专利名称：Cgrp抗体的制作方法
CGRP抗体
本发明在医学领域内，特别是在降钙素基因相关肽(CGRP)的抗体的领域内。更具体而言，本发明涉及CGRP抗体和CGRP抗体用于骨关节炎疼痛或偏头痛疗法中的用途。
降钙素基因相关肽(CGRP)是由中枢和外周神经系统的神经分泌的37个氨基酸的神经肽。CGRP广泛分布于外周和中枢神经系统中的感觉神经中，并表现出多种不同的生物学活性。据报道CGRP具有功能。当从三叉神经和其他神经纤维释放时，认为CGRP通过结合特定的细胞表面受体来介导其生物学应答。
据报道CGRP在偏头痛中发挥作用，因为CGRP是当感觉神经受刺激时释放的，并具有强效的血管舒张活性。当这些纤维受到刺激时，CGRP的释放增加了血管渗透性及随后的在受三叉神经纤维神经支配的组织中的血浆蛋白渗漏(血浆蛋白外渗)。此外，研究还报道了在患偏头痛的患者中灌注CGRP导致偏头痛样症状。
还报道了 CGRP在骨关节炎(OA)中发挥作用。OA是在世界范围影响高百分比人群的慢性病况。关节炎疼痛由痛觉过敏(对正常的无害刺激过度敏感)和自发性疼痛(休息时疼痛)表征。关节的炎症导致外周和中枢致敏。在外周致敏中，通常高阈值的含CGRP的伤害性感受器开始应答于与正常关节活动相关的轻微压力。CGRP作为炎症过程的局部促进剂发挥作用。这一持续的过程最终导致脊髓的中枢致敏，使神经元变得应答发炎的和非发炎的组织的刺激。在大鼠的OA疼痛的临床前模型中，观察到CGRP阳性神经纤维数量的增加，与疼痛量正相关。
OA疼痛的现有护理标准由非类固醇抗炎药物(NSAID)和选择性Cox_2抑制剂组成。随时间推移，许多患者将变得对这些治疗不敏感，或者不能耐受有效缓解疼痛所需的高剂量。后续治疗由关节内注射(乙酰透明质酸)或阿片剂组成。最后的治疗是手术全关节替换。许多这类治疗具有负面的副作用，范围从胃肠道(NSAID)至心血管(Cox-2抑制剂)， 是棘手和/或不太有效的(关节内注射)、具有滥用的风险(阿片剂)，或仅限于I个关节 (关节内注射、手术)。
虽然已经公开了用于治疗偏头痛和用于治疗炎症疼痛的CGRP抗体(偏头痛-WO 2007/076336 和 WO 2007/054809 ；0A-参见 W02009/109908A1 的抗体 Gl)，但仍然需要备选物。优选的，治疗备选物是安全有效的。更优选地，OA的备选的治疗可提供对多个关节的长期持续的疼痛缓解，这对于患者是可耐受的，没有依赖性和/或滥用的风险。
本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区 (HCVR)，其中所述LCVR包含LCDRl。LCDR2和LCDR3氨基酸序列，并且HCVR包含HCDRl、 HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列选自
a)LCDRl 是 RASQDIDNYLN(SEQ ID NO 3), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTCDTRYIQKFAG(SEQ ID NO : 13)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)；
b)LCDRl 是 RASQDIDNYLN(SEQ ID NO 3), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO : 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)；
c)LCDRl 是 RASKDISKYLN(SEQ ID NO 6), LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO 7), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO 12), HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO : 16)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)；
d)LCDRl 是 RASRPIDKYLN(SEQ ID NO 8), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO : 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39);和
e)LCDRl 是 RASQDIDKYLN(SEQ ID NO 9), LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO 7), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)，
其中，人的工程CGRP抗体结合人CGRP。
本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ IDNO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :13，并且HCIR3是SEQ ID NO : 14，其中人的工程CGRP抗体结合人CGRP。本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段，其中IXDRl是SEQ ID NO :3， LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :15，并且HCDR3是SEQ ID NO : 14，其中人的工程CGRP抗体结合人CGRP。本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是SEQ ID NO :6，LCDR2是SEQ ID NO 7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :16，并且 HCDR3 是 SEQ ID N0:39，其中人的工程CGRP抗体结合人CGRP。本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程 CGRP 抗体，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :8，LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQID NO : 12，HCDR2 是 SEQ ID NO :15，并且 HCDR3 是 SEQ ID N0:39，其中人的工程CGRP抗体结合人CGRP。本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体， 其中 LCDRl 是 SEQ ID NO 9, LCDR2 是 SEQ ID NO 7, LCDR3 是 SEQ ID NO 5, HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO : 15，并且 HCDR3 是 SEQ ID NO :39，其中人的工程 CGRP 抗体结合人CGRP。
