金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途的制作方法

专利名称：金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途的制作方法
金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途相关申请的交叉引用本申请要求在2010年5月5日提交的美国临时专利申请号No. 61/331,550的优先权，其通过引用并入本文。序列表本申请包括了一份通过EFS-Web提交的序列表，其公开内容在此参考并入。所述ASCII拷贝创建于2011年5月2日，并被命名为Sequence Listing_StaphylococcusAureusLeukocidins ST25.txt,大小为 102Kb。
背景技术：
金黄葡萄球菌或“葡萄球菌”通常可在人和动物的皮肤或鼻孔内发现。葡萄球菌一般情况下是无害的，除非其通过切口或其他伤口进入身体。在健康人身上，典型的葡萄球菌感染是很小的皮肤问题。以前，葡萄球菌感染使用广谱抗菌素，如甲氧西林进行治疗。然而，现在出现了一些耐药葡萄球菌菌株，其对甲氧西林和其他￠-内酰胺类抗生素，如青霉素和头孢菌素有耐药性。它们被称为甲氧西林耐药性金黄葡萄球菌(也称多药耐药性金黄葡萄球菌，或"MRSA ")。葡萄球菌感染，包括MRSA，开始通常为类似丘疹、疖子或蜘蛛咬伤一样的小红肿包。这些肿包或缺损可能很快转化为需要外科手术排脓治疗的深度、疼痛型脓肿。有时，细菌仅限于皮肤。在有些情况下，它们可能深入到身体内部，并可能导致危及生命的人体多个组织的感染，包括皮肤、软组织、骨头、关节、外科手术伤口、血液系统、心脏瓣膜、肺部、或其他器官。因此金黄葡萄球菌感染可能变成致命性疾病，例如，坏死性筋膜炎、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征以及各种形式的肺炎。在医院或医疗环境下MRSA感染是特别麻烦的，患者常常会有开放性创伤、侵入性器械和免疫系统衰弱，所以比在公共场合中有更高的感染风险。没有遵循正确卫生程序的操作人员可能将MRSA细菌从一名患者传递给另外一名患者。 金黄葡萄球菌产生一系列的不同的毒力因子和毒素，它们能使该细菌中和并抵抗各种类型免疫细胞的攻击，特别是白细胞的亚群，白细胞组成身体主要抵御系统。这些毒力因子和毒素的产生可以让金黄色葡萄球菌保持感染状态。参见Nizet，J. AllergyClin.1mmunol. 120 :1322(2007)。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌可产生各种双组分的白细胞毒素，这些毒素通过两种非结合的蛋白或亚单位的协同作用破坏宿主防御细胞和红细胞的细胞膜。参见，Supersac,等,Infect.1mmun. 61 :580_7 (1993)。在这些双组分的白细胞毒素中，Y-溶血素(HlgAB和HlgCB)和潘通-瓦伦丁(Pantone-Valentine)杀白细胞素(PVL)是最具代表的。杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两个组分的作用。第一个亚单位命名为S亚单位级(即，慢洗脱的亚单位)，第二个亚单位命名为F亚单位级(即，快洗脱的亚单位)。S亚单位和F亚单位协同作用可在白细胞上形成孔洞，白细胞包括单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞(统称为吞噬细胞)。参见，Menestrina，等，Toxicol. 39 1661-1672(2001)。双组分的毒素在靶细胞膜上形成孔洞的机制还没有完全了解。这些毒素可能的作用机制包括S亚单位与靶细胞膜的结合，该结合很可能是通过一个受体，然后F亚单位结合到S亚单位上，从而形成一个低聚物，该低聚物形成了插入靶细胞膜的前孔洞(Jayasinghe,等，Protein. Sc1. 14 :2550-2561 (2005))。双组分白细胞毒素形成的孔洞是典型的阳离子选择性的。孔洞的形成会导致细胞的裂解死亡，已有报道在白血球细胞中，其裂解死亡是由于阳离子汇集导致的渗透压不平衡所致(Miles，等，Biochemistry 40 8514-8522(2001))。除了PVL (即 S/F-PV 或 LukSF-PV)以及 Y -溶血素(HlgAB 和 HlgCB)，金黄色葡萄球菌产生的双组分组成中还包括杀白细胞素E/D(LukED)和杀白细胞素M/F’ (LukMFj )。因此，这些双组分杀白细胞素的S亚单位包括HlgA、HlgC, LukE, LukS-PVjP LukM，F亚单位包括HlgB、LukD> LukF-PVjP LukF’ -PV (Menestrina,等，如上所述)。金黄色葡萄球菌的S-和F-亚单位不是杀白细胞素所特有的。即，其可以相互替换，这就使其他的双组分组合可以在白血球细胞上形成功能性孔洞，从而大大增加了杀白细胞素的组成(Meyer，等，Infect. Tmmun. 