专利名称：用于递送治疗剂和/或诊断剂的体内无铜催化的点击化学的制作方法
用于递送治疗剂和/或诊断剂的体内无铜催化的点击化学相关申请案本申请要求2010年12月2日提交的美国专利申请N0.12/958，889和2010年12月2日提交的美国专利申请N0.61/419，082的优先权。每个优先权申请通过引用整体并入本文。序列表本申请含有已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并据此通过引用整体并入的序列表。2011年11月17日创建的所述ASCII拷贝命名为I丽310W0.txt并且大小为24，970字节。领域本发明涉及用(例如)在PET或NMR体内成像中有用的18F或19F标记肽或其它分子的方法。优选地，通过可与蛋白质、肽或其它分子共价连接的螯合部分使18F或19F与铝或另一种金属连接成缀合物[络合物]。使用本文描述的技术，可在30min或更少时间内制备具高比活度的18F或19F标记分子并且适合用于成像技术中，无需HPLC纯化标记分子。可在适合体内直接使用的盐介质中进行标记。在替代性实施方案中，可添加有机溶剂以提高标记效率。尽管出于某些目的例如试剂盒配制，可添加稳定剂，例如抗坏血酸、海藻糖、山梨糖醇或甘露糖醇，但是标记分子在体内条件下稳定。在优选实施方案中，可在体内，例如使用抗体、抗体片段或包含活化部分，例如环辛炔、硝酮或叠氮化物的其它靶向分子生成18F或19F标记分子。向受试者施用抗体或其它靶向分子并留出足够时间以定位于靶组织后，施用包含相应活性基团，例如叠氮化物、硝酮或环辛炔的18F或19F标记的可靶向构建体。可靶向构建体与靶向分子在原位形成共价键并且可为共价络合物成像。技术人员将认识到，所述组合物和方法不限于和18F或19F标记部分一起使用，但是可用于递送可与适当活性基团连接，同时保持功能活性的任何诊断剂和/或治疗剂。非限制性实例包括药物、毒素、放射性同位素、激素、酶、免疫调节剂、细胞因子、siRNA、抗血管生成剂、生长因子、促凋亡剂、细胞毒素剂、光敏治疗剂、化疗剂、染料、造影剂、荧光标记、化学发光标记、增强剂和顺磁离子。点击化学反应也不限于在体内使用，但是也可在体外使用以生成非常稳定的缀合物。
背景技术：
正电子发射断层显像(PET)已成为诊断医学中最突出的功能成像方式之一，灵敏度非常高(fmol)、分辨率高(4-10mm)并且可充分量化组织增生(Volkow等，1988，Am.J.Physiol.1maging3:142)0 虽然在肿瘤学中[18F]2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖([18FjFDG)是最广泛使用的功能显像剂(Fletcher等,2008，J.Nucl.Med.49:480),但是对研发用于功能成像以补充并增强解剖成像方法的其它标记化合物有浓厚兴趣(Torigian等，2007，CACancer J.Clin.57:206)，特别是用目前使用的混合PET/计算机断层成像系统。因此，需要有使发射正电子的放射性核素与各种生物和医学目标分子缀合的简便方法。可用正电子发射体18F、 64CU、nC、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、86Y和124I标记肽或其它小分子。PET同位素的低发射能满足需要以在其产生通过PET相机成像的2个511keV Y射线之前将正电子离开靶位点的距离减到最小。发射正电子的许多同位素在其衰变链中还具有其它发射物例如Y射线、α粒子或β粒子。还需要具有为纯正电子发射体的PET同位素，以致将最小化所有剂量学问题。同位素的半衰期也很重要，因为半衰期必须足够长以使同位素与靶向分子连接，将其注射至患者体内，使产物定位，从非靶组织中清除，然后成像。如果半衰期太长，比活度可能不够高以获得清晰成像的足够光子，并且如果半衰期太短，生产、商业流通和生物分布的所需的时间可能不足。因为其正电子发射能低，无侧向发射并且有适合半衰期，所以18F(i3 +635keV97%，t1/2110min)是最广泛使用的PET发射同位素之一。常规性地，通过使18F与碳原子结合使18F与化合物连接(Miller等，2008，AngewChem Int Ed47:8998-9033),但是也已经报道了与娃(Shirrmacher 等，2007，Biocon jCheml8:2085-89 ;Hohne 等，2008，Bioconj Cheml9:1871-79)和硼(Ting等，2008，FluorineCheml29:349-58)的连接。与碳的结合通常牵涉多步合成，包括多个纯化步骤，这对于半衰期为IlOmin的同位素而言存在问题。18F标记肽的当前方法通常牵涉低比活度试剂的标记，试剂的HPLC纯化，然后与目标肽缀合。在缀合后常常再纯化缀合物以获得标记肽的所需比活度。实例为Poethko等的标记方法(J.Nucl.Med.2004; 45:892-902)，其中首先合成并纯化 4_[18F]氟苯甲醒(Wilson 等，J.Labeled Compounds and Radiopharm.1990; XXVI11:1189-1199)，然后与肽缀合。然后通过HPLC纯化肽缀合物以去除用于驱动缀合完成的过量肽。其它实例包括用琥珀酰[18F]氟苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992，Int.J.Rad.Appl.1nstrum.B19:275) > 其它酸基化合物(Tada 等，1989，Labeled Compd.Radiopharm.XXVI1: 1317 ；ffester 等，1996, Nucl.Med.Biol.23:365 ；GuhIke 等，1994, Nucl.Med.Biol21:819)或点击化学加成物(Li 等，2007，Bioconjugate Chem.18:1987)标记。这些方法的总合成和配制时间范围介于l_3h之间，大部分时间专用于标记肽的HPLC纯化以获得体内靶向所需的比活度。