专利名称：衍生自trem样转录1(tlt-1)的抑制肽和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及衍生自蛋白质TLT-1的多肽片段和它们用于治疗炎性疾病和更具体地用于治疗败血症的用途。
背景技术：
感染性休克(由对感染有害的和破坏性的宿主反应产生的一种复杂的临床综合征)是重症监护病房中死亡率的主要原因。当对全身性感染的初始适当的宿主反应变得失调和过度放大，并带有炎症和凝血之间的亲密串扰时，败血症逐渐形成了。在担当先天免疫反应的放大器的候选物之中，一些属于髓系细胞上表达的触发受体(TREM)家族[Bouchon，A.等,2000 ；Bleharski, J.R.等，2003 ；Haselmayer, P.等，2007 ；Gibot, S.等，2007]。人TREM基因簇位于染色体6p21.1上，并编码六种不同的蛋白质，TREM 1-5和TLT-1 (TREM样转录-1)。人TREM-1 (hTREM-Ι)由194个氨基酸(aa)残基的胞外区、29个aa的跨膜区和5个aa的短胞质尾组成。胞外样Ig域包含对应于V型Ig域的基序DxGxYxC。Ig域通过包含三个N-糖基化位点的60个a a部分连接到跨膜区。跨膜区(spanning region)包含与含ITAM的蛋白质DAP12的跨膜域的Asp残基形成盐桥的Lys残基，使TREM-1和其接头蛋白之间能够联系[Bouchon, A.等，2000 ;Kelker，M.S.等，2004 ;Kelker，M.S.等，2004]。TREM的参与触发了涉及ZAP70和SYK的信号传导路径和接头分子例如GRB2的随后补充和酪氨酸磷酸化，PI3K、PLC-Y、ERK-1、-2 和 p38MAPK 的活化[HaseImayer, P.等，2009 ；Gibot,S，2005]。最终导致转录因子NF-kB活化的这些路径的活化通过CARD9-BCL10-MALT1调节[Hara,H.等，2007]。值得注意的是，虽然晶体学分析可以通过使用抗体-等效互补性决定区(OTR)循环(例如TCR、⑶8和CTLA-4)来预测TREM-1的识别，其天然配体尚未确定。使用TREM-1融合蛋白或使用为TREM-1的胞外域的⑶R3和“F” β链设计的肽的阻断实验表明炎症减少，导致内毒素血症与多种微生物引起的败血症的鼠模型的存活率改善[Bouchon, A.等，2001 ；Gibot,S.等，2006]。调节TREM-1信号转导的保护性作用还体现在其它急性炎症(缺血再灌注损伤、急性胰腺炎、出血性休克)或慢性炎症(炎症性肠疾病、炎症性关节炎)的模型中。所有这些研究表明TREM-1在放大感染或无菌炎症中的作用。除了 TREM-1，TREM基因簇包括TREM样转录I (TLT-1)。TLT-1是丰富的，只在血小板和巨核细胞上表达并且在血小板α颗粒中隔离。一旦血小板活化，TLT-1易位到血小板表面[Washington, Α.V.等,2004]。TLT-1包含v组Ig型胞外域、跨膜区和胞质尾,所述胞质尾包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和聚脯氨酸富集域。不像其它TREM家族成员，TLT-1不与DAP12活化链耦合，鉴于其已经证实提高了大鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞中的Ca++信号转导，表明TLT-1是共活化受体[Barrow，A.D.等，2004]。TLT-1在血小板上表达的特异性表明其在止血和/或血栓形成中应当发挥独特的作用。事实上，已经提出TLT-1的调节可以在调节血小板功能中具有若干潜力，从而预防炎症相关的高凝(但非直接炎症)或血小板相关疾病(如出血或凝血障碍)[WashingtonAV.等，2009]。这种调节可以以直接(通过干扰TLT-1配体)或间接(通过调节TLT-1胞内途径)方式介导。在本文中，发明人首次报道了 TLT-1和TLT-1衍生肽通过特异性抑制TREM-1活性显示出抗炎性质。这种肽能够抑制TREM-1信号转导并且因此具有天然存在的TREM-1抑制剂的特性。它们进一步表明相同的肽，作为TREM-1和其胞内路径抑制的结果，还在体内调节通过感染触发的促炎症级联，从而在败血症期间抑制TREM-1相关的高反应性和随之而来的器官损伤和死亡。发明概述本发明基于TLT-1和TLT-1衍生肽能够特异性抑制TREM-1的发现。发明人首次表明人TLT-1 (hTLT-Ι)和hTLT_l衍生肽能够特异性识别和结合人TREM-1 配体。