发明的另一个方面涉及通过施用有效量的抗体，抑制哺乳动物的癌细胞生长的方法，和治疗白血病、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌的方法。本发明的另一个方面涉及抑制癌细胞生长的方法，和治疗白血病、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌以及卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌、多发性骨髓瘤和霍奇金氏淋巴瘤的方法。本发明的抗体可用于治疗瘤性疾病，包括实体肿瘤，和用于治疗乳腺癌和前列腺癌。在另一个方面，本发明的抗体可用于治疗瘤性疾病，包括实体肿瘤，和用于治疗乳腺癌、子宫内膜癌，和前列腺癌。在另一个方面，本发明的抗体可用于治疗瘤性疾病，包括实体肿瘤，和用于治疗乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌和肾癌。本发明的一个方面是抗体或其片段，其用于疗法，或用于治疗或用于作为药物。在另一个方面，上述抗体或其片段用于治疗癌症。本发明可用于治疗包括但不限于白血病、乳腺癌和前列腺癌的癌症。在一个方面，本发明可用于治疗包括但不限于白血病、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌的癌症。在另一个方面，本发明可用于治疗包括但不限于白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌、多发性骨髓瘤和霍奇金氏淋巴瘤的癌症。本发明还包括本发明的抗体或其片段，其用于治疗癌症，包括提供或施用有效量的另一种抗癌治疗，其中所述抗癌治疗包括但不限于抗血管发生剂、化疗剂或抗瘤剂。进一步的，抗瘤剂包括但不限于多西他赛、紫杉醇、赫赛汀⑩和多柔比星。除本文公开的抗体或片段外，向患者施用抗癌治疗。在开始用其他抗癌治疗或另一种抗瘤剂的疗法之前、过程中、基本同时或之后施用抗体或其片段。本发明还提供了本发明的抗体用于制备治疗癌症的药物中的用途。在一个方面，癌症是白血病、乳腺癌或前列腺癌。在一个方面，癌症是白血病、乳腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。在本发明的另一个方面，癌症是白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、直肠结肠癌、肝细胞癌、肾癌、多发性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。抗体的用途包括提供或施用有效量的另一种抗癌治疗，其中所述抗癌治疗包括但不限于抗血管发生剂、化疗剂或抗瘤剂。进一步的，抗瘤剂包括但不限于多西他赛、紫杉醇、赫赛汀馨和多柔比星。抗癌治疗是在除本文公开的抗体或片段外向患者施用。抗体或其片段是在开始用另一种抗癌治疗或另一种 抗瘤剂的疗法之前、过程中、基本同时或之后施用的。本发明还提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括对需要治疗的所述哺乳动物施用有效量的本发明的抗体或其片段。癌症选自白血病、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌。在另一个方面，癌症选自白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。此外，方法还可包括对所述哺乳动物施用另一种抗癌治疗。抗癌治疗选自抗血管发生剂、化疗剂，和抗瘤剂。抗瘤剂可选自多西他赛、紫杉醇、赫赛汀 和多柔比星。本发明进一步提供了使用抗体或组合物治疗需要治疗的哺乳动物的方法，例如，以抑制血管发生或骨转移，或者以抑制肿瘤或过度增殖性生长或以治疗炎性疾病。本发明进一步提供了抗体或组合物，其用于治疗需要治疗的哺乳动物，例如，以抑制血管发生或骨转移，或者抑制肿瘤或过度增殖性生长，或炎性疾病。本发明还涉及含有本文公开的抗体或其片段的产品或药物组合物。此外，所述产品或药物组合物还可以包括在疗法中同时、分别或顺序地与本文公开的抗体组合给予的额外的药剂、抗瘤剂或抗癌剂或治疗，包括但不限于多西他赛、紫杉醇、赫赛汀 和多柔比星。如果癌症在肿瘤相关性巨噬细胞的表面表达CSF-1R，本发明提供了使用患者的血液、血清、血浆、肿瘤细胞或循环的肿瘤细胞的样品中的CSF-I水平，作为用本发明的CSF-IR抗体或其片段成功治疗的标志。本发明还提供了治疗患者的癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的CSF-I的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞，和⑵如果CSF-I的水平高于对照群体中发现的CSF-I水平，则对患者施用本发明的抗体或其片段。本发明提供了使用患者的血液、血清、血浆、肿瘤细胞或循环的肿瘤细胞的样品中的IL-34水平，作为用本发明的CSF-IR抗体或其片段成功治疗的标志。本发明还提供了治疗患者的癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的IL-34的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞，和(2)如果IL-34的水平高于对照群体中发现的IL-34水平，则对患者施用本发明的抗体或其片段。
本发明的一个方面是用于确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是本发明的抗体，所述方法包括(I)离体或在体外确定受试者的样品中的CSF-I水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和⑵较之未患癌症的个体中的CSF-I水平，其中CSF-I水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。本发明的另一个方面是用于确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选受试者的方法，其中所述抗体是本发明的抗体，所述方法包括(I)离体或在体外确定受试者的样品中的IL-34水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和⑵较之未患癌症的个体中的IL-34水平，其中IL-34水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。