半衰期为2h，使18F与肽连接所需的所有操作是很大的负担。进行这些方法也很乏味并且需要使用特别设计用于生成标记产物的设备和/或专业化学家的努力。它们也不利于临床环境中可常规性使用的试剂盒制剂。需要快速简单的18F标记靶向部分例如蛋白质或肽的方法，所述方法产生具有适合比活度和体内稳定性以便检测和/或成像的靶向构建体，同时将对专用设备或高度培训人员的需求减到最少并且减少了操作人员对高水平辐射的暴露。更优选地，需要制备用于预靶向技术中的18F标记靶向肽的方法。进一步需要可提供进行此类新方法所需的组合物的预包装试剂盒。发明概述在各个实施方案中，本发明涉及与用于PET或NMR成像的18F或19F标记分子相关的组合物和方法。如本文所讨论，本申请提到18F时，技术人员将认识到可利用18F、19F或另一种结合金属的放射性核素。在示例性方法中，18F与金属结合并且18F-金属络合物与肽或其它分子上的配体连接。如以下所述，虽然优选铝，但是IIIA族金属(铝、镓、铟和铊)适于18F结合。镥也可能有用。金属结合配体优选为螯合剂，例如ΝΟΤΑ、ΝΕΤΑ、DOTA, DTPA和以下更详细讨论的其它螯合类。可选地，人们可首先使金属与分子连接，然后添加18F以与金属结合。技术人员将认识到， 为了成像的目的，实际上可使任何递送分子与18F连接，只要其含有可修饰，而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作用的可衍生基团。虽然以下实施例主要涉及18F标记肽部分，但是可用18F标记可用其它类型的递送分子，例如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白细胞介素、干扰素、寡糖、多糖、月旨质等，并且可用于成像目的。以下实施例中描述的对18F或其它试剂的预靶向递送有用的示例性可靶向构建体肽包括但不限于包含螯合部分的 MP449、IMP460、IMP461、IMP467, IMP469、IMP470、IMP471、IMP479.1MP485和MP487，所述螯合部分包括但不限于DTPA、N0TA、苄基_Ν0ΤΑ、Ν0ΤΑ的烷基或芳基衍生物、NODA-GA, C-NETA、琥珀酰基-C-NETA和二 -叔丁基-N0DA。在某些实施方案中，示例性18F标记肽可在利用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中用作可靶向构建体。在这种情况下，抗体或片段将包含与疾病或病状相关的靶标，例如肿瘤相关或自身免疫性疾病相关抗原或由病原生物例如病毒、细菌、真菌或其它微生物生成或展示的抗原的一个或多个结合位点。第二结合位点将与可靶向构建体特异性结合。使用双特异性或多特异性抗体的预靶向方法在本领域众所周知(见，例如，美国专利N0.6，962，702，其实施例部分通过引用并入本文)。类似地，与可靶向构建体结合的抗体或其片段在本领域也众所周知，例如与HSG (组氨酸琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体或与In-DTPA结合的734抗体(见美国专利N0.7，429，381,7, 563，439,7, 666，415和7，534，431，各自的实施例部分通过引用并入本文)。通常，在预靶向方法中首先施用双特异性或多特异性抗体并使其与细胞或组织靶抗原结合。在未结合抗体从循环中清除的适当时间后，例如向患者施用18F标记的可靶向构建体并且与位于靶细胞或组织的抗体结合，然后(例如)通过PET扫描获取图像。在替代性实施方案中，可标记与受体例如生长激素抑制素、奥曲肽(octreotide)、铃蟾肽(bombesin)、叶酸盐或叶酸盐类似物、RGD肽或其它已知受体配体直接结合的分子并用于成像。受体靶向剂可包括(例如)TA138、整联蛋白ανβ3受体的非肽拮抗剂(Liu等，2003, Bioconj.Chem.14:1052-56)。在本领域中已知使用金属螯合物的其它受体靶向成像方法并且可用于要求保护的方法的实践中(见，例如，Andre等，2002，J.1norg.Biochem.88:1-6 ；Pearson 等，1996, J.Med., Chem.39:1361-71)。可成像的疾病或病状类型仅受用于靶向与疾病或病状相关的细胞或组织的适合递送分子的可用性限制。已知许多此类递送分子。例如，可通过公开的方法用18F标记与疾病组织或靶标(例如癌)结合的任何蛋白质或肽并用于检测和/或成像。在某些实施方案中，此类蛋白质或肽可包括但不限于与肿瘤相关抗原(TAA)结合的抗体或抗体片段。通过所述方法用18F标记任何已知的TAA结合抗体或片段并且(例如)通过PET扫描或其它已知技术用于肿瘤的成像和/或检测。某些替代性实施方案牵涉使用无铜催化的点击法递送治疗剂和/或诊断剂，例如放射性核素(例如，18F)、药物、细胞毒素剂、毒素、激素、酶、免疫调节剂、细胞因子、siRNA、抗血管生成剂、生长因子、促凋亡剂、细胞毒素剂、光敏治疗剂、化疗剂、染料、造影剂、荧光标记、化学发光标记、增强剂或顺磁离子。优选地，点击化学牵涉包含活化部分(例如环辛炔、硝酮或叠氮基团)的靶向分子例如抗体或结合抗原的抗体片段与包含相应活性部分(例如叠氮化物、硝酮或环辛炔 )的可靶向构建体的反应。靶向分子包含环辛炔时，可靶向构建体将包含叠氮化物或硝酮或类似活性部分。靶向分子包含叠氮化物或硝酮时，可靶向构建体将包含环辛炔、炔或类似活性部分。可用18F标记可靶向构建体或可与任何替代性诊断剂和/或治疗剂，例如化疗药物缀合。点击化学反应使得在靶向分子和可靶向构建体之间形成非常稳定的共价键。点击化学反应可在体外发生以形成然后施用给受试者的高度稳定的标记靶向分子。在优选的替代性实施方案中，点击化学反应可在体内发生。最初，向受试者施用抗体或包含活化部分的其它靶向分子并使其定位于靶细胞、组织、病原生物或其它靶标上。然后向受试者施用包含适当活性部分的可靶向构建体。活化部分与活性部分之间的反应具有足够特异性，以致可靶向构建体不与受试者体内的其它非活化分子结合。可靶向构建体与位于靶组织中的靶向分子不可逆结合。附图简述将下列附图包括在内以说明本发明的特殊实施方案并不意味着限于要求保护的主题的范围。