发明人还表明，作为hTLT-Ι和hTLT-Ι衍生肽结合hTREM_l配体的结果，hTLT_l和hTLT-Ι衍生肽能够在体外和体内减少hTREM-Ι诱导的人-TREM-1-表达细胞的激活，其特征在于胞内信号转导的调节(磷酸化途径)、CARD9-MALT1-BCL10复合物形成、NF- κ B激活(核易位)、ROS产生(活性氧种)和细胞因子/趋化因子表达(mRNA)和分泌(蛋白质)。发明人还表明TLT-1衍生肽能够治疗TREM-1相关的疾病，即其中TREM-1激活在病理生理过程中发挥作用的疾病，如急性炎性疾病(败血症、严重的败血症或败血性休克、失血性休克、缺血再灌注损伤、胰腺炎)或慢性炎性疾病(炎症性肠疾病、风湿性疾病、癌症)。因此，本发明涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO I的至少6个连续的氨基酸的多肽片段或功能保守性变体以用于治疗炎性病症。本发明的另一个目的在于一种药物组合物，其包含至少一种如本文中所定义的多肽，或选择性的包含编码本发明多肽的核酸的载体。发明详述定义:在整个说明书中，采用几个术语并且在以下段落中定义。如本文使用的，用于“髓系细胞上表达的触发受体I ”的术语“TREM-1 ”表示已经在人和鼠多形核嗜中性粒细胞和成熟单核细胞上识别的细胞表面分子。它属于免疫球蛋白超家族并且在称为DAP12的接头蛋白的帮助下激活下游信号转导路径。在细菌例如铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的存在下，在细胞培养和感染患者组织样品中，TREM-1在嗜中性粒细胞和单核细胞上的表达均极大地上调。形成鲜明对比的是，在来自患有非感染性炎性疾病例如牛皮癣、溃疡性结肠炎或由免疫复合物引起的血管炎的患者的样品中，TREM-1没有上调。此外，当TREM-1与其配体结合时，LPS的协同效果和促炎性细胞因子例如TNF-[ α ]的放大合成与IL-10产生的抑制一同被观察到。如本文所使用，用于“TREM样转录I”的术语“TLT-1”表示TREM家族的一个成员。Mcvicar小组最初的工 作[Washington A.V.等,2004]表明TLT-1是丰富的,对血小板和巨核细胞谱系具有特异性，并且在血小板α颗粒中被隔离。一旦血小板被凝血酶或LPS活化，TLT-1易位到血小板表面。TLT-1包含V组Ig型胞外域、跨膜区和胞质尾，所述胞质尾包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和聚脯氨酸富集域。不像其它TREM家族成员，TLT-1不与DAP12活化链耦合，鉴于其已经证实提高了大鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞中的Ca++信号转导，表明TLT-1是共活化受体。TLT-1的氨基酸序列如氨基酸序列SEQ ID NOI所描述。本发明的多肽在下表I中描述。
权利要求
1.一种多肽，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少6个连续氨基酸或功能保守性变体，用于治疗炎性病症。
2.根据权利要求1的多肽，包含选自SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的6个连续氨基酸序列，用于治疗炎性病症。
3.根据权利要求2的多肽，包含如SEQID NO:9所示的氨基酸序列，用于治疗炎性病症。
4.根据权利要求3的多肽，包含如SEQID NO:4所示的氨基酸序列，用于治疗炎性病症。
5.一种编码根据权利要求1-4的多肽的分离的核酸序列。
6.一种质粒,包含根据权利要求5的核酸序列。
7.—种表达载体，包含根据权利要求5的核酸序列。
8.根据权利要求1-4的多肽，其中所述炎性病症是败血症。
9.一种药物组合物，包含治疗有效量的至少一种根据权利要求1-4的多肽、或根据权利要求5的核酸、或根据权利要求6的质粒、或根据权利要求7的表达载体，和至少一种药学上可接受的赋形剂 。
全文摘要
本发明涉及衍生自蛋白质TLT-1的多肽片段和它们在治疗炎性病症和更具体地在治疗败血症中的应用。
文档编号A61K38/17GK103153327SQ201180028906
公开日2013年6月12日 申请日期2011年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者塞巴斯蒂安·吉博, 马尔克·德里夫 申请人:国家健康与医学研究院, 洛林大学