77 13-22(2009))。开发对MRSA感染的有效治疗已经变得很有必要。除了对前述的甲氧西林和相关 的抗生素的耐药性，MRSA还发现对大环内脂类(如，红霉素)、β-内酰胺酶抑制剂复合物(如，舒巴坦、奥格门汀)以及氟喹诺酮类(如，环丙沙星)，还有克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑(复方新诺明)和利福平具有显著的抗药性。在严重的金黄色葡萄球菌感染中，临床医生已经开始使用静脉给予万古霉素。然而，金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药已有报道。所以，有必要开发可以有效抵抗金黄色葡萄球菌感染的新型抗菌药物。发明概述申请人:发现并鉴定了金黄色葡萄球菌天然存在的防御系统中的另外一个双组分成员。新鉴定的天然S亚单位多肽组分在本申请中被称为“LukA”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70%的相似性。因此，本发明的一方面涉及LukA的分离和/或纯化。本发明的另一方面涉及编码LukA的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组LukA的方法。新鉴定的F亚单位多肽组分在本申请中被称为“LukB”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70%的相似性。因此，本发明的一方面涉及LukB的分离和/或纯化。本发明的另一方面涉及编码LukB的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组LukB的方法。然而，本申请的另外一方面涉及治疗组合物，该组合物含有制备于药学上可接受的药物载体中的治疗有效量的LukA和/或LukB，可用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗。因此，在一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukA。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukB。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的LukA和LukB。在其他实施方式中，组合物包含LukA的类似物，其缺少IOC-端残基且没有毒性(本申请中称为LukA Δ IOC或rLukA Δ 10C)。这些组合物具有多种治疗用途。在一些实施方式中，组合物称为抗炎组合物，并可被用于治疗急性炎症或疾病，特别是局部急性炎症情况。
这些用途运用了申请人的其他发现，即在生理条件下(即，LukAB直接由金黄色葡萄球菌产生)，LukAB复合物对吞噬细胞具有特别的特异性，而对其他有核细胞则无，所述有核细胞例如上皮细胞和内皮细胞。也就是说，复合物在这些种类的细胞膜上形成孔洞，从而导致细胞死亡，这在本申请中称为“LukAB介导的细胞毒性”。另外一方面，LukAB对其他有核哺乳动物细胞具有相对较小或可忽略不计的特异性。因此，本发明的抗炎组合物利用了 LukAB对人类吞噬细胞的特异性作用，来针对性治疗急性炎症，该炎症的特点为大量吞噬细胞对炎症部位的浸润。在其他实施方式中，治疗组合物可被称为(活性)疫苗组合物。该组合物可被用于在患者身上诱导产生中和性抗-LukA和抗-LukB抗体，所述患者具有感染金黄色葡萄球菌的风险或被诊断为金黄色葡萄球菌感染，如MRSA。本发明的其他方面涉及特异性结合LukA的抗体、特异性结合LukB的抗体、包含LukA和/或LukB抗体的治疗用复合物、以及使用它们治疗金黄色葡萄球菌感染。这些治疗组合物可被称为被动疫苗组合物。因此，在一个实施方式中，这些治疗组合物中包含治疗有 效量的抗-LukA抗体。在另一个实施方式中,这些治疗组合物中包含治疗有效量的抗-LukB抗体。在另一个实施方式中，这些治疗组合物中包含治疗有效量的抗-LukA抗体和抗-LukB抗体。本发明的被动和主动疫苗组合物运用了申请人的其他发现，即感染性的、恶性的金黄色葡萄球菌菌株，例如MRSA表达LukA和LukB。大量金黄色葡萄球菌菌株间LukA和LukB的保守性使本发明的疫苗可以提供全谱的治疗效果。LukA、LukB、抗LukA抗体、抗LukB抗体在本申请中也被称为活性剂。本发明还进一步涉及使用LukAB、LukA、和/或LukB鉴定LukAB介导细胞毒性抑制剂的方法。这些方法可能会利用LukAB复合物本身，与吞噬细胞或吞噬细胞膜结合部分的组合。由此鉴定的抑制剂可以是候选药物用于金黄色葡萄球菌感染治疗。本发明进一步涉及预测或评价金黄色葡萄球菌感染严重性的方法，该方法检测来自感染对象的生物样品中LukA和/或LukB的存在情况及量，或检测其中LukA和/或LukB的相应基因。本发明的这一方面是以申请人的进一步发现为基础的，在许多金黄色葡萄球菌产生的细胞毒素中，LukAB会表现出很强的人类吞噬细胞毒性。因此，相对于对照(例如金黄色葡萄球菌菌株USA100和USA400)产生少量或无法检测到的LukA和/或LukB，如检测到LukA和/或LukB或其对应基因(如，金黄色葡萄球菌菌株Newman、4645、和MRSA菌株USA300和USA500)的存在或具有相对高的表达量，可以指示存在严重的金黄色葡萄球菌感染。本发明的上述和其他方面将在下文中进行详细描述。附图简要说明

