专利名称：Th1细胞因子免疫调节多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学中的多肽技术，尤其是涉及一种来源于天然TLR2激动剂 HP-NAP的Thl细胞因子免疫调节多肽，本发明还涉及该多肽在开发Thl细胞因子免疫调节功能相关药物中的应用。
背景技术：
人体免疫系统是机体防止病原体感染、清除肿瘤细胞和维持自身健康的重要防御体系，而⑶4+T辅助性淋巴细胞是执行这一功能的重要环节。1986年Mosmarm等在研究小鼠⑶4+Th时发现了两种不同类型的细胞因子产生克隆；Thl细胞主要分泌IL-2、IFN- γ等细胞因子；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子。Thl细胞因子可以增强杀伤性细胞的细胞毒作用，介导免疫应答，与机体抗肿瘤抗病毒有关；Th2细胞因子促进抗体产生， 增强体液免疫，与移植物耐受、抑制自身免疫疾病相关。HP-NAP能上调中性白细胞及单核细胞表面β 2整联素的表达，促进中性白细胞及单核细胞与血管内皮细胞的黏附及穿过内皮细胞向感染部位转移聚集。HP-NAP—旦从菌体中释放出来，还可以穿过胃上皮细胞到达黏膜下层并激活巨噬细胞，巨噬细胞释放的IL-6 进一步趋化和激活中性白细胞及单核细胞。2010年，Andrea Cappon等研究证实HP-NAP 可以通过促进机体释放一些内源性因子(IL-1 β等)延长单核细胞的寿命，并且可以通过单核细胞依赖的方式延长中性粒细胞的寿命。2006年Amedeo等报道HP-NAP是一种TLR2 (Toll-like receptor 2)激动剂，能够诱导人中性粒细胞和单核细胞产生IL-12和IL-23 等细胞因子，使宿主抗原特异性⑶4+T细胞由Th2向Thl免疫反应转变。因此HP-NAP可能成为逆转Thl/Th2漂移，增强Thl反应的免疫调节效应分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于天然TLR2激动剂HP-NAP的Thl细胞因子免疫调节多肽，本发明另一目的在于提供该多肽在开发Thl细胞因子免疫调节功能相关药物中的应用。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的Thl细胞因子免疫调节多肽为16肽，其氨基酸序列为 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο本发明的Thl细胞因子免疫调节多肽在制备Thl细胞因子免疫调节剂中的应用。所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。本发明的优点在于采用免疫信息学手段，预测天然TLR2激动剂HP-NAP最小功能结构域，采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC/MS鉴定后，用体外细胞模型验证其对Thl 细胞因子免疫调节功能。鉴定出的Thl细胞因子免疫调节多肽序列未见文献与专利报道， 为基于Thl细胞因子调节为机理的免疫调节药物研发提供了制备与筛选技术。
图1为本发明多肽的质谱分析图2为RT-PCR鉴定本发明多肽napP102刺激PBMCs后IFN- γ表达结果。图3为RT-PCR鉴定本发明多肽napP102刺激PBMCs后IL-4表达结果。图4为本发明多肽napP102与MAGE-A3共同作用后的杀伤效果。
具体实施例方式本发明所述的Thl细胞因子免疫调节多肽为16肽，记为napP102，依据天然TLR2 激动剂HP-NAP的第102 - 117位的氨基酸序列进行Fmoc固相合成，HPLC分离纯化，MS进行鉴定，其氨基酸序列为
Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ；分子量为 1853.958。本发明的Thl细胞因子免疫调节多肽在制备Thl细胞因子免疫调节剂(如恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂)中的应用。本发明主要采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、IEDB, NetMHC2. 2数据库对 HP-NAP的功能结构域进行预测分析，设计HP-NAP多肽序列。Kolaskar和Tongaonkar方法进行评价，筛选获得多肽序列采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后，质谱鉴定。肽质谱鉴定图见图1。本发明多肽napP102制备的基本流程为首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽。经HPLC纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。(参见①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。 ②.N.休厄德、H. D.贾库布克著，刘克良等译，肽化学与生物学，科学出版社，2005年。)
人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离诱导及RT-PCR实验和LDH实验检测抽取健康供者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加白细胞介素2 (IL-2，P印rotech公司) 诱导分化⑶4 + T细胞，进一步在体外RT-PCR实验和LDH实验进行验证。方法如下
