专利名称：一种靶向热敏脂质体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向给药系统，特别是涉及一种肿瘤归巢肽修饰的靶向热敏脂质体组合物。本发明还涉及所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法和所述靶向热敏脂质体组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
脂质体(liposomes)在过去四十年中作为化疗药物给药系统的载体，尤其是在肿瘤治疗方面，得到了广泛的发展。近年来，结合了物理化学靶向和脉冲释放性能的热敏脂质体在抗肿瘤领域越来越引起重视。热敏脂质体(thermosensitive liposomes, TSL)是一类由相变温度略高于正常组织温度的温敏材料制成的，能在局部高温条件下迅速将所载药物释放的脂质体。在正常的体温下，脂质体膜呈致密排列的胶晶态，亲水性药物很难透过脂质体膜而扩散出来。当脂质体随血液循环经过被加热的靶器官时，局部的高温使磷脂分子运动加强，脂质体膜的结构发生变化，原来排列整齐致密的胶晶态磷脂双分子层在较高温度下变成疏松混乱的液晶态，导致脂质体迅速释放内含药物。目前抗肿瘤药物热敏脂质体研究中的最大问题是如何提高其在肿瘤部位的浓度， 降低抗肿瘤药物对内皮网状系统及正常组织的毒性。虽然热敏脂质体已经集被动靶向性 (从间隙比较大的肿瘤血管中泄漏进入肿瘤部位，实现在肿瘤中的蓄积)和物理化学靶向性(在高于相变温度时，将所包封的药物释放于加热部位)于一身，但是有文献报道，这两种靶向作用的效果在对抗肿瘤药效的提高上并不明显。因此，如何显著提高热敏脂质体的靶向性，增强热敏脂质体的抗肿瘤效果，是本领域亟待解决的问题。肿瘤归巢肽(tumor homing peptide)由于特异性强、生物相容性好、无毒、无免疫原性，是用于主动靶向的良好配体。所谓肿瘤归巢肽，是一类由几个到几十个氨基酸组成的肽链序列，能以高度的亲和力和特异性结合到肿瘤细胞或者肿瘤血管/淋巴管。除此之外， 很多肿瘤归巢肽能被肿瘤细胞内化，在肿瘤细胞内以很高的浓度积累。CREKA(cys-arg-glu-lys-ala)是一种由半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸组成的五肽，其作用于肿瘤微环境，对乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤等多种癌细胞均有靶向作用，没有肿瘤选择性。CREKA在体内发挥靶向作用的机制是1.识别肿瘤血管和间隙中特异性存在的凝固的血浆蛋白，选择性归巢到肿瘤部位；2、不仅归巢到肿瘤部位，同时能够自扩大化归巢作用，即CREKA在肿瘤部位积累后，能够诱导额外的局部凝固，因而产生出更多的CREKA结合位点，类似于血小板的自扩大效应。目前，国内外尚没有利用CREKA对包含抗肿瘤药物的热敏脂质体进行修饰的报道。
发明内容
本发明的创新点在于将热敏脂质体与主动靶向技术相结合，实现多种靶向技术的
3配合，以提高热敏脂质体的靶向性，增强热敏脂质体的抗肿瘤效果。为此，本发明的一个目的是提供一种靶向热敏脂质体组合物，所述组合物包括表面修饰有肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体，所述热敏脂质体中包含有抗肿瘤药物。本发明的另一个目的是提供所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法。本发明的另一个目的是提供所述靶向热敏脂质体组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。本发明的技术方案和要点将在下面作详细说明。本发明还涉及以下技术方案1、一种靶向热敏脂质体组合物，其特征在于所述组合物包括表面修饰有肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体，所述热敏脂质体中包含有抗肿瘤药物。2、如项1所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、顺钼、卡钼、奥沙利钼和甲氨蝶呤中的一种或多种。3、如项2所述的靶向热敏脂质体组合物，其中抗肿瘤药物的药脂比(药物与脂材的质量比)为 1 10w/w 1 50w/w，例如 1 10w/w、l 20w/w、l 30w/w、l 40w/ w、l 50w/wo4、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、 热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物。5、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述肿瘤归巢肽导向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通过将肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段与DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于液体介质中，调节液体介质的pH 值至6. 0-8. O范围内，持续搅拌反应，纯化反应所得物，经冷冻干燥得到的肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。6、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中调节液体介质的pH值至6. 5-7. 5范围内，优选调节PH值至6. 8-7.2的范围内，更优选调节pH值至6. 9-7. 1的范围，最优选调节至PH值为7.0。7、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述液体介质为可将肿瘤归巢肽 CREKA与DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于其中的任意种类的液体介质，例如水性溶剂和有机溶剂。8、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述反应是在惰性气体的保护下进行的。9、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述反应是在环境温度下进行的， 优选在15°C _35°C的温度进行，更优选在20°C -30°C的温度进行，最优选在25°C的温度进行。10、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述搅拌的时间为M小时以上。11、如项5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述纯化反应所得物的步骤是通过对反应所得物进行透析的方法来实现的。12、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述热敏脂质体膜材包括DPPC和 DSPC。13、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述热敏脂质体膜材包括DPPC、 HSPC 禾口 CHOL014、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述热敏脂质体膜材包括DPPC和 MSPC。