图1为LukA的主要序列(命名为SEQ ID NO. 1)和来自金黄色葡萄球菌13个不同菌株对应的LukA多肽(命名为SEQ ID NOS. :2_14)的氨基酸序列比对情况。图2为LukB主要序列(命名为SEQ ID NO. 15)和来自金黄色葡萄球菌12个不同菌株对应的LukB多肽(命名为SEQ ID N0S. 16-27)的氨基酸序列比对情况。图3 =LukAB是很强的葡萄球菌细胞毒素，其靶向并杀死主要的人类吞噬细胞。(a)用金黄色葡萄球菌菌株Newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液(2. 5% v/v)对人主要外周血单核细胞(PBMC)进行攻毒。细胞存活情况使用CellTiter进行检查，使用培养基处理的细胞设置为100%。结果显示为三份重复样品的平均值+标准偏差(S.D.)。(b)用金黄色葡萄球菌菌株Newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液(2. 5% v/v)对人主要单核细胞、吞噬细胞、和树突状细胞(DC)进行攻毒。细胞存活情况使用前述方法进行检查。结果显示为两个供体的平均值，每一个供体的细胞都用三份独立制备的胞外蛋白制剂对其攻毒，+S.E.M。(c)用金黄色葡萄球菌菌株Newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液的不同稀释液对原代人中性粒细胞(PMN)进行攻毒。细胞存活情况使用前述方法进行检查。结果显示为四名供体的PMN平均值土S.E.M.。(d)用纯化的rLukA、rLukB、或rLukA和rLukB组合物以所示浓度对原代人PMN细胞进行攻毒。*指的是与rLukA和rLukB都具有统计上的显著性，P < O. 05。对于(a_c) *指的是与野生型(WT)具有统计上的显著性，**指的是与ALukAB/p有统计上的显著性，P < O. 05 (Student，s t检验，p< O. 05)。图4 =LukAB优先靶向人类吞噬细胞。攻毒实验(a、c和d)PMN_HL60或(b)THPl细胞，用金黄色葡萄球菌野生型(WT)菌株Newman、缺少所示基因/毒素的同基因突变株的培养物滤液的不同稀释度进行攻毒，(c)用含有空质粒的金黄色葡萄球菌WT (WT/p)，缺少LukAB并含有空质粒的菌株(Λ LukAB/p)，以及缺少LukAB并含有LukAB互补质粒的菌株(Δ LukAB/pLukAB)的培养物滤液进行攻毒，或(d)用所示浓度的纯化重组LukA(rLukA)、LukB(rLukB)、或rLukA和rLukB的组合(rLukA+rLukB)进行攻毒。对于同时用rLukA和rLukB的攻毒,总蛋白浓度为等量的rLukA和rLukB (如,2. 8 μ g的总蛋白与1. 4 μ g的rLukA和1. 4 μ g的rLukB相等)。(e)用10 μ g/ml rLukAB对所示人类细胞系攻毒。细胞存活情况使用CellTiter进行检查，使用培养基处理的细胞设为100%。结果显示为三份重复样品的平均值土标准偏差(S.D.)。星号(*)表示与WT相比具有统计学显著性差异(单因素方差分析(One-way AN0VA))。图5 :LukAB是不同葡萄球菌菌株中的重要毒素。(A)使用抗-LukB的多克隆抗体血清，通过免疫印迹分析不同金黄色葡萄球菌的LukB表达情况。(B)使用不同金黄色葡萄球菌胞外蛋白的稀释液对PMN-HL60细胞进行攻毒。细胞存活情况使用CellTiter进行检查，其中用培养基处理的细胞设为100%存活。(C)使用毒素特异性血清，通过免疫印迹分析测定WT和LukAB同基因菌株的LukB和α -毒素的表达情况。(D)来自WT菌株Newman (New)和4645、以及LukAB同基因菌株的胞外蛋白对PMN-HL60细胞攻毒。细胞存活测定情况见B。结果为三份重复样本的平均值+S. D.。*表示与Newman (C)或WT (E)相比有统计学上的显著性(Student’ s t检验，p < O. 05)。图6 LukAB破坏目标细胞的胞质膜。(a) PMN-HL60细胞的光学显微镜照片，PMN-HL60用金黄色葡萄球菌WT菌株和同基因LukAB缺陷型(ALukAB)的培养物滤液进行攻毒。(b-c) WT菌株(WT/p)、同基因LukAB缺陷型菌株(Λ LukAB/p)、互补菌株(Λ LukAB/PLukAB)培养物滤液的攻毒，或用培养基攻毒的模拟。细胞膜破损细胞使用SYTOX绿染色，使用荧光显微镜成像(c)并测定绿色荧光的强度(b)。