图1.通过微PET成像的荷瘤裸鼠体内18F标记试剂的生物分布。在注射(A)[18F]FDG、(B)经抗 CEAX 抗 HSG bsMAb 预靶向的 Al [18F] IMP449, (C)单独的 Al [18F] IMP449 (未经bsMAb预靶向)后每个左侧上带有小的皮下LS174T肿瘤的3只裸鼠的冠状切片。给出了在成像期结束时从动物体内摘除的组织的生物分布数据，表示为每克的注射剂量百分比(%ID/g)。缩写:B，骨髓;H，心脏；K，肾脏；Τ，肿瘤。图2.对给予在上侧带有35mg LS174T人结直肠癌异种移植物的裸鼠的预革巴向Al [18F] IMP449的动态成像研究。上面3个图分别示出了在120min成像期间以6个不同的5min间隔，取自以肿瘤周边位置为中心的躯体部位的冠状、矢状和横切面。在每张截面图中左侧的第一个图像示出了十字准线交叉点处肿瘤的定位，其用箭头标示。成像期间动物部分向其右侧倾斜。下面2个图示出了冠状面中集中于更前面的平面的另外的冠状和矢状面以标示出在肝脏和肠道中的分布，而矢状面在体内更集中地交叉。缩写:Cor，冠状；FA，前臂；H，心脏；K，肾脏；Lv，肝脏；Sag，矢状；Tr，横切面；UB，膀胱。图3.18F标记的MP468铃蟾肽类似物的体内组织分布。图4.带AR42J肿瘤的小鼠(n=5)在注射后2h18F_MP466和68Ga-MP466的生物分布比较。作为对照，单独组(n=5)中的小鼠接受了过量未标记的奥曲肽以证明受体特异性。图5.颈部具有皮下AR42J肿瘤的小鼠在注射后2h18F_MP466和68Ga-MP466的PET/CT扫描冠状切片。清楚可见在肿瘤和肾脏中积聚。图6.具有皮下LS174T和SK-RC52肿瘤的BALB/c裸鼠在68Ga_MP288静脉内注射后 lh，6.0nmol1251-TF2 (0.37MBq)和 0.25nmoI68Ga-MP288 (5MBq)的生物分布。值作为平均值土标准偏差给出(n=5)。图7.用6.0nmol TF2预靶向后静脉内注射后lh5MBq FDG和5MBq68Ga-1MP288 (0.25nmol)的生物分布。值作为平均值土标准偏差给出(n=5)。图8.在右后肢(白色箭头)上具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)并且在左大腿肌肉(黑色箭头)中有炎症，接受了 5MBq18F-FDG并且于I天后间隔16h接受了 6.0nmol TF2和5MBq68Ga-1MP288 (0.25nmol)的 BALB/c 裸鼠的 PET/CT 图像。18F-FDG 和 68Ga-MP288 注射后Ih为动物成像。图中示出了 FDG-PET扫描的3D体绘制(A)、肿瘤区域的横切面(B)和预靶向免疫PET扫描的3D体绘制(C)、肿瘤区域的横切面(D)。图 9.16h 前 6.0nmol TF2 注射后 Ih0.25nmol Al18F-MP449 (5MBq)的生物分布，未预靶向的Al18F-MP449生物分布或Al [18F]生物分布。值作为平均值土标准偏差给出。图10.右侧(箭头)具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)，间隔16h静脉内接受了 6.0nmolTF2 和 0.25nmol A118F-1MP449 (5MBq)的 BALB/c 裸鼠的静态 PET/CT 成像研究。Al 18F-MP449后注射Ih为动物成像。图中示出了 3D体绘制(A)肿瘤区域后视图和横截面，(B)冠状，(C)矢状。图11.使用带末端炔的螯合部分和叠氮化物活化靶向分子，点击化学缀合螯合剂部分与祀向分子。图12.使用带叠氮化物部分的螯合部分和带末端炔的靶向分子，点击化学缀合螯合剂部分与靶向分子。图13.用于点击化学的环辛炔衍生物。图14.用于点击化学的叠氮化物衍生物。图15.用于点击化学的硝酮衍生物。图16.用于点击化学的替代性环辛炔部分。图17.用于点击化学的替代性叠氮化物部分。图18.1MP479 (SEQ ID NO: 52)的结构。图19.1MP485 (SEQ ID NO: 53)的结构。图20.MP487 (SEQ ID NO: 54)的结构。图21.二-叔丁基-N0DA-MPAA 的合成。图22.NOTA的马来酰亚胺缀合物的合成。发明详述提供了以下定义以便理解本文的公开内容。未明确定义的术语根据其简单的普通含义使用。如本文所使用，“一种(a) ”或“一种(an) ”可指一项或一项以上。如本文所使用，术语“和”和“或”可用于指连接词或转折连词。即，除非另有说明，两个术语应理解为等同于“和/或”。如本文所使用，“约”指在数字的正或负10%以内。例如，“约100”将指介于90和110之间的任何数字。如本文所使用，“肽”指长度介于2-100个氨基酸残基之间，长度更优选介于2-10个，更优选介于2-6个氨基酸残基的天然或非天然氨基酸的任何序列。“氨基酸”可为L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物和氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。