本发明还提供了特异性结合CSF-IR的抗体。抗体具有至少一个选自以下的特性(a)抑制CSF-I或IL-34与CSF-IR的结合；(b)抑制CSF-IR的活化；(c)降低CSF-IR的磷酸化；⑷降低MAPK的活化；(e)降低Akt的活化；(f)减少CSF-IR的量；和(g)诱导ADCC。 本发明的优选实施方案具有特性(a)至(g)。本发明的一个方面是这样的抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合人CSF-IR 变体(SEQ ID NO 15)或人 CSF_1R(SEQ ID NO : 16)，和抑制 CSF-IR 的信号传递、内在化和诱导CSF-IR降解，和刺激针对包括肿瘤、巨噬细胞和单核细胞的多种细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16的区别在于第54位的一个氨基酸，其落在结合区以外。如本文中使用的，术语“抗体”包括包含4条多肽链，由二硫键相互连结的两条重链(H)和两条轻链(L)的免疫球蛋白分子。单独的链可以折叠成具有相似大小(110-125个氨基酸)和结构，但功能不同的结构域。轻链可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VL)和/或一个恒定结构域(本文中缩写为CL)。人抗体(免疫球蛋白)的轻链是kappa (K)轻链或IambdaO )轻链。表述方式VL在本文中意在包括来自K-型轻链的可变区(VK)和来自λ-型轻链的可变区(VA)0重链也可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VH)和/或，根据抗体的类或同种型，3或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)(本文中共同缩写为CH)。在人中，同种型是IgA, IgD, IgE, IgG和IgM, IgA和IgG进一步细分为亚类或亚型(IgAl-2和IgGI-4)。本发明包括任何上述类或亚类的抗体。人IgGl是本发明抗体的优选同种型。在每个VL和VH中发现了被称为高变区或互补决定区(OTR)的3个区，所述区被称为框架(本文中缩写为FR)的较少变化的区支持。根据Kabat惯例将氨基酸分配到特别的CDR区或结构域(Kabat 等人,Ann. NY Acad. Sci. 190 :382-93(1971) ;Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5版,U. S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242 (1991))。每个 VH 和 VL 由 3 个 CDR 和 4 个 FR 组成，按下列顺序从氨基端至羧基端排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由VL和VH结构域组成的抗体部分被称为Fv (可变片段)，并且构成抗原结合位点。单链Fv (scFv)是含有在一条多肽链上的VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中I个结构域的N端和另一个结构域的C端通过柔性接头联接。“分离的抗体”是这样的抗体，其是(I)从组分的混合物中部分、基本或完全纯化的；(2)从其天然环境的组分鉴别和分离和/或回收的；(3)单克隆的；(4)不含有来自相同物种的其他蛋白质；(5)由来自不同物种的细胞表达；或(6)在自然中不存在。如本文中使用，组分排除本发明的抗体。其天然环境中的污染组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性质的或非蛋白质性质的溶质。分离的抗体的实例包括经过亲和纯化的抗体、由杂交瘤或其他细胞系在体外制备的抗体，和源自转基因小鼠的人抗体。如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本均质的抗体群体中获得的抗体，例如包含除可能天然存在的突变或可能存在的较少的翻译后变异外基本相同的群体的单独的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性位点(也称为决定簇或表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇的不同抗体的常规的(多克隆)抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得的，而不被理解为要求通过任何特别的方法生产抗体。如本文中使用的，术语“人抗体”包括具有对应于人生殖系免疫球蛋白序列(如Kabat等人，中所述，见上文)的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人生殖·系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性的诱变或体内的体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中的。人抗体可以在至少一个位置被氨基酸残基(例如，不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的增强活性的氨基酸残基)取代。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”并非意在包括这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的生殖系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。生产本文中使用的“人抗体”的方法并非意在包括在人中生产的抗体。词组“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的、组合的人抗体文库中分离的抗体，从人免疫球蛋白基因的转基因动物中分离的抗体，或通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪切到其他DNA序列的手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。Fe (片段，可结晶区)是由配对的重链恒定结构域组成的抗体部分或片段的名称。例如在IgG抗体中，Fe由重链CH2和CH3结构域组成。IgA或IgM抗体的Fe还包含CH4结构域。