15、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述热敏脂质体膜材包括DPPC、 MSPC 禾口 DSPG016、如项4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述热敏脂质体膜材包括DPPC和 MPPC017、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之间的摩尔比为 DPPC DSPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=60 100 25 5 0.2 10 0. 2 10，优选70 90 20 10 0.5 5 0.5 5，例如 80 19 0. 5 0. 5,80 18 1 1、80 17 1. 5 1. 5、 80 16 2 2、80 15 2.5 2. 5,80 14 3 3 和 80 10 5 5。18、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC HSPC CHOL DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段=90 110 40 60 20 40 1 6 1 6，例如 95 105 45 55 25 35 2 5 2 5，优选 100 50 30 3 3。19、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括 DPPC、MSPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之间的摩尔比为 DPPC MSPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=80 120 0.5 20 0.2 5 0. 2 5，优选85 100 1 10 0.5 2. 5 0. 5 2. 5，更优选 86 10 2 2、90 10 2 2、95 5 2 2、 97. 5 2.5 2 2、99 :1:2: 2、89 10 2. 5 2. 5,90 10 2 2、 91 10 1.5 1. 5,92 10 1 1 禾口 93 10 0. 5 0. 5。20、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括 DPPC、MSPC, DSPG、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC, DSPG、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC MSPC DSPG DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段=60 100 2 20 2 20 0. 5 5 0. 5 5，优选 70 90 6 10 8 12 1 3 1 3，更优选 82 8 10 2 2。21、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括 DPPC、MPPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MPPC、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC MPPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的月太段=70 110 2 20 0.5 5 0. 5 5，优选80 100 8 12 1 3 1 3，更优选 90 10 2 2。22、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述的靶向热敏脂质体组合物被进一步制成药物剂型，例如注射剂、输液、冻干粉针剂或喷雾剂。23、如项1所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，包括如下步骤以肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物为原料，采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备靶向热敏脂质体组合物。24、如项23所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述采用薄膜分散法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；除去有机溶剂，以在容器壁上形成脂质薄膜；加入任选含有抗肿瘤药物的缓冲液，进行水化处理，以形成粗脂质体混悬液；对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理；对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化，从而得到靶向热敏脂质体组合物。25、如项23所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述采用薄膜分散法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；除去有机溶剂，以在容器壁上形成脂质薄膜；加入任选含有抗肿瘤药物的缓冲液，进行水化处理，以形成粗脂质体混悬液；对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理；对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化；将纯化后的脂质体混悬液与抗肿瘤药物的溶液进行恒温共孵育，并对共孵育后的脂质体进行纯化，从而得到靶向热敏脂质体组合物。26、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述除去有机溶剂是通过在一定温度的水浴条件下(例如30-60°C )减压旋转蒸发来实现的。27、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述水化处理是通过对缓冲液进行涡旋震荡和/或超声处理来实现的。28、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述任选含有抗肿瘤药物的缓冲液为任选含有抗肿瘤药物的硫酸铵缓冲液或PH = 4的柠檬酸缓冲液。29、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理是利用探头超声的超声波细胞粉碎机来实现的。30、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化是通过将超声粉碎处理后的脂质体混悬液通过kphadexG50柱，用磷酸盐缓冲溶液(PBQ或汉克平衡盐溶液(HBQ洗脱并收集脂质体部分来实现的。31、如项M或25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化是通过将超声粉碎处理后的脂质体离心并收集上清部分来实现的。32、如项25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述恒温共孵育是在 37度恒温水浴震荡器中进行的。