如本文所使用，术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒、寄生物和细菌，包括但不限于人体免疫缺陷病毒(HIV)、 疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒(Sendai virus)、猫白血病毒、呼肠孤病毒(Reo virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、人血清细小样病毒、猿病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘带状疱疫病毒(Varicella-Zoster virus)、登革热病毒(Dengue virus)、风疫病毒、麻疫病毒、腺病毒、人T细胞白血病毒、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口腔炎病毒、辛德华斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、抚病毒(wart virus)、蓝舌病毒、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、酿月农链球菌(Streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、B型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae B)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochete)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)。如本文所使用，“辐解保护剂”指可添加到18F标记络合物或分子中以降低18F标记络合物或分子受辐解的分解速率的任何分子、化合物或组合物。可使用任何已知辐解保护齐U，包括但不限于抗坏血酸。点击化学最初将点击化学方法构想成通过以模块化形式将小亚基连在一起快速生成络合物的方法。(见，例如，Kolb 等，2004，Angew Chem Int Ed40:3004-31 ；Evans,2007，Aust J Chem60:384-95。)在本领域中已知各种形式的点击化学反应，例如铜催化的Huisgenl, 3-偶极环加成反应(Tornoe 等，2002，J Organic Chem67:3057-64)，常常也将其称为“点击反应”。其它替代方案包括环加成反应，例如Diels-Alder反应、亲核取代反应(特别是与如环氧化物和氮丙啶化合物的小张力环)、脲化合物的羰基化学形成和牵涉碳-碳双键的反应，例如巯基-炔反应中的炔。叠氮化物-炔Huisgen环加成反应在还原剂存在下使用铜催化剂以催化末端炔基与第一分子连接的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子存在下，叠氮化物与活化炔反应形成1，4- 二取代的1，2，3-三唑。铜催化的反应在室温下发生并且具足够的特异性，以致常常不需要纯化反应产物。(Rostovstev 等，2002，Angew Chem Int Ed41:2596 ;Tornoe 等，2002，J Org Chem67:3057。)叠氮化物和炔官能团很大程度上对含水介质中的生物分子有惰性，使得在络合物溶液中发生反应。形成的三唑化学稳定并且不受酶切割，使得点击化学产物在生物系统中非常稳定。然而，铜催化剂对活细胞有毒性，妨碍了生物学应用。已经建议将无铜催化的点击反应用于生命系统中生物分子的共价修饰。(见，例如,Agard等,2004，J Am Chem Socl26:15046-47。)无铜催化的反应使用环张力代替铜催化剂以促进[3+2]叠氮化物-炔环加成反应(同上)。例如,环辛炔是包含内部炔键的8-碳环结构。闭环结构促使对叠氮基团有高度反应活性而形成三唑的乙炔的键角大体上变形。因此，环辛炔衍生物可用于无需毒性铜催化剂的无铜催化的点击反应(同上)。Ning等报道了另一类型的无铜催化的点击反应(2010，Angew Chem IntEd49:3065-68)，牵涉张力促进的炔-硝酮环加成。为解决原环辛炔反应的速率缓慢,吸电子基团与相邻三键连接(同上)。此类经取代的环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-联苯环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。替代性无铜反应牵涉张力促进的炔-硝酮环加成以生成N-烷基化异 噁唑啉(同上)。据报道反应具有异常快速的反应动力学并且用于一锅三步法以定点修饰肽和蛋白质(同上)。通过使适当醛与N-甲基羟胺缩合制备硝酮并且在乙腈和水的混合物中发生环加成反应(同上)。然而，试图使用与硝酮标记的单糖衍生物的反应和Jurkat细胞中的代谢标记不成功(同上)。
在一些情况下，可使用细胞的内源合成途径将用于点击化学反应的活化基团并入生物分子中。例如，Agard等(2004, J Am Chem Socl26:15046-47)证明在全乙酰化N-叠氮乙酰甘露糖胺的存在下在CHO细胞中表达的重组糖蛋白导致相应的N-叠氮乙酰唾液酸生物并入糖蛋白的碳水化合物中。叠氮基衍生化糖蛋白与生物素化环辛炔特异性反应以形成生物素化糖蛋白，而无叠氮基部分的对照糖蛋白仍未标记(同上)。Laughlin等(2008，Science320:664-667)使用类似技术代谢标记用全乙酰化N-叠氮乙酰半乳糖胺孵育的斑马鱼胚胎中的细胞表面多糖。叠氮基衍生化多糖与二氟化环辛炔(DIFO)试剂反应以使体内多糖可视化。Diels-Alder反应也已经用于分子的体内标记。Rossin等(2010，Angew Chem IntEd49:3375-78)报道了在携带有反式-环辛烯(TCO)活性部分的肿瘤局部抗TAG72 (CC49)抗体和111In标记的四嗪DOTA衍生物之间52%的体内产率。向带有结肠癌异种移植物的小鼠施用TCO标记的CC49抗体，接着于I天后注射111In标记的四嗪探针(同上)。通过在注射放射标记探针后3h对活鼠的SPECT成像证明，放射标记探针与肿瘤局部抗体的反应导致位于肿瘤内的明显放射性，肿瘤与肌肉比例为13:1(同上)。结果证实了 TCO和四嗪标记分子的体内化学反应。在美国专利N0.6，953,675(其实施例部分通过引用并入本文)中进一步公开了使用标记部分的生物并入的抗体标记技术。将此类“美化(landscaped)”抗体制备成在糖基化位点具有活性酮基团。所述方法牵涉在包含糖或糖前体的酮衍生物的培养基中表达用编码在CHl或Vk结构域中具有一个或多个N-糖基化位点的抗体的表达载体转染的细胞。酮衍生化糖或前体包括N-乙酰丙酸基甘露糖胺和N-乙酰丙酸基岩藻糖。