Fe与Fe受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或细胞介导的细胞毒性(CMC)的活化相关。对于多个IgG样蛋白的复合物抗体，例如IgA和IgM，复合物形成需要Fe恒定结构域。因此，本发明的抗体包括但不限于分离的抗体、人抗体、人源化抗体、重组人抗体、单克隆抗体、消化片段、及指定的部分和其变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其指定的片段或部分的结构和/或功能的抗体的部分；每个含有至少一个CDR。功能性片段包括结合CSF-IR抗原的抗原结合片段。例如，涵盖在本发明内的能够结合CSF-IR的抗体片段或其部分包括二价片段(例如具有完整的链间二硫键的(Fab' )2)，单价片段例如指由VL-CL和VH-CHl结构域组成的抗体片段，并且不保留重链铰链区的Fab (片段，抗原结合)(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、保留重链铰链区的Fab、Facb (例如，通过纤溶酶消化)、F(ab' )2、缺少二硫键的Fabi ,pFc/ (例如，通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd(例如，通过胃蛋白酶消化，部分还原和再凝聚)和Fv或scFv (例如，通过分子生物学技术)。抗体片段还意在包括例如，结构域缺失的抗体、线性抗体、单链抗体、scFv、单结构域抗体、多价单链抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体，包括特异性结合抗原的双抗体、三链抗体等。铰链区分隔抗体的Fab和Fe部分，提供了 Fab相对彼此和相对于Fe的机动性，以及包括了用于共价连接两条重链的多个二硫键。已经开发了保留结合特异性，但具有其他所需特征的抗体形式，包括例如双特异性、多价(超过2个结合位点)和紧密的大小(例如，仅结合结构域)。本发明的抗体是对于CSF-IR特异的。抗体特异性指抗体选择性识别抗原的特定表位。例如，本发明的抗体可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体(BsAb)是具有2个不同的抗原结合特异性或位点的抗体。当抗体具有多于一种的特异性时，识别的表位可以与单种抗原或多于一种的抗原相关。因此，本发明提供了结合2种不同抗原的双特异性抗体，具有至少一种对于CSF-IR的特异性。如上所述，此类抗体包括其的任何片段。 可以基于亲和性和/或亲和力确定本发明抗体或其片段对CSF-IR的特异性。亲和性用抗原与抗体的解离的平衡常数(Kd)表示，测量在抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度。本发明抗体或其片段与位于细胞外结构域区段(在后文中简称为“结构域”或“ECD”)上的CSF-IR表位结合。术语“表位”在本文中指被本发明的抗体识别的在抗原上的分离的三维位点。表位是复杂抗原上的免疫活性区域，所述区域与B细胞受体实际结合，并被B细胞生产获得的抗体分子实际结合。抗原一般含有至少一个表位，并且通常含有多于一个的表位。蛋白质抗原上的表位可以是线性的或非线性的。线性表位由蛋白质的氨基酸序列中的连续氨基酸残基组成。线性表位可以需要或不需要构象折叠，以形成天然的三维结构并引发产生具有对抗原的结合特异性的抗体的免疫应答。非线性表位由不连续的氨基酸残基组成。因此，非线性表位总是需要一定程度的蛋白质折叠，使必需的氨基酸残基彼此相邻，以形成天然的三维结构并引发产生具有对抗原的结合特异性的抗体的免疫应答。本发明的抗体还包括结合特征被直接突变、亲和力成熟、噬菌体展示或链改组方法改良过的那些抗体。通过突变CDR和/或FW残基和筛选具有所需特征的抗原结合位点，可以修改或改良亲和力和特异性(参见例如，Yang等人，J. Mol. Biol. ,254:392-403(1995))。以多种方式突变CDR。一种方式是随机化单独的残基或残基的组合，使得在否则相同的抗原结合位点的群体中，在特定位置上发现从2至20个氨基酸的子集。备选地，可以通过易错(error prone) PCR方法在一些残基中诱导突变(参见例如，Hawkins等人，J. Mol. Biol. ,226:889-96 (1992))。在另一个实例中，可以在大肠杆菌的突变子菌株中增殖含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体(参见例如，Low等人，J. Mol. Biol. ,250 359-68(1996))。这些诱变的方法是本领域技术人员已知的多种方法的示例。生成替换变体的方便的方式是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，突变若干CDR区位点，以在每个位点生成所有可能的氨基酸替换。将因此生成的抗体变体作为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合体，以单价形式从丝状噬菌体颗粒中展示。然后，按本文公开的，筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如，结合亲和性(KD)、特异性、EC50)。为了鉴别用于修饰的候选CDR区位点，可以实施丙氨酸扫描诱变，来鉴别对抗原结合有显著贡献的CDR区残基。备选地或额外的，可以对一条或多条CDR序列的一个或多个残基位置实施随机诱变，所述CDR是与可变区有效连接的，或者所述CDR不依赖于其他可变区序列，然后，使用重组DNA技术使改变的⑶R回到可变区。一旦生成和表达此类变体抗体，则对变体组施用本文公开的筛选，选择在一个或多个相关测定中具有优秀特性的抗体进行