1. PBMCs的分离与诱导(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀释抗凝处理后的外周血40ml ； (2)离心管中加入細1 Lymphoprep分离液(Axis-Shield公司)；(3)加8ml步骤(1)中稀释后的外周血于4ml Lymphoprep分离液液面上；(4) 20°C离心(2000rmpX20min) ； (5)离心后，分为四层，弃去最上层，用玻璃吸管吸取第二层即白膜层(富含PBMCs); (6)吸出的白膜层用PBS CpH 7. 2)离心洗涤两次；(7)用M孔板铺板，细胞的浓度为IX 10 6/ml，每孔 Iml ； (8)第二天每孔加入50ug表位肽，同时设立PBS组作为阴性对照，PHA(10ug每孔)作为阳性对照。(9)第三天每孔加入50U IL-2，荷肽72h后收细胞进行RT-PCR检测IFN- γ 和IL-4表达情况。2. RT-PCR 实验
41)RNA的提取(1)将离心后的PBMCs，倒去培养液，室温下不洗涤细胞直接加入Iml 裂解液，反复吹打使细胞完全裂解；(2)将悬液转入1.5 ml EP管，室温放置5 min，使核蛋白完全分离；(3)加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡15~30s，室温静置5min后，12000g，15min离心；(4)小心吸取上层水相移至新EP管中(共3层，避免吸取下面两层)；(5)加等体积异丙醇，静置10min，7500g，离心IOmin ； (6)弃上清，用75%乙醇洗涤，振荡，混勻，12000g，离心 5min ;(7)弃上清，干燥 lOmin，加入 20~30μ 1，0. 01% DEPC 水溶解，55~60 "C (lOmin)，使之溶解。2)反转录过程
(1)在冰浴的试管中加入下列反应混合物 总 RNA: (l~5yg)5μ 1
引物0lig0(dT) (0. 5μ g/μ 1) 1μ 1 无RNase去离子水，定容至 12 μ 1
(2)轻轻混勻后离心3巧s；
(3)反应混合物在70°C水浴5min，然后离心34s ；
(4)将试管冰浴，再加入以下组分 5xReaction Buffer4 μ 1
RNase In hibiter (20U/μ 1) 1 μ 1
dNTP Mix (10 mmol/1)2 μ 1
M-MulvRT (20U/ul)1 μ 1 终体积为 20 μ 1
(5)反应混合物42°C，水浴60min ；
(6)在70°C加热lOmin，终结反应，置冰上或冷冻保存(_20°C)。3)以cDNA为模板，应用针对IFN-γ和IL-4的特异引物(引物见表1)，进行PCR， 20ul 反应体系:2XTaq PCR MasterMix 10 μ 1 ；上、下游引物各 0. 5 μ 1 ；cDNA 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1。PCR反应参数如下
1.T=95. 0°C 0. 5min
2.T=94. 0°C30s
3.T=64. 0°C 40s -0. 7°C +0:00
R=3. 0°C /s + 0. O
4.T=72. 0°C
2
Imin REP 15 30s 0:00 Imin REP 20 IOmin
40s
5.GCTC
6.T=94. 0°C
7.T=53. 0°C
8.T=72. 0°C
9.Go to 6
10.T=72. 0°C
11.Hold on 16°C
结果见图2与图3，肌寸0 实验结果显示，候选表位11^^102能够诱导健康供者外周血 IFN-Y的表达。
表1 =IFN- γ和IL-4的特异引物
权利要求
1.一种Thl细胞因子免疫调节多肽，其特征在于该多肽为16肽，其氨基酸序列为 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο
2.根据权利要求1所述的Thl细胞因子免疫调节多肽在制备Thl细胞因子免疫调节剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的Thl细胞因子免疫调节多肽在制备Thl细胞因子免疫调节剂中的应用，其特征在于所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。
全文摘要
本发明公开了一种Th1细胞因子免疫调节多肽为16肽，其氨基酸序列为Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。本发明还公开了Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂中的应用，所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。本发明的优点在于采用免疫信息学手段，预测天然TLR2激动剂HP-NAP最小功能结构域，采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC/MS鉴定后，用体外细胞模型验证其对Th1细胞因子免疫调节功能。鉴定出的Th1细胞因子免疫调节多肽序列未见文献与专利报道，为基于Th1细胞因子调节为机理的免疫调节药物研发提供了制备与筛选技术。
文档编号A61K38/10GK102516366SQ201210004099
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者刘鑫, 康巧珍, 李国栋, 李黎, 汲振余, 祁元明, 翟文杰, 高艳锋 申请人:郑州大学