33、如项25所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述对共孵育后的脂质体进行纯化是通过将共孵育后的脂质体再次通a^phadex G50柱，除去未包封的抗肿瘤药物并收集脂质体部分来实现的。34、如项23所述的靶向热敏脂质体组合物的制备方法，其中所述采用逆向蒸发法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材和DSPE-PEG溶于有机溶剂(如氯仿、乙醚等)中，加入待包封的抗肿瘤药物的水溶液，其中抗肿瘤药物的水溶液与有机溶剂的体积比为抗肿瘤药物的水溶液有机溶剂= 1 3 1 6 ；对上述步骤形成的溶液进行超声，直至形成WO型乳剂；减压蒸发溶剂至形成凝胶；继续减压蒸发，从而得到靶向热敏脂质体组合物；或者在混勻器上机械振荡，使凝胶块破碎并转变成液体，减压蒸发挥去溶剂，从而得到靶向热敏脂质体组合物。35、如项1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。36、如项35所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤。术语“CREKA(cys-arg-glu-lys-ala) ”表示一种由半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸组成的肿瘤归巢肽。“具有CREKA核心序列的肽段”表示核心序列为CREKA的肿瘤归巢肽。可提及的实例包括但不限于环状CREKA-CREKA(通过二硫键相连)。在本发明中，“CREKA”或“具有 CREKA核心序列的肽段”用以修饰热敏脂质体，实现热敏脂质体的主动靶向。上述肽段是本领域的技术人员所容易设计和制备的。“DPPC”表示二棕榈酰磷脂酰胆碱。“MSPC”表示1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱。
“DSPG”表示二硬脂酰磷脂酰甘油。“MPPC”表示肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。“DSPC”表示二硬脂酰磷脂酰胆碱。“HSPC”表示氢化大豆卵磷脂。“CH0L”表示胆固醇。“PBS”表示磷酸盐缓冲溶液。
“HBS”表示汉克平衡盐溶液。"DSPE-PEG-马来酰亚胺”表示1，2_硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇_马来酰亚胺。在本发明中，其用于与CREKA或具有CREKA核心序列的肽段反应构建肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。“DSPE-PEG”表示1，2_硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，其是本领域用于对脂质体进行PEG化(即使脂质体表面修饰有亲水性的PEG分子从而实现脂质体的长循环效应) 的常用物质。“母液”表示配制于适当溶剂中的抗肿瘤药物的溶液。“药脂比”表示药物与脂材的质量比“ %，，如无相反指示，“ %，，表示质量体积百分比。详细说明本发明的下列技术特征之间可以进行任意的组合，以形成不同的技术方案。本发明首先提供一种靶向热敏脂质体组合物，其特征在于所述组合物包括表面修饰有肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体，所述热敏脂质体中包含有抗肿瘤药物。在一个实施方案中，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、顺钼、卡钼、奥沙利钼、甲氨蝶呤等中的一种或多种。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括肿瘤归巢肽导向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物。在一个实施方案中，抗肿瘤药物的药脂比为1 lOw/w 1 50w/w，例如 1 10w/wU 20w/w、l 30w/w、l 40w/w、l 50w/w。在一个实施方案中，所述肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通过将肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段与 DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于液体介质中，调节液体介质的pH值至6. 0-8. O范围内，持续搅拌反应，纯化反应所得物，经冷冻干燥得到的肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。其中，优选调节液体介质的pH值至6. 5-7. 5范围内，更优选调节pH值至6. 8-7. 2 的范围内，更优选调节PH值至6. 9-7. 1的范围，最优选调节至pH值为7. O。 所述液体介质为可将肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于其中的任意种类的液体介质，例如水性溶剂和有机溶剂。适宜的溶剂是本领域的技术人员容易选择和确定的。所述反应优选是在惰性气体的保护下进行的。惰性气体的实例包括但不限于氮气、二氧化碳和惰性稀有气体，例如氖、氩、氪和氙。所述反应优选是在环境温度下进行的，更优选在15-35°C的温度进行，更优选在 20-30°C的温度进行，最优选在25°C的温度进行。所述搅拌的时间优选为M小时以上。所述纯化反应所得物的步骤优选是通过对反应所得物进行透析的方法来实现的。在一个实施方案中，所述热敏脂质体膜材包括DPPC( 二棕榈酰磷脂酰胆碱)和DSPC ( 二硬脂酰磷脂酰胆碱)。在一个实施方案中，所述热敏脂质体膜材包括DPPC、HSPC(氢化大豆卵磷脂)和 CHOL(胆固醇)。在一个实施方案中，所述热敏脂质体膜材包括DPPC及MSPC (1-肉豆蔻酰_2_硬脂酰磷脂酰胆碱)。在一个实施方案中，所述热敏脂质体膜材包括DPPC、MSPC和DSPG ( 二硬脂酰磷脂酰甘油)。在一个实施方案中，所述热敏脂质体膜材包括DPPC和MPPC(肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括DPPC、DSPC、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC D SPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=60 100 25 5 0.2 10 0. 2 10，优选 70 90 20 10 0. 5 5 0. 5 5， 例如 80 19 0. 5 0. 5,80 18 1 1,80 17 1. 5 1. 5,80 16 2 2、 80 15 2.5 2. 5,80 14 3 3 和 80 10 5 5。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括DPPC、HSPC、CHOL、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之间的摩尔比为DP PC HSPC CHOL DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段 =90 110 40 60 20 40 1 6 1 6，例如 95 105 45 55 25 35 2 5 2 5，优选 100 50 30 3 3。