(d)用金黄色葡萄球菌菌株Newman (MSSA)或USA300菌株LAC (MRSA)和所示同基因突变株，以不同的感染复数(MOI)对PMN细胞进行体外感染。用SYTOX绿检查膜破损情况。结果显示为三份重复样品的平均值土标准偏差(S.D.)。星号(*)表示与WT相比具有统计学显著性差异(Student’s t检验，P < O. 05)。图7 :通过靶向和杀伤吞噬细胞，LukAB保护金黄色葡萄球菌避免宿主介导的杀伤作用。(a)用金黄色葡萄球菌WT、LukAB缺陷型菌株、和LukAB缺陷型及具有LukAB互补的菌株(Λ lukAB/plukAB)，以不同的感染复数(MOI)对PMN-HL60细胞进行感染。如图6所示，用SYTOX绿检查哺乳动物细胞的细胞膜损伤。结果显示为三份重复样品的平均值土标准偏差(S.D.)。(b)所示金黄色葡萄球菌体外感染人类全血后的存活情况。结果为12名供体全血的平均值+S. E. M.。(c)所示金黄色葡萄球菌Newman菌株体外感染原代人中性粒细胞(PMN)后的存活情况。结果显示为12名供体的PMN平均值+S. E. M.。(d)用WT/p、Δ lukAB/p、和Λ lukAB/plukAB菌株培养物滤液的不同稀释度对原代人PMN的攻毒。测定LDH-释放作为细胞裂解的指标。结果显示为6名供体的PMN平均值+S.E.M.。星号(*)表示与WT菌株Newman相比具有统计学显著性差异(Student’ s t检验，p < O. 05)。图8 =LukAB对金黄色葡萄球菌体内发病的重要性。(a)小鼠肾的生物性发光图像，小鼠用含有PXenl或pLukAB. Xenl的WT金黄色葡萄球菌LAC菌株感染。图片显示了每组中具有代表性的代表性两只小鼠的肾。(b)小鼠肾脏回收的载菌量，小鼠用所示金黄色葡萄 球菌LAC菌株感染。每个数据点表示各动物每毫升组织匀浆中的菌数(CFU)虚线表示检测限。对于栏(A-C和E)*表示与WT具有统计学显著性差异，**表示与Λ LukAB/p具有统计学显著性差异，P < O. 05。图9 =LukAB通过在细胞膜上形成孔洞杀伤人吞噬细胞。(a)使用rLukA+rLukB对PMN-HL60细胞攻毒，通过SDS-PAGE和免疫印迹进行检测毒素结合情况，使用LukA或LukB的特异抗体。(b) PMN-HL60与rLukAB进行孵育，通过FACS检测毒素的结合情况，使用兔抗His抗体。(c)用rLukAB对PMN-HL60细胞攻毒，通过SDS-PAGE和免疫印迹进行检测质膜中LukAB寡聚体的形成，使用抗-LukB抗体。(d)在有或者没有PEG-400的情况下，用rLukAB或皂苷攻毒处理PMN-HL60细胞。LukAB孔洞用溴化乙锭进行检测。(e) PMN-HL60细胞存活情况用CellTiter进行测定，用培养基处理的细胞设为100%。d和e栏中的结果为三个样品的平均值+/SEM。星号(*)表示与-PEG(d-e)相比具有统计学显著性差异(Student’s t检验，P < O. 05)。图10 =LukAB细胞毒可以被a -LukA的多克隆抗体所中和。用5% (v/v)的金黄色葡萄球菌菌株Newman的培养物滤液对PMN-HL60细胞进行攻毒，该菌株已用来自两只不同兔子不同采血的a-LukA多克隆抗体或免疫前血清以所示量进行孵育。细胞存活情况使用CellTiter进行检查，用培养基处理的细胞设为100%。结果显示为三份重复样品的平均值土标准偏差(S. D.)。图11 =LukA的C端延伸对LukAB的毒性作用是必须的，但对a -LukA多克隆抗体的识别是不需要的。(a)使用Lasergene软件的MegAlign Clustal W算法对不同金黄色葡萄球菌淋巴细胞毒性S亚单位氨基酸序列(命名为SEQ ID NOS 44-49)的比对。只在LukA序列中出现的N端和C端延伸使用黑框进行了强调。(b)从E. coli中纯化和用SDS-PAGE分离的 2 μ g 重组 LukA (rLukA)、LukB (rLukB)、缺失 C 端延伸的 LukA (rLukA Δ 10C)和缺失N端延伸的LukA(rA33NlukA)的考马斯蓝染色，以及用不同量的搭配rLukB的rLukA、rLukAA IOC^Pr Λ 33NLukA 对 PMN-HL60 细胞攻毒。终蛋白浓度为等量的 rLukA、rLukAA IOC或r Λ 33NLukA和rLukB的量。结果显示为三份重复样品的平均值土标准偏差(S. D.)。(c)免疫印迹显示a -LukA和a -His多克隆抗体对6xHis_标记的rLukA Δ IOC具有相同的识别能力。发明详述下面的公开，按先后次序分别涉及LukA多肽、LukB多肽、LukA和LukB多肽、抗-LukA和抗-LukB抗体,包含LukA和/或LukB的治疗组合物、或抗-LukA和/或抗-LukB的抗体、使用该治疗组合物的方法、LukAB-介导的细胞毒的抑制剂的鉴定方法以及预测或评价金黄色葡萄球菌感染严重程度的方法。LukA 多肽来自金黄色葡萄球菌的多肽现在已被申请人分离并鉴定，其表现出已知的S亚单位杀白细胞素(例如，LukS-PVULukE和HlgC)活性谱。