本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体，其中IXDRl是 RASX1X2IX3X4YLn (SEQ ID NO 10) , LCDR2 是 YTSX5YHS (SEQ ID NO 11) , LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5),并且 HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO 12), HCDR2 是 AIYEGTGX6TX7YIQKFAX8 (SEQ ID NO :37)，并且HCDR3 是LSDYVSGFX9Y(SEQ ID N0:38)，其中 X1 是Q、R或K ;X2是D或P，X3是D或S，X4是N或K，X5是G或E，X6是K或D，X7是V或R，X8 是D或G，并且X9是G或S，其中抗体结合人CGRP。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区 (HCVR)的人的工程CGRP抗体，其中LCVR包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASX1X2IX3X4YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSX5
yhsgvpsrfsgsgsgtdftx6tisslqpedx7atyycqqgdalpptfgx8gtkx9eik
其中，乂1是11(或1 ;&是0或P而是0或S 4是1(或N;X5是E或6乂是？或 L ;X7 是 I 或 F ;X8 是 Q 或 G ;并且 X9 是 L 或 V。(SEQ ID NO 42)
并且HCVR包含
QVQLVQSGAEVKKPGXiSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAI
yegtgx2tx3yiqkfax4rvtx5tx6dx7ststx8ymelsslrsedtavyycarlsdy
VSGFX9YWGQGTX1QVTVSS，其中 X1 = A 或 S; X2 = K 或 D; X3 = V 或 R; X4 = G 或 D;
X5 = M 或 I ;X6 = R 或 A ;X7 = T 或 K ;X8 = V 或 A ;X9 = G 或 S ;并且 Xltl = L 或 T. (SEQ ID NO 43)，
其中抗体结合人CGRP。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区 (HCVR)的人的工程CGRP抗体，其中LCVR和HCVR是选自以下的氨基酸序列
a. LCVR 是 SEQIDNO: 17 并且 HCVR 是 SEQIDNO22 ；
b. LCVR 是 SEQIDNO: 18 并且 HCVR 是 SEQIDNO23 ；
c. LCVR 是 SEQIDNO: 19 并且 HCVR 是 SEQIDNO24 ；
d. LCVR 是 SEQIDNO: 20 并且 HCVR 是 SEQIDNO 25 ；
e. LCVR 是 SEQIDNO 21 并且 HCVR 是 SEQIDNO26o
本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO : 17的LCVR和SEQ ID NO 22 的HCVR。在优选的实施方案中，本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID N0:18的 LCVR和SEQ ID NO :23的HCVR。本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO 19 的LCVR和SEQ ID NO :24的HCVR。本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO 20 的LCVR和SEQ ID NO :25的HCVR。本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO: 21 的 LCVR 和 SEQ ID NO 26 的 HCVR0
本发明还提供了包含轻链(LC)和重链(HC)的人的工程CGRP抗体，其中LC和HC氨基酸序列选自
a) LC 是 SEQ ID NO 27 并且 HC 是 SEQ ID NO 32 ；
b) LC 是 SEQ ID NO 28 并且 HC 是 SEQ ID NO 33 ；
c) LC 是 SEQ ID NO 29 并且 HC 是 SEQ ID NO 34 ；
d) LC 是 SEQ ID NO 30 并且 HC 是 SEQ ID NO :35 ;和
e)LC 是 SEQ OD NO 31 并且 HC 是 SEQ ID NO :36。
在实施方案中，人的工程CGRP抗体包含SEQ ID NO 27的LC和SEQ ID NO 32的 HC。在另一个实施方案中，人的工程CGRP抗体包含SEQ ID NO 28的LC和SEQ ID NO 33 的HC。在另一个实施方案中，人的工程CGRP抗体包含SEQ ID NO 29的LC和SEQ ID NO 34的HC。在另一个实施方案中，人的工程CGRP抗体包含SEQ ID NO :30的LC和SEQ ID NO :35的HC。在另一个实施方案中，人的工程CGRP抗体包含SEQ ID NO :31的LC和SEQ ID NO 36的HC。在实施方案中，人的工程CGRP抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC氨基酸序列是SEQID NO :27并且每条HC氨基酸序列是SEQ ID NO :32。在实施方案中，人的工程CGRP抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC氨基酸序列是SEQ ID N0:28并且每条HC氨基酸序列是SEQ ID NO 330在实施方案中，人的工程CGRP抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC氨基酸序列是SEQ ID NO 29并且每条HC氨基酸序列是SEQ ID NO 34。在实施方案中，人的工程CGRP抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且每条HC氨基酸序列是SEQ ID NO :35。在实施方案中，人的工程CGRP 抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC氨基酸序列是SEQ ID NO :31并且每条HC氨基酸序列是SEQ IDNO 360本发明还提供了本文所述的抗体的抗原结合片段。