进一步开发。除本文具体描述的抗体外，可以利用本领域技术人员熟知的多种重组DNA技术容易地设计和制造其他“基本同源的”修饰的抗体。例如，通过若干氨基酸替换、末端和中间添加和缺失等，框架区可以在一级结构的水平与天然序列不同。此外，可以单个地或组合使用多种不同的人框架区，作为本发明的人源化免疫球蛋白的基础。一般而言，基因修饰可以通过多种熟知的技术容易地实现，例如定点诱变。本发明包括编码本文公开的抗CSF-IR抗体重链的核酸序列，所述重链包含任一个VH区或其部分，或任一个VH⑶R，包括其任何变体。本发明还包括编码本文公开的抗CSF-IR抗体轻链的核酸分子，所述轻链包含任一个VL区或其部分，或任一个VL⑶R，包括其任何变体。本发明还包括抗体I的核酸序列，重链和轻链分别是SEQ ID NO 13和14。本 发明的抗体包括这样的抗体，其包含抗体I的相同CDR区，和/或抗体I的相同轻链可变区和/或重链可变区。可以通过本领域已知的方法生产本发明的抗体。这些方法包括由Kohler和Milstein, Nature 256:495-497(1975) ；Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology,第 13 卷(Burdon 等人编著，Elsevier Science Publishers,Amsterdam)in Monoclonal Antibody Technology, The Production andCharacterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell 编著，1984)中描述的免疫学方法；以及通过由Huse等人，Science 246:1275-1281(1989)描述的重组DNA方法。还可以从具有scFv或Fab形式的VH和VL结构域组合的文库中获得抗体。VH和VL结构域可以由合成的、部分合成的或天然来源的核苷酸编码。可以通过具有人抗体片段的噬菌体展示文库制备本发明。人抗体的其他来源是经改造以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。制备抗体的一个实施方案是在转基因动物中表达编码根据本发明的抗体的核酸，所述转基因动物插入了人抗体生产基因组的基本部分，并且使得其是内源性抗体生产缺陷的。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。本发明的抗体是用转基因小鼠生产的。本发明的另一个实施方案包括在例如动物的乳腺中表达抗体编码基因，用于在泌乳的过程中分泌多肽。 生产“人源化”抗体的常见方法是将来自MAb (通过免疫啮齿类宿主生产的)的⑶R序列移植到人Ig骨架上，并将嵌合基因转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，后者转而生产由CHO细胞分泌的功能性抗体。应理解，结合单个结构域抗体的主要决定簇的氨基酸残基可以在Kabat或Chothia定义的⑶R中，但也可以包括其他残基，如，例如否则被包埋在VH-VL异二聚体的VH-VL界面中的残基。用于鉴别本发明的CSF-IR结合抗体的蛋白质优选是CSF-1R，更优选的是CSF-IR的细胞外结构域。CSF-IR细胞外结构域可以是游离的或与另一种分子缀合的。本发明的抗体可以与其他氨基酸残基融合。此类氨基酸残基可以是肽标签，可能是为了促进分离或者IgG Fe部分以优化二聚化。也考虑用于将抗体归巢到特定器官或组织的其他氨基酸残基。
可以通过切割完整抗体或通过表达编码片段的DNA来生产抗体片段。可以通过由 Lamoyi 等人，J. Immunol. Methods 56 :235-243(1983)和由 Parham, J. Immunol. 131 2895-2902(1983)描述的方法制备抗体片段。此类片段可以含有一个或两个Fab片段或F(ab' )2片段。此类片段还可以含有单链片段可变区抗体，即scFv、双抗体或其他抗体片段。生产此类功能等价物的方法公开在欧洲专利申请公开号EP 239，400 (Winter) ;PCT公开WO 89/09622 (Hann等人);欧洲专利申请公开号EP 338，745 (Owens等人);和欧洲专利申请公开号EP 332，424(Beldler等人)中。在本说明书全文中，本发明的术语“抗体”包括其任何片段，不论是否特别地指出。用于载体转化和表达本发明抗体的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如NSO细胞(非分泌型(O)小鼠骨髓瘤细胞)、293、SP20和CHO细胞，和淋巴起源的其他细胞系，如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。可以备选地使用其他的真核宿主，例如酵母。可以通过本领域已知的的任何方法分离或纯化本发明的抗体，包括通过硫酸铵或硫酸钠沉淀，然后通过盐水透析、离子交换层析、亲和或免疫亲和层析以及凝胶过滤或区带电泳。纯化本发明抗体的优选方法是蛋白A亲和层析。 可以通过这样的重组DNA和编码源自人的⑶R的DNA来制备编码人抗体的DNA，所述重组DNA编码基本上或专有地源自相应人抗体区的除⑶R以外的人恒定区和可变区。编码抗体片段的DNA的合适的来源包括任何细胞，例如表达全长抗体的杂交瘤和脾细胞。片段可以自身作为抗体等价物使用，或者可以如上所述重组为等价物。可以通过已知的方法进行本文描述的DNA重组和其他技术。DNA的另一种来源是抗体的噬菌体展示文库，如本领域已知。此外，本发明提供了含有与控制序列(如表达序列、启动子和/或增强子序列)有效连接的前述多核苷酸序列的表达载体。已开发了用于在原核系统(例如细菌)和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中高效合成抗体多肽的多种表达载体。本发明的载体可以包含染色体、非染色体和合成的DNA序列的区段。可以使用任何合适的表达载体。例如,原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒,例如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物例如M13，和其他的丝状单链DNA噬菌体。酵母中有用的载体实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括SV-40、CMV、腺病毒、逆转录病毒来源的DNA序列和源自功能性哺乳动物载体的组合的穿梭载体，例如上文所述，以及功能性质粒和噬菌体DNA的熟知的衍生物。其他的真核载体是本领域已知的(例如，P. J. Southern和P. Berg,J. Mol. Appl.Genet. I :327-41 (1982) ；Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. I :854-64(1981) ；Kaufmann 和Sharp, J. Mol. Biol. 159 :601-21 (1982) ；Scahill 等人，Proc. Nat ' I Acad. Sci. USA80 4654-59(1983) ；Urlaub 和 Chasin, Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 77 :4216-20)(1980)。