随后使美化抗体与包含酮活性部分，例如酰肼、肼、羟氨基或氨基硫脲基团的试剂反应，以形成标记靶向分子。与美化抗体连接的示例性试剂包括螯合剂(如DTPA)、药物大分子(例如阿霉素-葡聚糖)和含有酰基-酰肼的肽。如以下实施例中更详细地讨论，美化技术不限于生成包含酮部分的抗体，但是可代替用于将点击化学活性基团，例如硝酮、叠氮化物或环辛炔引入抗体或其它生物分子上。以下实施例提供了适合体外或体内使用的点击化学反应的修改。可通过化学缀合或通过生物学并入形成活性靶向分子。可用叠氮基部分、经取代的辛炔或炔基或硝酮部分活化靶向分子，例如抗体或抗体片段。靶向分子包含叠氮基或硝酮基时，相应的可靶向构建体将包含经取代的辛炔或炔基，并且反之亦然。如以上所讨论，可通过在活细胞中代谢并入产生此类活性分子。可选地，如以下实施例中进一步讨论，将此类部分化学缀合至生物分子的方法在本领域中众所周知，并且可利用任何此类已知方法。公开的技术可与以下描述的用于PET或NMR成像的18F或19F标记方法组合使用，或可选地，可用于递送可与适合活化的可靶向构建体和/或靶向分子缀合的任何治疗剂和/或诊断剂。18F标记技术 已知用18F标记分子的多种技术。表I列出了几种更常报道的氟化方法的特性。通过碳的肽标记牵涉18F通过亲核取代与辅基结合，通常分2或3步标记并纯化辅基，与化合物连接，然后再次纯化。这种通用方法已用于通过酰胺键、醛和“点击化学”连接辅基(Marik等，2006，Bioconjug Cheml7:1017-21 ;Poethko等，2004，J Nucl Med45:892-902 ；Li等，2007，Bioconjug Cheml8:989-93)。最常用的酰胺键形成试剂为4_18F_氟苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(18F-SFB),但是已经试验了许多其它类别(Marik等，2006)。在一些情况下，例如当使用18F标记的活性酯酰胺形成基团时，可能需要在偶联反应期间，在其切割之后保护肽上的某些基团。合成这种18F-SFB试剂和随后与肽的缀合需要许多合成步骤并且花费约2-3h。Poethko等(2004)研发了一种更简单、更有效的18F-肽标记方法，其中在约75-90min内(包括干燥步骤)4_18F_氟苯甲醛试剂通过肟连接与肽缀合。更新的“点击化学”方法在铜催化剂的存在下用乙炔或叠氮化物将18F标记分子连接到肽上(Li等，2007 ；Glaser和Arstad, 2007，Bioconjug Cheml8:989-93)。叠氮化物和乙炔基之间的反应形成三唑连接，三唑连接十分稳定并且在肽上非常有效地形成，无需保护基。点击化学(包括干燥步骤)在约75-90min内生成高产率( 50%)的18F标记肽。表1.所选18F-肽标记方法的总结
权利要求
1.一种用18F标记分子的方法，包括: a)使金属-18F络合物与螯合部分连接；并且 b)使所述螯合部分与分子连接形成18F标记分子， 其中通过点击化学反应使所述螯合部分与所述分子连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述点击化学反应选自:(i)硝酮与环炔；和(ii)叠氮化 物与环炔。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述环炔为环辛炔。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为蛋白质或肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为选自抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗原结合抗体片段和亲和体的靶向分子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为可靶向构建体。
7.根据权利要求6所述的方法，进一步包括: c)向受试者施用靶向分子； d)留出足够时间供所述靶向分子与靶抗原结合；并且 e)随后向所述受试者施用所述可靶向构建体，其中所述可靶向构建体与所述靶向分子彡口口
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属选自铝、镓、铟、镥和铊。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述金属为铝。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述螯合部分选自DOTA、TETA、ΝΟΤΑ、NODA、NODA衍生物、(叔丁基)2N0DA、ΝΕΤΑ、C-NETA、L-NETA、S-NETA、NODA-MPAA、N0DA-MPAEM 和 NOTA 衍生物。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括: c)向受试者施用所述18F标记分子；并且 d)使用PET扫描为所述受试者体内的所述18F标记分子的分布成像。
12.根据权利要求5所述的方法，进一步包括: c)向所述受试者施用所述靶向分子； d)使所述靶向分子定位于靶细胞、组织、器官或病原体上；并且 e)向所述受试者施用与所述金属-18F络合物结合的所述螯合部分； 其中所述螯合部分通过体内点击化学反应与所述靶向分子结合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中向培养基中添加有机溶剂以使所述金属-18F络合物与螯合部分连接。
14.根据权利要求1所述的方法，其中通过加热或微波照射使所述金属-18F络合物与所述螯合部分连接。
15.一种向靶细胞、组织或病原体递送诊断剂和/或治疗剂的方法，包括: a)使至少一种诊断剂和/或治疗剂与可祀向构建体连接； b)向受试者施用靶向分子；并且 c)向所述受试者施用所述可靶向构建体，其中所述可靶向构建体通过点击化学反应与所述靶向分子结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述点击化学反应选自:(i)硝酮与环炔；和(ii)叠氮化物与环炔。