本发明还提供了这样的人的工程CGRP抗体，所述抗体在基本如实施例4所述的测定中的IC50< Ι.ΟηΜ。在实施方案中，本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :6，LCDR2 是 SEQ ID NO :7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ IDNO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :16 并且HCDR3 是SEQ ID NO :39，并且其中人的工程CGRP 抗体结合人CGRP，并在基本如实施例4所述的测定中的IC50 < I. OnM。在实施方案中，本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO 19的LCVR氨基酸序列和SEQ ID NO 24的HCVR氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗体在基本如实施例4所述的测定中的IC50 < I. OnM0在实施方案中，本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID N0:29的LC氨基酸序列和SEQ ID NO 34的HC氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗体在基本如实施例4所述的测定中的IC50 < I. OnM0
本发明还提供了人的工程CGRP抗体，其在基本如实施例4所述的测定中的IC50 <0.5nM。在实施方案中，本发明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗体，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :6，LCDR2 是 SEQIDN0 :7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO 12，HCDR2是SEQ ID NO 16并且HCDR3是SEQ ID NO :39，且其中人的工程CGRP抗体结合人CGRP，并在基本如实施例4所述的测定中的IC50 < O. 5nM。在实施方案中，本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO : 19的LCVR氨基酸序列和SEQ ID N0:24的HCVR 氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗体在基本如实施例4所述的测定中的IC50 < O. 5nM。在实施方案中，本发明提供了人的工程CGRP抗体，其包含SEQ ID NO 29的LC氨基酸序列和 SEQ ID NO 34的HC氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗体在基本如实施例4所述的测定中的 IC50 < O. 5nM。
本发明还提供了包含本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段和可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明还提供了包含本发明的CGRP抗体，连同可药用的载体和任选地其他治疗成分的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了治疗骨关节炎疼痛的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段。在另一个方面，本发明提供了治疗偏头痛的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段，其用于疗法。在另一个方面，本发明提供了用于治疗骨关节炎疼痛的本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段。在另一方面，本发明提供了用于治疗偏头痛的本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段在用于治疗骨关节炎疼痛中的用途。在另一个方面，本发明还提供了本发明的人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段在用于治疗偏头痛中的用途。本发明还提供了人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段在生产用于治疗骨关节炎的药物中的用途。本发明还提供了人的工程CGRP抗体或其抗原结合片段在生产用于治疗偏头痛的药物中的用途。
天然存在的全长抗体是包含由二硫键互相连接的2条重链(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基末端部分包括约100-110个氨基酸的可变区，所述可变区通过其中包含的互补决定区(OTR)主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。
CDR中间散布着更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个⑶R和4个FR组成，按下列顺序从氨基端至羧基端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的 3 个 CDR 被称为 “LCDR1、LCDR2 和 LCDR3”，重链的 3 个 ⑶R被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶R含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。 LCVR和HCVR区域内的⑶R氨基酸残基的编号和定位依照普遍已知的Kabat编号规则。