在本发明中有用的表达载体含有至少一个与待表达的DNA序列或片段有效连接的表达控制序列。控制序列插入到载体中，以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是Iac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖水解启动子(例如，3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子(例如，酵母α交配因子的启动子Pho5)和源自多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿病毒的启动子(例如，SV40的早期或晚期启动子)，和已知控制原核或真核细胞及其病毒或组合的基因表达的其他序列。当需要在酵母中表达基因构建体时，酵母中使用的合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因。trpl基因为缺少在色氨酸中生长的能力的突变体酵母菌株(例如ATCC No. 44076)提供了选择标志物。通过在缺少色氨酸的条件下培养，在酵母宿主细胞基因组中存在trpl损伤则提供了用于检测转化的有效环境。相似的，具有Leu2基因的已知质粒补充了 Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)。本发明还提供了含有前述重组载体的重组宿主细胞。可以在杂交瘤以外的细胞系中表达本发明的抗体。包含编码根据本发明的多肽的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。基于高表达水平、目标蛋白的组成型表达和来自宿主蛋白的最低污染选择特别优选的细胞系。可用于进行表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域普遍已知的，并且包括 许多永生化的细胞系，如但不限于，C0S-7细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾细胞 (BHK)和许多其他细胞系，包括淋巴起源的细胞系，例如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。合适的其他真核细胞包括酵母和其他真菌。有用的原核宿主包括，例如，大肠杆菌，如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus),如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。通过在允许抗体或其片段表达的条件下培养细胞，并从宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化抗体或其片段，这些重组宿主细胞可用于生产抗体或其片段。可以通过将编码信号或分泌型前导肽的序列插入到编码抗体的目标基因的5’端，来促进用于分泌的表达的抗体或片段在重组宿主细胞中的靶向。这些分泌型前导肽元件可以源自原核或真核序列。因此，使用合适的分泌型前导肽，所述前导肽是连接于多肽N端的氨基酸，以指导多肽移动到宿主细胞胞质外并分泌到培养基中。通过本领域已知的方法在液体培养基中培养转化的宿主细胞，所述液体培养基含有可同化的碳源(碳水化合物例如葡萄糖或乳糖)、氮(氨基酸、肽、蛋白质或其降解产物，例如蛋白胨、铵盐等)和无机盐(钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐)。培养基还含有例如生长促进物质，如痕量元素，如铁、锌、猛等。本发明提供了通过向哺乳动物施用有效量的抗体来治疗肿瘤生长的方法。根据本发明治疗的合适条件涉及优选表达CSF-IR的细胞。在并非意在受任何特定的机制约束的同时，本方法提供了对癌细胞生长，包括例如肿瘤生长、骨转移、器官移植排斥或免疫病症(例如受CSF-IR刺激的自身免疫病)中癌细胞生长的治疗。“治疗”在本发明的上下文中指治疗性处理，包括抑制、减慢、减轻或逆转与疾病或病症相关的潜在的病况或不理想的生理改变的进程，改善病况的临床症状，或阻止病况的临床症状的出现。有益的或所需的临床结果包括但不限于减轻症状、消除疾病或病症的程度、稳定疾病或病症(即，其中疾病或病症不恶化)、延迟或减慢疾病或病症的进展、改善或缓和疾病或病症，以及(部分或全部)缓解疾病或病症，不论是可检测的或不可检测的。治疗还可以意指较之不接受治疗的预期的存活而言延长的存活。需要治疗的那些包括已经患病的那些。在一个实施方案中，本发明可用作药剂。在本发明的方法中，将治疗有效量的本发明的抗体施用于需要它的哺乳动物或患者。此外，本发明的药物组合物可包括治疗有效量的本发明的抗CSF-IR抗体。“治疗有效量”或“有效剂量”指以必需的剂量和时间段，有效地实现所需治疗结果的量。抗体的治疗有效量可以依赖于如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力的因素而不同。其他因素包括施药、祀位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物，和治疗是否是预防性或治疗性的。虽然本发明的人抗体用于向人施用是特别有效的，但也可以向其他哺乳动物施用。术语哺乳动物在本文中意在包括但不限于，人、实验室动物、家养宠物和农场动物。治疗有效量也是抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超过的量。可以调节剂量方案，以提供最佳的所需的应答(例如，治疗或预防性应答)。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。定量给药程序表通常从单次大丸剂剂量或连续灌注到每天多次施用(例如，每4-6小时)，或如治疗医师和患者的病况指示。本发明抗体的治疗有效剂量的示例性的，非限制性范围是O. l-50mg/kg,更优选3-35mg/kg，和更优选5-20mg/kg。定量和频率将由治疗患者的医生来确定，并可以包括每天、每周3次、每周、每2周I次或更少地给予从少于lmg/kg至超过100mg/kg的剂量。然而应该注意，本发明不限于任何特定的剂量。 抗CSF-IR抗体可以与一种或多种其他抗癌治疗组合施用，包括但不限于抗血管发生剂、化疗剂和抗瘤剂。可以使用任何合适的抗癌剂，例如化疗剂、放射、抗体或其组合。抗癌剂包括但不限于抗瘤剂、抗体、佐剂和前体药。本领域目前已知的的或正在评估的抗瘤剂可分组为多种类，包括例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、嵌入型抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物应答改性剂、抗激素和抗血管发生剂。