17.根据权利要求17所述的方法，其中所述环炔为环辛炔。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶向分子选自抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗原结合抗体片段和亲和体。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述诊断剂或治疗剂选自放射性核素、细胞毒素剂、药物、毒素、寡核苷酸、siRNA、促凋亡剂、抗血管生成剂、酶、激素、免疫调节剂、硼化合物、光敏剂、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物、染料、顺磁离子和造影剂。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述诊断剂为18F-金属络合物。
21.一种治疗疾病的方法，包括: a)使至少一种治疗剂与可靶向构建体连接； b)向受试者施用靶向分子，其中所述靶向分子与与所述疾病相关的抗原结合；并且 c)向所述受试者施用所述可靶向构建体，其中所述可靶向构建体通过点击化学反应与所述靶向分子结合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可靶向构建体包含螯合部分并且所述治疗剂与所述螯合部分结合。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述点击化学反应选自:(i)硝酮与环炔；和(ii)叠氮化物与环炔。
24.根据权利要 求23所述的方法，其中所述环炔为环辛炔。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向分子选自抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗原结合抗体片段和亲和体。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病选自癌症、心血管病、代谢病、传染病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、免疫功能紊乱疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、神经病、淀粉样变性、I型或2型糖尿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏症、亨廷顿氏舞蹈病、纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌梗塞、肺栓塞和阿尔茨海默病。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向分子与选自以下的抗原结合:AFP、APRIL、B7、BCMA、BLyS、碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CCR4、CSAp、CD 1、CD la、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM-6、补体因子 C3、C3a、C3b、C5a、C5、CXCR2、CXCR4、CXCR7、CXCL12、纤连蛋白的 ED-B、EGFR、EGP-1 (TROP2)、EGP-2、因子 H、FHL-U Flt_3、叶酸盐受体、GRO-β、HLA-DR、ΗΜ1.24、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF) ,HIF-1 α、ΗΜ1.24、la、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、IFN- Y、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP_10、Le(y)、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP_lB、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5a_c、MUC16、NCA-95、NCA-90、PlGF, PSMA, RANTES, TlOl、TAC、TACI> TAG、肌腱蛋白、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF- α、TRAIL受体(Rl和R2)、VEGF、致癌基因产物、gp41、gpl20、β -淀粉样蛋白、S0D1、纤维蛋白、LDL、糖蛋白Ilb/IIIa、ICAM-1、整联蛋白α ν β3、叶酸盐受体I和心肌肌球蛋白。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗剂选自免疫调节剂、激素、细胞毒素齐 、药物、毒素、酶、反义寡核苷酸、硼化合物、光敏剂和放射性核素。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、造血因子、集落刺激因子、干扰素、促红细胞生成素、血小板生成素或其组合。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述免疫调节剂选自IL-1、IL-2、IL_3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述放射性核素选自225Ac、68Ga、67Ga、9°Y、86Y、111In, 131 1 , 1251 , 1231 , 99mTc,94mTc,186Re,188Re, I77Lu、62Cu、64Cu、67Cu、212B1、213B1、32P、nC、13N、150、76Br 和 211At。