轻链被分为K或λ，其特征是本领域已知的特别的恒定区。重链被分为Y、μ、 α、δ或ε ,分别定义抗体的同种型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以进一步被分为亚类，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。每条重链类型由具有本领域已知的序列的特别的恒定区表征。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”(Mab)指源自单拷贝或克隆，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，而不限于生产它的方法的抗体。本发明的Mab优选地以均质的或基本均质的群体存在。完整的Mab含有2条重链和2条轻链。此类单克隆抗体的“抗原结合片段”包括例如，Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。可以通过例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如⑶R-移植)或此类技术的组合，或本领域已知的其他技术，来生产本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段。例如，可以用人CGRP或其片段免疫小鼠，可以回收和纯化所获得的抗体，并通过下列实施例中公开的方法来评估，确定它们是否与本文公开的抗体化合物具有相似或相同的结合和功能性质。还可以通过常规方法制备抗原结合片段。用于生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域普遍已知的，可见于例如 Harlow 和 Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,第 5-8 和 15 章，ISBN 0-87969-314-2 中。
词组“人的工程CGRP抗体”指这样的单克隆抗体，所述抗体经过创造和/或操作而具有根据本发明的结合和功能性质，结合人CGRP，并且具有源自非人抗体的CDR周围的基本是人的或完全是人的框架区。此类人的工程抗体的“抗原结合片段”包括例如，Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。“框架区”或“框架序列”指框架区I至4的任一个。本发明涵盖的人的工程抗体及其抗原结合片段包括这样的分子，其中，框架区I至 4的任一个或多个基本上或完全是人的，即，其中存在单个基本上或完全是人的框架区I至 4的任意可能组合。例如，这包括其中框架区I和框架区2、框架区I和框架区3、框架区I、 2和3等基本上或完全是人的分子。基本上是人的框架是与已知的人种系框架序列具有至少约80%序列同一性的那些框架。优选地，基本上是人的框架与已知的人种系框架序列具有至少约85%、约90%、约95%或约99%序列同一性。
完全是人的框架是与已知的人种系框架序列相同的那些框架。人框架种系序列可以通过网址http //imgt. cines. fr获得自ImMunoGeneTics (IMGT),或获得自 Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc,AcademicPress,2001,ISBN 012441351 的The Immunoglobulin FactsBook0 例如，种系轻链框架可以选自A11、A17、A18、A19、A20、A27、 A30、L1、L11、I12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02 和 08，并且种系重链框架可以选自VH2_5、 VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69, VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-51。
可以使用若干种不同的方法生成除本文公开的以外的、表现出类似根据本发明的功能性质的人的工程抗体。本文公开的特定的抗体化合物可用作模板或亲代抗体化合物来制备其他的抗体化合物。在一种方法中，将亲代抗体化合物CDR移植到与亲代抗体化合物框架具有高度序列同一性的人框架上。一般地，新框架的序列同一性与亲代抗体化合物的相应框架的序列至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同。该移植可导致相比亲代抗体的结合亲和力降低。如果是此情况，可以基于Queen等人 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 2869公开的具体准则，在某些位置将框架回复突变为亲代框架。描述了在人源化小鼠抗体中有用的其他参考文献包括美国专利号4，816，397； 5 ，225，539 和 5，693，761 ;如 Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168 595-620 中描述的计算机程序 ABMOD 和 ENCAD ;以及 Winter 和同事的方法(Jones 等人(1986)Nature321 522-525 ； Riechmann 等人(1988) Nature 332 :323_327 ；和 Verhoeyen 等人(1988) Science 239 1534-1536。
可以如下进行鉴定考虑用于回复突变的残基
当氨基酸落入下列类别时，用来自亲代抗体化合物的框架(“供体框架”)的框架氨基酸取代所使用的人种系序列(“受体框架”)的框架氨基酸
(a)受体框架的人框架区中的氨基酸在所述位置对于人框架是不常见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸在所述位置对于人框架是典型的；
(b)氨基酸的位置紧邻⑶R中的一个；或
(c)在三维免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任何侧链原子都在CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(angstrom)内(中心至中心)。
当受体框架的人框架区的每个氨基酸和供体框架中的相应氨基酸在所述位置对于人框架都一般是不常见之时，可以用在所述位置对于人框架典型的氨基酸替代此类氨基酸。该回复突变规则使得能够恢复亲代抗体化合物的活性。
生成展示出与本文公开的抗体化合物相似的功能特性的人的工程抗体的另一种方法涉及在不改变框架的条件下，随机突变移植的CDR中的氨基酸，并针对与亲代抗体化合物同样好或更好的结合亲和力和其他功能性质，筛选所获得的分子。还可以在每个CDR 中的每个氨基酸位置导入单个突变，再评估此类突变对于结合亲和力和其他功能性质的作用。可以组合产生改善性质的单个突变，来评估彼此组合时的作用。