烷化剂的实例包括但不限于顺钼、环磷酰胺、美法仑和达卡巴嗪。抗代谢剂的实例包括但不限于多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、吉西他滨、ALIM.TA 和拓扑异构酶抑制剂伊立替康(CPT-Il)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、托泊替康(拓扑异构酶I)、Ctoposide (VP-16)和替尼泊苷(VM-26)(拓扑异构酶II)。当抗瘤剂是放射时，对待治疗的患者而言放射源可以是外部的(外部照射放射治疗，EBRT)或内部的(近程放射治疗，BT)。所施用的抗瘤剂的剂量取决于多种因素，包括例如活性剂类型、治疗的肿瘤类型和严重程度，和活性剂的施用途径。然而应该强调，本发明不限于任何特定的剂量。在一个方面，多西他赛是本发明优选的抗瘤剂。在本发明的其他方面，赫赛汀⑩和多柔比星是优选的抗瘤剂。本发明的抗CSF-IR抗体可以与中和参与肿瘤生长或血管发生的其他受体的抗体一起施用。在本发明的实施方案中，抗CSF-IR抗体与特异性结合Her2的受体拮抗剂组合使用。此类受体的另一个实例是VEGFR。抗CSF-IR抗体可以与VEGFR拮抗剂组合使用。CSF-IR抗体还可以与一种或多种合适的佐剂组合施用，如，例如，细胞因子(例如，IL-10、IL-4和IL-13)或其他免疫刺激剂，如，但不限于趋化因子、肿瘤相关抗原和肽。在本发明中，可以使用任何合适的方法或途径来施用本发明的抗CSF-IR抗体，并且任选地，来共同施用抗瘤剂和/或其他受体的拮抗剂。在本发明的组合疗法中，可以在用另一种活性剂开始疗法之前、过程中、基本同时或之后施用抗CSF-IR抗体，所述另一种试剂包括但不限于多西他赛、紫杉醇、赫赛汀 或多柔比星，及其任意组合。根据本发明利用的抗瘤剂方案包括任何被认为是最适合治疗患者的肿瘤病况的方案。不同的恶性肿瘤可需要使用特异性的抗肿瘤抗体和特异性的抗瘤剂，这将基于患者逐一确定。施药途径包括例如口腔、静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内施药。所施用的拮抗剂的剂量取决于多种因素，包括例如，拮抗剂类型、治疗的肿瘤类型和严重程度，和拮抗剂的施用途径。然而应该强调，本发明不限于任何特定的方法或施用途径。当出于预防或治疗的目的用于哺乳动物中时，本发明的抗CSF-IR抗体优选配制为药物组合物。此类药物组合物及其制备方法是本领域普遍已知的。参见例如，Remenigton The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A.等人编著，第 19 版，Mack Publishing Co.,1995)。在本发明的另一个方面，本发明的抗体可以与抗癌剂、抗瘤剂或抗血管发生剂或可检测的信号发生剂联合施用，或与抗癌剂、抗瘤剂或抗血管发生剂或可检测的信号发生剂化学或生物合成连接。与抗体连接的抗肿瘤剂包括这样的任何活性剂，其破坏或损害新生血管、或结合了抗体的或处于结合了抗体的细胞环境中的肿瘤或巨噬细胞。本发明可以 是作为缀合物施用的抗CSF-IR抗体，包括但不限于免疫缀合物，所述免疫缀合物特异性地结合受体，并在配体-毒素内在化后递送毒素。抗体-活性剂缀合物可以彼此直接连接或通过接头、肽或非肽连接。例如，抗肿瘤剂或抗巨噬细胞剂是毒性剂，如抗瘤剂或放射性同位素。合适的抗瘤剂(包括化疗剂)是本领域技术人员已知的，并于下文中予以讨论。本发明进一步考虑了在诊断系统中的与靶或报告子部分连接的抗CSF-IR抗体，包括仅作为示例的抗瘤剂、其他抗体或报告子，如，放射性标记的同位素，其中可检测的信号发生剂是与抗体缀合的。根据本发明，抑制血管发生的方法包括以有效抑制血管发生的时间和量向哺乳动物施用含有本发明的抗体或抗体片段的组合物。类似地，通过以有效抑制肿瘤转移的时间和量向哺乳动物施用含有本发明的抗体的组合物，抗体和抗体片段可用于抑制哺乳动物中的肿瘤转移的方法。根据本发明，抑制巨噬细胞渗入肿瘤基质和刺激肿瘤生长的方法包括以有效抑制巨噬细胞对肿瘤生长的作用的时间和量向哺乳动物施用包含本发明的抗体或抗体片段的组合物。类似地，通过以有效抑制骨侵蚀的时间和量向哺乳动物施用含有本发明的抗体的组合物，抗体和抗体片段可用于减轻哺乳动物中的肿瘤转移周围的骨侵蚀的方法，。当癌症在肿瘤相关性巨噬细胞表面表达CSF-IR时，本发明考虑使用CSF-IR配体(CSF-1或IL-34)作为应答治疗的癌症患者的血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞中的生物标志物。本发明还考虑通过测量样品血液中的CSF-I的水平，预测用本发明的抗体或片段成功治疗患者的方法，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞。本发明的另一个方面是治疗患者癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的CSF-I的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和(2)如果CSF-I的水平高于在对照群体中发现的CSF-I水平，则向患者施用本发明的抗体或其片段。本发明还考虑通过测量样品血液中的IL-34的水平，预测用本发明的抗体或片段成功治疗患者的方法，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞。本发明的另一个方面是治疗患者癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的IL-34的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和(2)如果IL-34的水平高于在对照群体中发现的IL-34水平，则向患者施用本发明的抗体或其片段。
