专利名称：抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于口蹄疫防治技术领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染率高，感染后发病率最高可达100%，易感动物多达70余种，其中重要的经济畜种如猪、牛、羊等均易感。鉴于FMD不仅降低动物生产性能，造成巨大的直接经济损失，而且还影响动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，故素有“政治经济病”之称。各国学者对FMDV进行了广泛而又深入的研究。FMDV属小RNA病毒科 (Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。该病毒有7个血清型，分别为A型、 0型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型间无血清交叉反应和交叉免疫现象。各血清型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，其亚型间抗原也有很大的差
已目前，FMD是严重威胁畜牧业发展的重要传染病，发达国家主要采取扑杀为主的防控措施，发展中国家主要采取疫苗接种和扑杀相结合的方法。但是疫苗接种后需要至少七天的时间才能产生保护作用，同时由于FMDV血清型多，各血清型之间几乎没有交叉保护性，所以现在应用的单血清型疫苗难以达到对不同血清型和亚型的变异毒株产生保护作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象的发现为疾病防控开启了希望之门。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由功能性双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。科研人员将RNAi技术应用于多种病毒性疾病的治疗研究，如艾滋病病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技术也为抗 FMDV感染方面的研究提供了新的思路。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。本发明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，活性成分为siRNA-VPl和siRNA-2B ；
SiRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC ；反义链为(5’-3’)GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC ；siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC ；反义链为(5’-3’)GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG ；以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补，以以上序列为模板， 转录得到的siRNA为具有loop结构的dsRNA ；所述的siRNA-VPl和siRNA_2B是将其转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体制备得到；所述的载体优选为人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X ；所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，更优选为重组腺病毒rAden0-2B-VP 1 ；所述的重组腺病毒rAden0-2B-VPl通过如下方法制备得到是将siRNA_VPl的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒 Adeno-2B-VPl ；所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，优选包含以下步骤(1)将如下所示的siRNA-VPl的转录模板和siRNA_2B的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，位于TO启动子的下游，得到重组质粒Paiuttle-2B和 pShuttIe-VPl ；siRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的 5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；(2)分别通过 PHce I/I-Ceu I 双酶切重组质粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通过体外连接法分别将目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体 pAdeno-X 连接，得到重组质粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)将重组质粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分别线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VPl ；该重组腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，使用时将其接种到动物体身上即可；所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，更优选包含以下步骤(1)以前述得到重组质粒pShuttle_2B和pShuttle_VPl为模板，通过PCR分别得到U6启动子+2B融合片段和U6启动子+VPl融合片段，再将这两个融合片段串联，克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒P-2B-VP1 ；(2)通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒P_2B_VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)将重组质粒pAden0-2B-VPl线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒 Adeno-2B-VPl ；该重组腺病毒Aden0-2B-VPl即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，使用时将其接种到动物体身上即可；所述的克隆载体优选为pMD19-T simple载体；所述的包装细胞优选为人胚肾细胞株HEK293 ；所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂在制备抗口蹄疫病毒制剂中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明提供的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂能有抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。通过实验证实，重组腺病毒rAden0-2B-VPl的防治效果优于重组腺病毒 r Adeno-2B和rAdeno-VPl分别单独应用或联合应用的效果。
图1是筛选重组腺病毒质粒pAden0-2B-VPl进行的菌落PCR鉴定电泳图；其中，泳道1 9为被筛选的菌落；泳道10为阴性对照；泳道M为DNA Marker DL15000。图2是重组腺病毒质粒pAden0-2B-VPl的I^acI酶切鉴定电泳图；其中，泳道 Ml为DNA Marker DL2000 ；泳道M2为DNA Marker DL15000 ；泳道1为重组腺病毒质粒 pAdeno-2B-VPl PacI 酶切产物。图3是不同时间点上清中FMDV滴度的测定图。图4是不同时间细胞上清液中FMDV滴度测定图。图5是各试验组不同时间细胞上清液中FMDV拷贝数检测图。图6是重组腺病毒感染量与豚鼠保护率的关系图。图7是不同重组腺病毒对豚鼠保护效果的比较图。图8是重组腺病毒的预防保护时机图。图9是重组腺病毒多次治疗防控FMD的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明是以不同年代和地区分离的0型FMDV为基础，选择FMDV 2B、VP1基因高度保守序列设计合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，构建重组质粒pShuttle_2B、 pShuttle-VPl，具体过程如下
(1)将siRNA-VPl的转录模板和siRNA_2B的转录模板分别用去离子水稀释成相同的浓度(5pmol/ μ L)，分别把互补的两段寡核苷酸(各5 μ L混合)混勻后放在PCR扩增仪上，95°C处理2min，然后自然降到常温进行处理。将处理后形成的双链siRNA寡核苷酸片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切处理后的pSIREN-Shuttle (Clontech公司)连接(连接反应按照T4 DNA连接酶说明书操作，阳性克隆筛选按照分子克隆实验指南操作)，得到 pShuttle-2B(siRNA-2B的转录模板位于TO启动子下游)和pShuttle-VPl (siRNA-VPl的转录模板位于U6启动子下游)。
siRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示
正义链为(5，-3，)
GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；
反义链为(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示
正义链为(5，-3，)
GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；
反义链为(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；
(2)分别设计 2 对引物 Pvp1_f/Pvp1_k 与 P2B-F/P2B_K，模板分别为 pShuttIe-VPl 和 pShuttle-2B,用PCR方法分别扩增U6启动子与siRNA-VPl融合片段(理论扩增片段长为329bp)、U6启动子与siRNA-2B融合片段(理论扩增片段长为32^p)，引物序列如下 (5， -3，)
PVP1_F CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA ；
PVP1_E :AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC ；
P2B_F :ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG ；
P2B_E :AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
PCR反应过程按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用说明进行，扩增体系 (50 μ L)组成分别如下权利要求
1.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于包括siRNA-VPl和 siRNA-2B ；所述的siRNA-VPl的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的siRNA-VPl的转录模板的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述的siRNA_2B 的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID而.3所示；所述的^1 嫩-28的转录模板的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于所述的 siRNA-VPl和siRNA-2B是将其转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体制备得到。
3.根据权利要求2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于所述的载体为人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X。
4.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂为重组腺病毒Aden0-2B-VPl ；所述的重组腺病毒Aden0-2B-VPl通过如下方法制备得到是将siRNA-VPl的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体 pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒 Adeno^B-VPl。
5.权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)将如下所示的siRNA-VPl的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别克隆入 PSIREN-shuttle 穿梭载体，得到重组质粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl ；siRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5' -GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGA G-3，；反义链为5' -AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC G-3，；siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5' -GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGA G-3，；反义链为5， -AATTCTCTAGMAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3 ；正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’ 端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；(2)分别通过PHce I/I-Ceu I 双酶切重组质粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通过体外连接法分别将目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体 pAdeno-X 连接，得到重组质粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)将重组质粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分别线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒r Adeno-2B和rAdeno-VPl ；该重组腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。
6.根据权利要求5所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)以所述的重组质粒pamttle-2B和所述的pShuttle-VPl为模板，通过PCR分别得到U6启动子+2B融合片段和U6启动子+VPl融合片段，再将这两个融合片段串联，克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒P-2B-VP1 ；(2)通过体外连接法将PI-SceI/I-Ceu I双酶切重组质粒P-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)将重组质粒pAden0-2B-VPl线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒 Adeno-2B-VPl ；该重组腺病毒Aden0-2B-VPl即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。
7.根据权利要求6所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于所述的克隆载体优选为PMD19-T simple载体。
8.根据权利要求5或6所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于所述的包装细胞为人胚肾细胞株HEK293。
9.权利要求1 4任一项所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂在制备抗口蹄疫病毒制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用。该生物制剂的活性部分为siRNA-VP1和siRNA-2B；siRNA-VP1的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；siRNA-2B的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过将siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒Adeno-2B-VP1。通过实验证实，重组腺病毒Adeno-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1分别单独应用或联合应用的效果。该生物制剂能有抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。
文档编号A61K48/00GK102512694SQ20121000429
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者代曼曼, 刘文俊, 徐艳芳, 李银光, 赵明秋, 陈金顶 申请人:华南农业大学