此外，上述两种方法的组合也是可能的。在⑶R移植后，除了在⑶R中导入氨基酸改变外，可以回复突变特定的框架区。该方法学描述在Wu等人(1999) J. Mol. Biol. 294 : 151-162 中。
应用本发明的教导，本领域技术人员可以使用常规技术，例如定点诱变，来取代本文公开的CDR和框架序列中的氨基酸，从而生成源自本发明序列的其他可变区氨基酸序列。可以在特定的取代位点导入所有的备选的天然存在的氨基酸。然后可以使用本文公开的方法来筛选这些其他的可变区氨基酸序列，来鉴定具有指明的体内功能的序列。通过该方法，可以鉴定适合制备根据本发明的人的工程抗体及其抗原结合部分的其他序列。优选地，框架内的氨基酸取代限于本文公开的4条轻链和/或重链框架区的任何一个或多个中的1、2或3个位置。优选地，⑶R中的氨基酸取代限于3条轻链和/或重链⑶R中的任何一个或多个中的1、2或3个位置。上述这些框架区和CDR中的多种改变的组合也是可能的。
术语“治疗”指涉及减慢、中断、阻遏、控制、中止、降低或逆转症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度的过程，但不必涉及完全排除与CGRP活性相关的所有的疾病相关症状、病况或病症。
根据国际头痛协会的头痛分类委员会(Headache ClassificationCommittee of the International Headache Society (InternationalHeadache Society, 2004)),术语 “偏头痛”如本文所用指“无先兆的偏头痛”(之前的“普通偏头痛”)和“有前兆的偏头痛”(之前的“经典偏头痛”)。例如，“无先兆的偏头痛”通常的特征是具有脉冲性质、中等或严重的强度，受常规物理活动加剧，单侧分布并与恶心、畏光和声音恐惧相关。“有前兆的偏头痛”可包括对视觉的干扰、对其他感觉的干扰、单侧无力和在一些情况下语言困难。
本发明的人的工程抗体可用作人类医药中的药物，通过多种途径施用。最优选地， 此类组合物用于肠胃外施用。可以通过本领域普遍已知的方法制备此类药物组合物(参见例如，Remington :The Science and Practice ofPharmacy,第 19 版(1995), A. Gennaro 等人，Mack Publishing Co.),并且所述组合物包含如本文公开的人的工程抗体和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
下列测定的结果证实，本发明的所示例的单克隆抗体及其抗原结合片段可用于治疗骨关节炎疼痛。
实施例I-生产抗体
可以如下制备和纯化抗体I-V。使用最佳的预先确定的HC LC载体比例或编码 LC(例如SEQ ID NO 27,SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID Ν0:30或SEQ ID NO :31)和 HC(例如 SEQ ID NO 32,SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35 或 SEQ ID NO 36)的单个载体系统，使用用于分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染恰当的宿主细胞(例如HEK 293ΕΒΝΑ或CH0)。使用多种常用技术的任一种纯化其中分泌了抗体的澄清的培养基。例如， 可以方便地将培养基施用于已经用相容的缓冲液(例如磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4))平衡过的蛋白A或G琼脂糖凝胶FF柱。洗涤柱子以移除非特异性结合组分。例如，通过pH梯度 (例如O. IM磷酸钠缓冲液pH 6. 8至O. IM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0)洗脱结合的抗体。例如通过SDS-PAGE检测抗体级分，之后混合。根据预期的用途，额外的纯化是任选的。可以使用常规技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可以通过常规技术(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析)有效地移除可溶性聚合物和多聚体。在这些层析步骤后的抗体纯度大于99%。产物可以在-70°C立即冷冻或可以冻干。这些示例性抗体的氨基酸序列提供如下。
表I-抗体 SEQ ID NO
权利要求
1.人的工程CGRP抗体，所述抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含LCDRl、LCDR2、LCDR3氨基酸序列并且HCVR包含HCDRl、HCDR2、HCDR3氨基酸序列，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO : 10，LCDR2 是 SEQ ID NO : 11，LCDR3 是 SEQ ID NO 5, HCDRl 是 SEQ ID NO 12, HCDR2 是 SEQ ID NO 37 并且 HCDR3 是 SEQ ID NO :38，其中人 CGRP 抗体结合人CGRP。
2.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是RASQDIDNYLN(SEQID N0:3)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTCDTRYIQKFAG (SEQ ID NO 13)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)。
3.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是RASQDIDNYLN(SEQID N0:3)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)。
4.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是RASKDISKYLN(SEQID N0:6)，LCDR2 是 YTSGYHS (SEQ ID NO 7)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO : 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO 16)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