这些肽在本申请中被称为LukA，特 异性靶向和结合人类吞噬细胞(但不靶向和结合人上皮细胞或人内皮细胞、或鼠源细胞)，而且一旦结合到吞噬细胞膜上，LukA就和金黄色葡萄球菌的F亚单位杀白细胞素(如，本申请中公开的LukF-PVULukD和HlgB、和LukB)寡聚化，且寡聚化时形成将跨膜的孔洞(统称为LukA活性)。图1中的比对包含LukA的主要序列(本申请中命名为SEQ IDN0. 1)以及来自13个不同的金黄色葡萄球菌菌株对应的LukA多肽(本申请中命名为SEQID N0S.2-14)的氨基酸序列。每个SEQ ID NOS : 1_14的N端27个氨基酸残基为天然的分泌/信号序列。因此，成熟、分泌型的LukA，其为每个SEQ ID NOS :1-14序列中的28-351个残基，在本申请中可称为“LukA(28-351) ”或“成熟LukA”。对应的，未成熟形式的LukA在本申请中可称为“LukA(1-351) ”。基于SEQ ID NOS :2-14(相对天然的金黄色葡萄球菌是不全面的)的LukA共有序列，包含了 LukA最少64个位点的变异性(其中连续的变异位点为X1-X64)，指的是如下位点8 (X1 = L 或 F)、16 (X2 = A 或 V)、17 (X3 = I 或 L)、24 (X4 = T 或 N)、26 (X5 = Q 或 E)、31 (X6 = H或N)、38(X7 = N或 T)、46(X8 = S 或 A)、50(X9 = E 或 D)、55 (X10 = T 或Ν)、56(Χη=N 或 D)、61(X12 = S 或 T)、62(X13 = T 或 P)、63(X14 = A、G 或 V)、73 (X15 = I 或 V)、78(X16=E 或 V)、77(X17 = T 或 S)、80(X18 = V 或 E)、83(X19 = E 或 K)、84 (X20 = E 或 K)、105 (X21=V 或 I)、124 (X22 = K 或 R)、125 (X23 = E 或 N)、127 (X24 = K、T 或 N)、129 (X25 = S 或 Α)、130 (X26 = N 或 S)、135 (X27 = K 或 Q)、146 (X28 = R 或 S)、148 (X29 = R 或 P)、173 (X30 = S 或N)、174(X31 = S 或 L)、181(X32 = T 或 V)、184 (X33 = I 或 V)、195 (X34 = T 或 S)、202 (X35 = N或 K)、208 (X36 = S 或 I) ,214 (X37 = W 或 R)、221 (X38 = I 或 V)、229 (X39 = G 或 N)、231(X40=V 或 I)、237 (X41 = E 或 D)、239 (X42 = L 或 F)、243 (X43 = N 或 T)、246 (X44 = I 或 L)、247 (X45 = A 或 S)、278 (X46 = L 或 I)、283 (X47 = S 或 T)、285 (X48 = E 或 D)、288 (X49 = Q 或R)、299 (X50 = I 或 V)、303 (X51 = R 或 K)、309 (X52 = A 或 G)、310 (X53 = P 或 Q)、315 (X54 = K或 Q) >318 (X55 = D 或 E)、322 (X56 = L 或 F)、325 (X57 = T 或 V)、338 (X58 = V 或 I)、339 (X59=D 或E)、342(X6° = S 或 T)、344(X61 = D、E 或 Q)、347 (X62 = P 或 S)、348 (X63 = Y 或F)、和349 (X64 = K 或 R)。LukB 多肽来自金黄色葡萄球菌的多肽现在已被申请人鉴定，其表现出已知的F亚单位杀白细胞素(例如，LukF-PVL, LukD和HlgB)活性谱。这些多肽在本申请中被称为LukB，其与金黄色葡萄球菌S亚单位杀白细胞素特异性聚合(如，本申请中公开的LukS-PVL、LukE和HlgCjP LukA)，其可结合到人吞噬细胞上；且在寡聚化时在吞噬细胞上形成一个跨膜的孔洞(本申请中统称为LukB活性)。图2中所示的比对包含LukB的主要序列(本申请中命名为SEQ ID NO. 15)以及来自12个不同金黄葡萄球菌菌株对应的LukB多肽(本申请中命名为SEQ ID NOS. 16-27)的氨基酸序列。每个SEQ ID NOS 15-27的N端的29个氨基酸残基为分泌/信号序列。这样，成熟、分泌型的LukB，其为每个SEQ ID NOS :16-27序列中的30-339个残基，可被称为“LukB (30-339) ”或“成熟LukB”。对应的，未成熟形式的LukB可称为“LukA (1-339) ”。