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括DPPC、MSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC MSPC D SPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=80 120 0. 5 20 0.2 5 0. 2 5，优选 85 100 1 10 0. 5 2. 5 0. 5 2. 5，更优选 86 10 2 2、90 10 2 2、95 :5:2: 2,97. 5 2. 5 2 2、99 1 2 2、 89 10 2.5 2. 5,90 10 2 2、91 10 1. 5 1. 5,92 10 1 1 和 93 10 0. 5 0. 5。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括DPPC、MSPC、DSPG、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC、DSPG、 DSPE-PEG、DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之间的摩尔比为DP PC MSPC DSPG DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段 =60 100 2 20 2 20 0. 5 5 0. 5 5，优选 70 90 6 10 8 12 1 3 1 3，更优选 82 8 10 2 2。在一个实施方案中，制成所述热敏脂质体的原料包括DPPC、MPPC、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MPPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之间的摩尔比为DPPC MPPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=70 110 2 20 0.5 5 0. 5 5，优选 80 100 8 12 1 3 1 3，更优选 90 10 2 2。所述的靶向热敏脂质体组合物可以进一步制成药物剂型，例如注射剂、输液、冻干粉针剂或喷雾剂。本发明的另一个方面提供所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法，包括如下步骤以肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物为原料，采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备靶向热敏脂质体组合物。在一个实施方案中，所述采用薄膜分散法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；除去有机溶剂，以在容器壁上形成脂质薄膜；加入任选含有抗肿瘤药物的缓冲液，进行水化处理，以形成粗脂质体混悬液；对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理；对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化，从而得到靶向热敏脂质体组合物。在一个实施方案中，所述采用薄膜分散法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；除去有机溶剂，以在容器壁上形成脂质薄膜；加入任选含有抗肿瘤药物的缓冲液，进行水化处理，以形成粗脂质体混悬液；对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理；对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化；将纯化后的脂质体混悬液与抗肿瘤药物的溶液进行恒温共孵育，并对共孵育后的脂质体进行纯化，从而得到靶向热敏脂质体组合物。其中，所述除去有机溶剂优选是通过在一定温度的水浴条件下(例如30-60°C )减压旋转蒸发来实现的。所述水化处理优选是通过对缓冲液进行涡旋震荡和/或超声处理来实现的。所述任选含有抗肿瘤药物的缓冲液优选为任选含有抗肿瘤药物的硫酸铵缓冲液或PH = 4的柠檬酸缓冲液。所述对粗脂质体混悬液进行超声粉碎处理优选是利用探头超声的超声波细胞粉碎机来实现的。所述对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化优选是通过将超声粉碎处理后的脂质体混悬液通过kphadex G50柱，用磷酸盐缓冲溶液(PBQ或汉克平衡盐溶液(HBS) 洗脱并收集脂质体部分来实现的。所述对超声粉碎处理后的脂质体混悬液进行纯化优选是通过将超声粉碎处理后的脂质体离心并收集上清部分来实现的。
所述恒温共孵育优选是在37度恒温水浴震荡器中进行的。所述对共孵育后的脂质体进行纯化优选是通过将共孵育后的脂质体再次通过 Sephadex G50柱，除去未包封的抗肿瘤药物并收集脂质体部分来实现的。在一个实施方案中，所述采用逆向蒸发法制备靶向热敏脂质体组合物包括下述步骤将DSPE-PEG-肿瘤归巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材和DSPE-PEG溶于有机溶剂(如氯仿、乙醚等)中，加入待包封的抗肿瘤药物的水溶液，其中抗肿瘤药物的水溶液与有机溶剂的体积比为抗肿瘤药物的水溶液有机溶剂= 1 3 1 6 ；对上述步骤形成的溶液进行超声，直至形成WO型乳剂；减压蒸发溶剂至形成凝胶；继续减压蒸发，从而得到靶向热敏脂质体组合物；或者在混勻器上机械振荡，使凝胶块破碎并转变成液体，减压蒸发挥去溶剂，从而得到靶向热敏脂质体组合物。优选的，本发明提供一种所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法，所述热敏脂质体中包含水溶性药物(例如阿霉素)，所述方法包括如下步骤将肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材和DSPE-PEG置于茄形瓶中，加入有机溶剂将其溶解，在45°C水浴条件下减压旋转蒸发，形成均勻的透明薄膜；向茄形瓶中加入硫酸铵溶液或PH = 4的柠檬酸缓冲液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈现蓝色乳光；将所得脂质体过kphadex G50柱，用PBS或用pH = 7的HBS，收集脂质体部分，得空白脂质体；将水溶性抗肿瘤药物(例如阿霉素)溶于少量蒸馏水中，与空白脂质体在37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次过kphadex G50柱，除去未包裹的水溶性抗肿瘤药物(例如阿霉素)，收集脂质体部分，即得靶向热敏脂质体组合物。还优选的，本发明提供一种所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法，所述热敏脂质体中包含脂溶性药物，所述方法包括如下步骤将肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材和DSPE-PEG置于茄形瓶中，加入有机溶剂将其溶解，再加入脂溶性抗肿瘤药物母液，在45°C水浴条件下减压旋转蒸发，形成均勻的透明薄膜；向茄形瓶中加入预热(45°C)的PBS或pH = 7的HBS溶液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光；将所得脂质体离心，收集上清部分， 即得靶向热敏脂质体组合物。本发明的另一个方面提供所述靶向热敏脂质体组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。在一个实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤。本发明的优点和/或能够产生的效果(特别是预料不到的技术效果)在于将热敏脂质体在局部加热条件下大量释放所载药物所产生的物理化学靶向与肿瘤归巢肽CREKA的主动靶向相结合，起到协同抗肿瘤作用，对肿瘤的杀伤力更强，对正常组织的毒副作用更低。