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述药物选自长春花生物碱、蒽环类抗生素、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、紫杉烧(taxane)、抗代谢物、烧化剂、抗生素、C0X-2抑制剂、 抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、凋亡剂、阿霉素(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、泰素(taxol)、CPT-11、喜树碱(camptothecin)、氮芥、烧基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯(triazene)、叶酸类似物、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、钼配位络合物、环磷酰胺、依托泊苷(etoposide)、卡氮芥(carmustine)、长春新碱(vincristine)、丙卡巴肼(procarbazine)、强的松(prednisone)、甲氨蝶呤、博来霉素(bleomycin)、地塞米松(dexamethasone)、亚叶酸(Ieucovorin)、丁酸苯酯、苔藓抑素-1 (bryostatin-Ι)和激素。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述毒素选自篦麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、DNA 酶 1、金黄色葡萄球菌肠毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)和假单胞菌内毒素(Pseudomonas endotoxin)。
34.根据权利要求26所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自免疫介导的血小板减少、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、多发性硬化、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham’s chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、艾迪生氏病(Addison’s disease)、类风湿性关节炎、结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、肺出血性肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、血栓闭塞性脉管炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎。
35.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体选自hRl(抗IGF-1R)、hPAM4(抗胰腺癌粘蛋白)、hA20 (抗 CD20)、hA19 (抗 CD 19)、hIMMU31 (抗 AFP)、hLLl (抗 CD74)、hLL2 (抗 CD22)、hMu-9 (抗 CSAp)、hL243 (抗 HLA-DR)、hMN-14 (抗 CEACAM5)、hMN-15 (抗CEACAM6)、hRS7 (抗 EGP-1)、hMN-3 (抗 CEACAM6)、Ab 124 (抗 CXCR4)、Ab 125 (抗 CXCR4)、CC49 (抗 TAG-72)、Tn (抗 PSMA)、J591 (抗 PSMA)、HuJ591 (抗 PSMA)、AB-PG1-XG1-026 (抗PSMA 二聚体)、D2/B (抗 PSMA)、G250 (抗碳酸酐酶 IX)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗 VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(抗 EGFR)、吉妥单抗(gemtuzumab)(抗 CD33)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗 CD20)、帕尼单抗(panitumumab)(抗 EGFR)、利妥昔单抗(rituximab)(抗⑶20)、托西莫单抗(tositumomab)(抗 CD20)、GAlOl (抗 CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗 ErbB2)、h679 (抗 HSG)、h734 (抗 DTPA)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗 CA125)、阿昔单抗(abciximab)(抗⑶41)、阿达木单抗(adalimumab)(抗TNF-α )、阿非莫单抗(afelimomab)(抗TNF-α )、阿德木单抗(adecatumumab)(抗 EpCAM)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)(抗 VEGFR2)、ALD518 (抗IL6)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗 TAG72)、阿塞珠单抗(aselizumab)(抗CD62L)、阿利珠单抗(atIizumab)(抗IL-6R)、巴皮纽阻单抗(bapineuzumab)(抗抗β -淀粉样蛋白)、巴利昔单抗(basiliximab)(抗CD25)、贝那利珠单抗(benralizumab)(抗⑶125)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、比西单抗(biciromab)(抗纤维蛋白 