基于SEQ ID NOS : 15_28 (相对于天然的金黄色葡萄球菌LukB是不全面的)的LukB共有序列，包含了 LukA最少49个位点的变异性( 其中连续的变异位点为X1-X49)，指的是如下位点 ^(X1 = L 或 V)、6(X2 = C 或 Y)、13(X3 = S 或 T)、15(X4 = A 或Τ)、16(Χ5 =L 或 I)、19 (X6 = A或T)、20(X7 = L 或 F)、23(X8 = F或L)、26(X9 = S 或 T)、28(X1Q = Y或F)、34(Xn = E 或 K)、36(X12 = K 或 T)、37(X13 = Q、T 或 A)、46 (X14 = D 或 E)，59 (X15 = S 或T)、60(X16 = Q或Ε)、62(Χ17 = N或K)、64(X18 = T或 S)、75(X19 = P 或K)、95(X2° = K 或 R)、98 (X21 = N、d 或 Ε)、126 (X22 = S 或删除)、159 (X23 = R 或 Q)、163 (X24 = T 或 P)、170 (X25 = S或 K)、187 (X26 = L 或 I)、190 (X27 = S 或 P)、192 (X28 = S 或 T)、193 (X29 = S 或 T)、193 (X29 =H 或 N)、197(X3° = G 或 A)、204(X31 = S 或 L)、222 (X32 = D 或 N)、224 (X33 = T 或 V)、247(X34=N 或 D)、270 (X35 = N 或 K)、272 (X36 = K 或 Ε)、276 (X37 = R、Q 或 K)、287 (X38 = D 或 E)、290 (X39 = L或 I)、294 (X40 = K 或 R)、309 (X41 = Q 或 K)、327 (X42 = D 或 N)、329 (X43 = L或F)、330 (X44 = I 或 V)、332 (X45 = t 或 V)、333 (X46 = f、I 或 L)、336 (X47 = K 或N)、和 338 (X48=K 或 Q)。就一个或多个其他氨基酸的插入、替换或删除而言，LukA和LukB杀白细胞素不同于序列分别为SEQ ID NOS :2-14和16-27的天然多肽，例如，SEQ ID NOS :2_14或16-27的一个或多个氨基酸残基可能被另外一个具有相似极性的氨基酸取代，具有相似极性的氨基酸以功能性等价物发挥作用，从而产生沉默变化。也就是说，相对于天然序列的变化不能明显减小天然LukA和LukB的基本特征。例如SEQ ID NOS :1和15。LukA或LukB的任何此类类似物都可按照本申请中公开的实验方案进行检测(例如，细胞毒性实验和膜损伤实验)，以确定其是否维持了天然的LukA或LukB活性。这些杀白细胞素内的替换可以从这些氨基酸所属类别中的其他成员中选择。例如，非极性(疏水性的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。阳离子(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在其他实施方式中，非保守型变化(例如，一个或多个氨基酸替换、删除和/或增加)可用于LukA和LukB的失活或减毒。在一个实施方式中，非毒性LukA类似物C端342-351位的氨基酸被删除，因此与天然多肽不同。除了 SEQ ID NOs :4_6 (在这些位点包含9个氨基酸)，类似物缺少了 10个C-端氨基酸残基。这些类似物统称为LukA Δ IOC0减毒的LukA和LukB可用于本申请所述的活性疫苗组合物中。分子修改可以通过本领域内熟知的方法进行，包括在质粒模板上引物延伸，可使用单链模板(Kunkel,Proc. Acad. Sc1.,USA82 :488-492(1985))、双链DNA 模板(Papworth，等，Strategies 9(3) :3_4 (1996))、以及PCR 克隆(Braman，J. (ed.)，IN VITRO MU TAGENESIS PROTOCOLS, 2nd ed · Humana Press,Totowa, N. J. (2002))。确定LukA或LukB上特定分子的变化是否降低LukAB毒性的方法，在本申请中有描述。因此，根据上文所述及本发明的目的，LukA可以以SEQ ID NOS : 1-14(例如，SEQIDNO :2，其为来自于金黄色葡萄球菌Newman菌株的LukA多肽)中的任何一个进行更加广泛地描述，或者是与其有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。类似的，鉴于上文所述及本发明的目的，LukB可以以SEQ ID NOS : 15-27 (例如，SEQID NO 27,其为来自金黄色葡萄球菌Newman菌株的LukB多肽)中的任何一个进行更加广泛地描述，或者是与其有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。