图1为阿霉素摄取(流式细胞仪)实验结果图2为阿霉素摄取(激光共聚焦)实验结果图3为药效实验结果
具体实施例方式实施例1肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(5mg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为2 1，溶解于:3ml PBS中(即反应物浓度为^ig/ ml)，调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例2肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(IOmg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为1 1，溶解于5. 55ml PBS中(即反应物浓度为^ig/ ml)，调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例3肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(5mg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为2 1，溶解于6. Iml PBS中(即反应物浓度为Img/ ml)，调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例4肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(5mg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为2 1，溶解于^il PBS中(即反应物浓度为!Bmg/ ml)，调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例5肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(5mg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为2 1，溶解于1.22ml PBS中(即反应物浓度为5mg/ ml)，调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例6肿瘤归巢肽CREKA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的连接
称取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-马来酰亚胺(5mg)，即 CREKA 与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺的摩尔比为2 1，溶解于:3ml DMF中(即反应物浓度为^ig/ ml)，用三乙胺调节pH为7，在氮气保护下，室温搅拌M小时。取上述反应所得物料置于截留分子量为2000的透析袋中透析48小时，经冷冻干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。实施例7CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入异丙醇溶解， 45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的柠檬酸缓冲液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体过kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脱，收集脂质体部分， 得空白脂质体，向空白脂质体中加入2mg/ml的阿霉素母液0.5ml，使药脂比为1 20m/m， 37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次过kphadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例8CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE-PEG-CREKA，置于茄形瓶中，加入二氯甲烷溶解，45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的柠檬酸缓冲液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体a^phadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脱，收集脂质体部分，得空白脂质体，向空白脂质体中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 5ml，使药脂比为1 20m/ m, 37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次过kphadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例9CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC10l.Bmg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，45 度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入PH = 4的柠檬酸缓冲液， 涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体过kphadex G50柱，用HBS(pH = 7)洗脱，收集脂质体部分，得空白脂质体，向空白脂质体中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 5ml，使药脂比为1 20m/m，37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例10CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入异丙醇溶解， 45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的柠檬酸缓冲液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体过kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脱，收集脂质体部分， 