5.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是RASRPIDKYLN(SEQID NO :8)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
6.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCDRl是RASQDIDKYLN(SEQID N0:9)，LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO : 7)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO : 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
7.权利要求I的人的工程CGRP抗体，其中LCVR氨基酸序列是SEQID N0:42并且HCVR 氨基酸序列是SEQ ID NO 43o
8.权利要求2的人的工程CGRP抗体，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 17并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :22。
9.权利要求3的人的工程CGRP抗体，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 18并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :23。
10.权利要求4的人的工程CGRP抗体，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 19并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :24。
11.权利要求5的人的工程CGRP抗体，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO 20并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :25。
12.权利要求6的人的工程CGRP抗体，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO 21并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :26。
13.权利要求8的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中轻链氨基酸序列是SEQ ID NO :27并且重链氨基酸序列是SEQ ID NO :32。
14.权利要求9的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中轻链氨基酸序列是SEQ ID NO :28并且重链氨基酸序列是SEQ ID NO :33。
15.权利要求10的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中轻链氨基酸序列是SEQ ID NO :29并且重链氨基酸序列是SEQ ID NO :34。
16.权利要求11的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中轻链氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且重链氨基酸序列是SEQ ID NO :35。
17.权利要求12的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中轻链氨基酸序列是SEQ ID NO 31并且重链氨基酸序列是SEQ ID NO :36。
18.权利要求13的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO :27并且每条重链的氨基酸序列是SEQ ID NO :32。
19.权利要求14的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO :28并且每条重链的氨基酸序列是SEQ ID NO :33。
20.权利要求15的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO :29并且每条重链的氨基酸序列是SEQ ID NO :34。
21.权利要求16的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且每条重链的氨基酸序列是SEQ ID NO :35。
22.权利要求17的人的工程CGRP抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO :31并且每条重链的氨基酸序列是SEQ ID NO :36。
23.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-22中任一项的人的工程CGRP抗体和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
24.治疗骨关节炎疼痛的方法，所述方法包含向有需要的人类患者施用权利要求1-22 中任一项的人的工程CGRP抗体。
25.如权利要求1-22中任一项所要求的人的工程CGRP抗体，其用于疗法。
26.如权利要求1-22中任一项的人的工程CGRP抗体，其用于治疗骨关节炎疼痛。
27.权利要求1-22的任一项的人的工程CGRP抗体在用于生产治疗骨关节炎疼痛的药物中的用途。
28.治疗偏头痛的方法，所述方法包含向有需要的人类患者施用权利要求1-22中任一项的人的工程CGRP抗体。
29.
30.用途。
31.权利要求1-22中任一项的人的工程CGRP抗体，其用于治疗偏头痛。权利要求1-22的任一项的人的工程CGRP抗体在用于生产治疗偏头痛的药物中的权利要求1-22或25-28中任一项的人的工程CGRP抗体的抗原结合片段。
全文摘要
本发明提供了人的工程降钙素基因相关肽(CGRP)抗体或其抗原结合片段。此外，本发明提供了人的工程降钙素基因相关肽(CGRP)的抗体或其抗原结合片段用于治疗骨关节炎疼痛的用途。
文档编号A61K39/395GK102946905SQ201180028611
公开日2013年2月27日 申请日期2011年6月7日 优先权日2010年6月10日
发明者B·艾伦, R·J·本朔普, M·G·钱伯斯, R·J·达林 申请人:伊莱利利公司