因此，除非有相反说明，无论是天然LukA和LukB的未成熟和成熟形式、以及与天然的LukA有小于100%序列相似性的序列(即，天然序列和类似物一样，本申请中统称为“LukA”和“LukB”)可被用于本发明的组合物和方法中，以及用于制备本发明中的抗LukA和抗LukB的抗体。编码LukA和LukB的多核苷酸以及合成或分离LukA和LukB的方法 LukA和LukB杀白细胞素可通过本领域内熟知的重组DNA的方法进行合成。例如，下文将描述编码金黄色葡萄球菌(Newman) (SEQ ID NO :2) LukA多肽的核酸序列(命名为SEQ ID NO :28)。编码这一多肽的简并序列(degenerate sequence)(例如,考虑密码子偏好性时，在选择用于重组表达的宿主时有用)、以及编码其他本领域内是熟知的LukA多肽的多核苷酸，或可以由本领域内的专业技术人员进行设计。atgaaaaataaaaaacgtgttttaatagcgtcatcattatcatgtgcaattttattgttaMKNKKRVLIASSLSCAILLLtcagcagcaacgactcaagcaaattcagctcataaagactctcaagaccaaaataagaaaSAATTQANSAHKDSQDQNKKgaacatgttgataagtctcaacaaaaagacaaacgtaatgttactaataaagataaaaatEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNtcaacagcaccggatgatattgggaaaaacggtaaaatcacaaaacgaactgaaacagtaSTAPDDIGKNGKITKRTETVtatgatgagaaaacaaatatactccaaaatttacaattcgactttatcgatgatccaactYDEKTNILQNLQFDFIDDPTtatgacaagaatgtattacttgttaaaaaacaaggctcaattcattcaaatttaaagtttYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFgaatctcataaagaagaaaaaaattcaaattggttaaagtatccaagtgagtaccatgtaESHKEEKNSNWLKYPSEYHVgattttcaagtaaaaagaaatcgtaaaactgaaatattagaccaattgccgaaaaataaaDFQVKRNRKTEILDQLPKNKatttcaactgcaaaagtagacagtacattttcatatagctcaggtggtaaattcgattcaISTAKVDSTFSYSSGGKFDS
权利要求
1.用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的活性剂，所述活性剂包括至少以下一种a)治疗有效量的LukA多肽，其具有SEQ ID NOS : 1_14中任意一个所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NOS :1-14任意一个所示的氨基酸序列具有至少70%序列相似性的序列(“LukA”)；b)治疗有效量的LukB多肽，其具有SEQ ID NOS : 15-27任意一个所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NOS 15-27任意一个所示的序列具有至少70%序列相似性的序列(“LukB”)；c)治疗有效量的抗-LukA抗体,其与LukA特异性结合；或者d)治疗有效量的特异性结合LukB的抗体。
2.根据权利要求1所述的活性剂，其中a)是成熟的LukA多肽。
3.根据权利要求1所述的活性剂，其中a)包含缺乏氨基酸残基的LukA多肽，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NOS 1-14任意一个的342-351位置。
4.根据权利要求1所述的活性剂，其中b)是成熟的LukB多肽。
5.抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的治疗组合物，所述治疗组合物包括如权利要求1所述的活性剂，和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的治疗组合物,所述治疗组合物包括治疗有效量的抗-LukA抗体、治疗有效量的抗-LukB抗体、或治疗有效量的抗-LukA抗体和抗-Luk-B抗体。
7.抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的方法，所述方法包括向所需的哺乳动物对象给予如权利要求5所述的治疗组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述炎症是急性的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述急性炎症是局部的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述急性炎症是皮肤或软组织感染性创伤。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是MRSA感染。