本发明还考虑用于确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是本发明的抗体，所述方法包括(I)离体或在体外确定受试者的样品中的CSF-I的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和⑵较之未患癌症的个体中的CSF-I的水平，其中CSF-I的水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。本发明还考虑用于确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是本发明的抗体，所述方法包括(I)离体或在体外确定受试者的样品中的IL-34的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和⑵较之未患癌症的个体中的IL-34的水平，其中IL-34的水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。本发明还考虑用于确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是本发明的抗体，所述方法包括(I)离体或在体外确 定受试者的样品中的CSF-I或IL-34或两者的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞；和(2)较之未患癌症的个体中的CSF-I或IL-34或两者的水平，其中CSF-I或IL-34或两者的水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。可以在多种方法中测量CSF-I或IL-34水平，包括可商购的试剂盒(R&D Systems的CSF-I和USCN Life Sciences, Inc.的IL-34)。在一种此类技术中，向用人CSF-I或IL-34抗体预先包被的平板中加入CSF-I或IL-34标准品或样品，以允许CSF-I或IL-34与抗体结合。在洗涤了未结合的CSF-I或IL-34以及其他蛋白质后，分别加入识别抗CSF-I或IL-34抗体的第二抗体。第二抗体与辣根过氧化物酶偶联，当孔内加入底物时产生蓝色。颜色的亮度与平板中发现的CSF-I或IL-34的量相关。由于健康人体中天然存在CSF-I和IL-34，需要在对照群体中确定CSF-I和IL-34基线。对照群体可包括未诊断出具有癌性病况或感染信号的个体组。因此，对照群体将建立起CSF-I和IL-34的范围，这对健康个体而言是正常的或基线。例如，相比对照组的血清，乳腺癌患者或结肠直肠癌患者血清中的CSF-I水平分别高68%或77% (Lawicki等人，Clin.Chim. Acta 317 :112-116(2006) ；Mroczho 等人，Clin. Chim. Acta 380 :208-212 (2007))。在本发明的一个方面，癌症患者样品中的CSF-IR配体水平比来自对照群体的样品中的CSF-IR配体水平高至少50%。将对照群体的CSF-I和/或IL-34水平的范围与从患者的样品中鉴别的CSF-I和/或IL-34水平相比较，以确定患者的CSF-I和/或IL-34水平是否高于对照群体的基线范围。在一个方面，本发明的抗体用于治疗癌症，其中癌细胞分泌配体。在另一个方面，本发明的抗体用于治疗癌症，其中癌细胞分泌CSF-1。在另一个方面，本发明的抗体用于治疗癌症，其中癌细胞分泌IL-34。本发明还包括用于抑制肿瘤生长和/或血管发生的试剂盒，所述试剂盒包含治疗有效量的人抗CSF-IR抗体。试剂盒可以进一步包含抗体或其片段，和额外的试剂，诱导额外的抗癌剂、抗瘤剂或治疗，包括但不限于多西他赛、紫杉醇、赫赛汀‘⑩或多柔比星。备选地或额外的，试剂盒可含有例如下文讨论的涉及肿瘤发生或血管发生的另一种生长因子受体的任何合适的拮抗剂。本发明的试剂盒还可以包含佐剂。
因此，本发明的受体抗体可以在体内和体外用于本领域已知的探索性、诊断性、预防性或治疗方法。本领域技术人员可以对本文公开的本发明在原则内进行变化，并且此类改变意在包括于本发明的范围内。应理解并预期本领域技术人员可以对本文公开的本发明在原则内进行改变，并且此类改变意在包括于本发明的范围内。
实施例下列实施例进一步示例了本发明，但不应视为以任何方式限制本发明不应以任何方式将它们视为对本发明的广阔范围的限制。可以从多种出版物中获得对常规方法的细节描述，例如在构建载体和质粒中应用的方法，将编码多肽的基因插入到此类载体和质粒中，将质粒导入宿主细胞，和基因和基因产物的表达及其确定，所述出版物包括Samtoook，J.等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)和 Coligan,J.等人，Current Protocols in Immunology,Wiley·&Sons, Incorporated(2007)。人抗CSF-IR抗体的表达和纯化对于每种抗体，通过合适的方法，例如PCR克隆，将合适的重链核苷酸序列(例如抗体I的SEQ ID NO. 13)改造为合适的表达质粒(例如pGSHC)，并将合适的轻链核苷酸序列(例如抗体I的SEQ ID NO. 14)改造为合适的表达质粒(例如pGSLC)。为了建立稳定的细胞系，通过电穿孔将线性化的重链和轻链质粒共转染到合适的宿主细胞系(例如NSO或CHO细胞)中，并在合适的培养基(例如具有透析的胎牛血清和谷氨酰胺合成酶补充物的不含谷氨酰胺的Dulbecco' s Modified Eagle Medium)中培养。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选表达抗体的克隆，选择最高的生产株用于旋动瓶培养。通过合适方法例如蛋白A亲和层析纯化抗体。表I提供了本发明的抗体I的多种CDR的氨基酸序列和SEQ ID NO。使用Kabat惯例确定所有的CDR序列。表2提供了涉及本发明的多种序列的SEQ ID NO。编码下文公开的氨基酸序列的多核苷酸序列也包括在本发明的范围内。表I :抗体I的氨基酸序列重链和轻链可变区⑶R
权利要求
1.特异性结合人CSF-IR变体(SEQID NO. 15)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有序列 SYGMH (SEQ ID NO 1)的 CDRH1，含有序列 VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO 2)的CDRH2，含有序列⑶ YEVDYGMDV(SEQ ID NO 3)的 CDRH3，含有序列 RASQGISNALA (SEQ ID NO:4)的 CDRLl，含有序列 DASSLES (SEQID NO 5)的 CDRL2，含有序列 QQFNSYPWT (SEQ ID NO 6)的 CDRL3。