II)、贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin)(抗 0)30)、brodalumab (抗IL-17)、卡妥索单抗(catumaxomab)(抗 EpCAM)、西地珠单抗(cedelizumab)(抗⑶4)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)(抗 TNF-α )、西妥昔单抗(cetuximab)(抗 EGFR)、克立昔单抗(clenoliximab)(抗 CD4)、可那木单抗(conatumumab)(抗 TRAIL-R2)、decetuzumab (抗 CD40)、达利珠单抗(daclizumab)(抗 CD25)、达雷木单抗(daratumumab)(抗 CD38)、依库丽单抗(eculizumab)(抗 C5)、艾西莫单抗(elsiIimomab)(抗 IL-6)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu)、埃达珠单抗(etaracizumab)(抗整联蛋白α ν β 3)、法索单抗(fanolesomab)(抗CD15)、卫材单抗(farletuzumab)(抗叶酸盐受体 I)、fexakinumab (抗 IL-22)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(抗 IFN- Y )、夫苏木单抗(fresolimumab)(抗TGF-β )、罗氏单抗(gantenerumab)(抗β -淀粉样蛋白)、加维莫单抗(gaviIimomab)(抗 CD147)、吉妥单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(抗 CD33)、戈利木单抗(golimumab)(抗TNF-α )、鲁昔单抗(gomiliximab)(抗⑶23)、伊巴珠单抗(ibalizumab)(抗⑶4)、英西单抗(imciromab)(抗肌球蛋白)、英夫利昔单抗(infliximab)(抗 TNF- α )、英妥木单抗(intetumumab)(抗 CD51)、伊诺莫单抗(inolimomab)(抗CD25)、伊匹单抗(ipiIimumab)(抗 CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗 CD30)、itoIizumab (抗 CD6)、Iebr ikizumab (抗 IL-13)、林妥珠单抗(Iintuzumab)(抗 CD33)、鲁卡木单抗(Iucatumumab)(抗 CD40)、马帕木单抗(mapatumumab)(抗 TRAIL-R1)、马妥珠单抗(matuzumab)(抗 EGFR)、美泊利单抗(mepoIizumab)(抗 IL-5)、mogamuIizumab (抗CCR4)、莫罗单抗-0)3 (muromonab-Q)3)(抗 0)3)、奈昔木单抗(necitumumab)(抗 EGFR)、ponezumab (抗 β -淀粉样蛋白)、PR0140 (抗 CCR5)、雷莫芦单抗(remucirumab)(抗VEGFR2)、罗利珠单抗(rontalizumab)(抗 IFN-α )、鲁利单抗(rupIizumab)(抗 Q340L)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗⑶40)、替利珠单抗(teplizumab)(抗⑶3)、TGN1412 (抗0)28)、妥珠单抗(tocilizumab)(抗 IL-6R)、托西莫单抗(tositumomab)(抗 0)20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗HER2/neu)、曲加珠单抗(tregalizumab)(抗CD4)、维西珠单抗(visilizumab)(抗 0)3)和扎木单抗(zanolimumab)(抗 0)4)。
36.根据权利要求21所述的方法，进一步包括:d)使所述靶向分子或可靶向构建体在细胞中表达； e)在包含叠氮乙酰葡糖胺、叠氮高丙氨酸或2-氨基-5-己炔酸的培养基中培养所述细胞；并且 f)将所述叠氮乙酰葡糖胺、叠氮高丙氨酸或2-氨基-5-己炔酸并入所述靶向分子或可靶向构建体中。
37.一种DNL构建体，包含: a)与来自AKAP蛋白的锚定结构域(AD)部分连接的第一蛋白或肽；和 b)与来自蛋白激酶A(PKA)的二聚化和停泊结构域(DDD)部分连接的第二蛋白或肽； 其中2个拷贝的所述DDD部分形成二聚体并且与所述AD部分结合以形成靶向递送络合物并且其中所述DDD部分 通过点击化学反应与所述AD部分共价连接。
38.根据权利要求37所述的DNL构建体，其中所述点击化学反应选自:(i)硝酮与环炔；和(ii)叠氮化物与环炔。
39.根据权利要求38所述的DNL构建体，其中所述环炔为环辛炔。
40.根据权利要求37所述的DNL构建体，其中所述蛋白或肽选自单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗原结合抗体片段、细胞因子和亲和体。
全文摘要
本申请公开了组合物及合成和使用的方法，所述方法牵涉体内或体外形成治疗性和/或诊断性络合物的点击化学反应。优选地，所述诊断络合物对18F成像有用，而所述治疗络合物对化疗药物或毒素的靶向递送有用。更具体地说，可使用牵涉环辛炔、硝酮或叠氮化物活性部分的点击化学反应，使螯合部分或可靶向构建体与靶向分子，例如抗体或抗体片段缀合。在大多数优选的实施方案中，所述点击化学反应在体内发生。体内点击化学不限于18F标记，但是可用于递送多种治疗剂和/或诊断剂。
文档编号A61K101/02GK103221072SQ201180054897
公开日2013年7月24日 申请日期2011年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者W·J·麦克布赖德, C·A·德索扎, D·M·戈德堡 申请人:免疫医疗公司