12.鉴定LukAB-介导的细胞毒性的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许LukA和LukB对吞噬细胞进行攻毒的条件下加入LukA和LukB ；b)将a)中的吞噬细胞与可透过细胞或不可透过细胞的检测标记相接触；以及c)检测吞噬细胞摄入的透过性标记的量，将所述量作为b)中的吞噬细胞活力的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照增加，表明细胞活力增强且测试化合物能抑制LukAB介导的细胞毒性，或c')检测吞噬细胞的膜损伤，将其作为不透过性标记的量的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制LukAB介导的细胞毒性。
13.鉴定LukA抑制剂与人吞噬细胞结合的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许LukA与吞噬细胞结合的条件下加入带有可检测标记的LukA ；以及b)检测所述标记的量,将所述量作为LukA与吞曬细胞结合的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制LukA与人吞噬细胞结合。
14.鉴定LukAB寡聚化的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物接触，随后在允许LukA与吞噬细胞结合以及允许LukA和LukB寡聚化的条件下加入LukA和带有可检测标记的LukB ；以及b)检测所述标记的量，将所述量作为LukA和LukB寡聚化的函数,其中所述标记的量相对于至少一种对照减少,表明所述测试化合物抑制LukA和LukB的寡聚化。
15.鉴定人吞噬细胞膜上LukAB孔洞形成的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物接触，随后在允许LukA和LukB对吞噬细胞进行攻毒的条件下加入LukA和LukB ；b)使LukA与吞噬细胞结合，以及LukA和LukB寡聚化；将a)中的吞噬细胞与可检测标记接触，所述可检测标记不可透过非攻毒的吞噬细胞；以及c)检测吞噬细胞摄入所述标记的量，将所述量作为在吞噬细胞膜上LukAB介导孔洞形成程度的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制人吞噬细胞膜上的LukAB孔洞形成。
16.根据权利要求13-15中任意一项所述的方法，其中所述可检测标记是荧光染料。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述荧光染料选自FITC、Cy3、Cy5、APC和PE。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述可检测标记是溴化乙锭。
19.预测金黄色葡萄球菌感染严重程度的方法，所述方法包括a)通过来自感染对象的体液或组织样品，培养来自所述感染对象的金黄色葡萄球菌；以及b)从培养的金黄色葡萄球菌中的LukA和/或LukB进行提取和定量；其中相对于几乎不产生LukA和/或LukB或产生的量不可检测的对照而言，检测到b)中的LukA和/或LukB存在或检测的量相对较高，提示对象感染严重。
20.含有活性剂的组合物，所述活性剂包括作为药物的以下至少一种a)治疗有效量的LukA多肽，其具有SEQ ID NOS :1_14任意一个所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NOS 1-14任意一个所示的序列具有至少70%序列相似性的序列(“LukA”)；b)治疗有效量的LukB多肽，其具有SEQ ID NOS :15-27任意一个所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NOS 15-27任意一个所示的序列具有至少70%序列相似性的序列(“LukB”)；c)治疗有效量的抗-LukA抗体，其与LukA特异性结合；以及d)治疗有效量的特异性结合LukB的抗体。
全文摘要
本申请公开了分离和纯化的金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素，其在本文中被称为LukAB，及其组分LukA和LukB，LukA特异性抗体、LukB特异性抗体、含有LukA和/或LukB的治疗组合物、或抗-LukA和/或抗-LukB的抗体、使用这些组合物治疗急性炎症或金黄色葡萄球菌感染的用途、鉴定LukAB-介导人吞噬细胞细胞毒性抑制剂的方法、以及使用LukAB作为标记物预测金黄色葡萄球菌感染严重性的方法。
文档编号A61K38/16GK103025352SQ201180033386
公开日2013年4月3日 申请日期2011年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者V·J·托雷斯, A·L·杜蒙特 申请人:纽约大学