2.特异性结合人CSF-IR(SEQID NO. 16)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有 SYGMH (SEQ ID NO: I)的 CDRH1，含有序列 VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO 2)的 CDRH2，含有片列⑶YEVDYGMDV(SEQ ID NO 3)的 CDRH3，含有序列 RASQGISNALA (SEQ ID NO 4)的CDRLl，含有序列 DASSLES (SEQ ID NO 5)的 CDRL2，含有序列 QQFNSYPWT (SEQ ID NO 6)的CDRL3。
3.权利要求I或2的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有氨基酸片列AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPffTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO 8)的 VL，和含有氨基酸序列 QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYEVDYGMDVffGQGTTVTVAS(SEQ ID NO 7)的 VH。
4.权利要求1-3的任一项的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有SEQID NO 9的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的轻链。
5.权利要求1-4的任一项的抗体或其片段，包含两条重链，每条重链含有SEQID NO:9的氨基酸序列，和两条轻链，每条轻链含有SEQ IDNO 10的氨基酸序列。
6.包含权利要求1-5的任一项的抗体或片段以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
7.权利要求6的药物组合物，其还包含额外的药剂。
8.权利要求1-5的任一项的抗体或片段，其用于疗法。
9.权利要求1-5的任一项的抗体或其片段，其用于治疗癌症。
10.根据权利要求9的抗体或其片段的用途，其中癌症是白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌、多发性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。
11.根据权利要求10的抗体或其片段的用途，其中癌症是白血病、乳腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。
12.根据权利要求11的抗体或其片段的用途，其中癌症是白血病、乳腺癌或前列腺癌。
13.根据权利要求8-12的抗体或其片段的用途，其中抗体或其片段是在开始用另一种抗癌治疗的疗法之前、过程中、基本同时或之后施用的。
14.根据权利要求13的抗体或其片段的用途，其中所述抗癌治疗选自抗血管发生剂、化疗剂和抗瘤剂。
15.根据权利要求14的抗体或其片段的用途，其中所述抗瘤剂选自多西他赛、紫杉醇、赫赛汀 或多柔比星。
16.治疗哺乳动物的癌症的方法，包括向所述需要治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求1-5的抗体或其片段，其中癌症选自白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾癌、多发性骨髓瘤和霍奇金氏淋巴瘤。
17.权利要求16的方法，其中癌症选自白血病、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌。
18.权利要求17的方法，其中癌症选自白血病、乳腺癌和前列腺癌。
19.权利要求16的方法，还包括向所述哺乳动物施用另一种抗癌治疗，其中所述抗癌治疗选自抗血管发生剂、化疗剂和抗瘤剂。
20.根据权利要求19的方法，其中所述抗瘤剂选自多西他赛、紫杉醇、赫赛汀 或多柔比星。
21.治疗患者的癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的CSF-I的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞，和(2)如果CSF-I的水平高于对照群体中发现的CSF-I水平，则向患者施用根据权利要求1-5的任一项的抗体或其片段。
22.治疗患者的癌症的方法，包括步骤(I)测量从患者采集的样品中的IL-34的水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞，和(2)如果IL-34的水平高于对照群体中发现的IL-34水平，则向患者施用根据权利要求1-5的任一项的抗体或其片段。
23.确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是权利要求1-5的抗体，所述方法包括 离体或在体外确定受试者的样品中的CSF-I水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞， 其中，较之未患癌症的个体中的CSF-I水平，CSF-I水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。
24.确定患癌症的受试者是否是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象的方法，其中所述抗体是权利要求1-5的抗体，所述方法包括 离体或在体外确定受试者的样品中的IL-34水平，其中样品选自血液、血清、血浆、肿瘤细胞和循环的肿瘤细胞， 其中，较之未患癌症的个体中的IL-34水平，IL-34水平的增加表示受试者是基于抗CSF-IR抗体的癌症治疗方案的候选对象。
全文摘要
本发明提供了以高亲和性结合人CSF-1R的人抗体。本发明的抗体以多功能性比本领域已知的抗体具有明显的优势抑制CSF-1R的信号传递，内在化和诱导CSF-1R降解，和刺激包括肿瘤、巨噬细胞和单核细胞的细胞中的ADCC。所述抗体还表现出独自或与多西他赛、紫杉醇、赫赛汀或多柔比星组合的有效治疗白血病、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌。
文档编号A61K39/395GK102834414SQ201180017294
公开日2012年12月19日 申请日期2011年3月28日 优先权日2010年4月1日
发明者J·F·杜迪, Y·李 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司