得空白脂质体，向空白脂质体中加A^iig/ml的阿霉素母液lml，使药脂比为1 10m/m，37 度恒温水浴震荡器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例11CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mgDSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入异丙醇溶解， 45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的柠檬酸缓冲液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体过kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脱，收集脂质体部分， 得空白脂质体，向空白脂质体中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 25ml，使药脂比为1 40m/m， 37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次过kphadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例12CREKA靶向的阿霉素热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入异丙醇溶解， 45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入硫酸铵溶液(123mM， pH5. 4)，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体过kphadex G50柱，用PBS洗脱，收集脂质体部分，得空白脂质体，向空白脂质体中加入2mg/ml的阿霉素母液0.5ml，使药脂比为1 20m/m，37度恒温水浴震荡器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游离阿霉素，收集脂质体部分，即得最终阿霉素靶向脂质体。实施例13CREKA靶向的紫杉醇热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml乙腈溶解的紫杉醇母液0. 5ml，使药脂比为1 20m/m，45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度预热的5%葡萄糖溶液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。 将所得脂质体离心，12000rpm, 5min,收集上清部分，即得最终紫杉醇靶向热敏脂质体。实施例14CREKA靶向的紫杉醇热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC10I-Bmg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml乙腈溶解的紫杉醇母液0.75ml，使药脂比为1 30m/m，45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度预热的5%葡萄糖溶液，涡旋震荡，超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。将所得脂质体离心，12000rpm，&iiin，收集上清部分，即得最终紫杉醇靶向热敏脂质体。实施例15CREKA靶向的紫杉醇热敏脂质体的构建
原料摩尔比质量或体积
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg称量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml的乙腈溶解的紫杉醇母液lml，使药脂比为1 40m/m，45度水浴条件下减压旋转蒸发，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度预热的5%葡萄糖溶液，涡旋震荡， 超声，至脂膜完全脱落溶解，使用探头超声的超声波细胞粉碎机将样品超声至呈蓝色乳光。 将所得脂质体离心，12000rpm, 5min,收集上清部分，即得最终紫杉醇靶向热敏脂质体。实施例16CREKA靶向的多西紫杉醇热敏脂质体的构建
权利要求
1.一种靶向热敏脂质体组合物，其特征在于所述组合物包括表面修饰有肿瘤归巢肽 CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体，所述热敏脂质体中包含有抗肿瘤药物。
2.如权利要求1所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、顺钼、卡钼、奥沙利钼和甲氨蝶呤中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的靶向热敏脂质体组合物，其中抗肿瘤药物的药脂比(药物与脂材的质量比)为 1 10w/w 1 50w/w，例如 1 10w/wU 20w/w、l 30w/w、l 40w/ w、l 50w/wo
4.如权利要求1-3任一项所述的靶向热敏脂质体组合物，其中制成所述热敏脂质体的原料包括肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、热敏脂质体膜材、DSPE-PEG和抗肿瘤药物。
5.如权利要求4所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述肿瘤归巢肽导向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通过将肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段与DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于液体介质中，调节液体介质的pH 值至6. 0-8. O范围内，持续搅拌反应，纯化反应所得物，经冷冻干燥得到的肿瘤归巢肽导向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。
6.如权利要求5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中调节液体介质的pH值至6.5-7. 5 范围内，优选调节PH值至6. 8-7.2的范围内，更优选调节pH值至6. 9-7. 1的范围，最优选调节至PH值为7.0。
7.如权利要求5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述液体介质为可将肿瘤归巢肽 CREKA与DSPE-PEG-马来酰亚胺溶解于其中的任意种类的液体介质，例如水性溶剂和有机溶剂。
8.如权利要求5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述反应是在惰性气体的保护下进行的。
9.如权利要求5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述反应是在环境温度下进行的，优选在15°C -35°C的温度进行，更优选在20°C -30°C的温度进行，最优选在25°C的温度进行。
10.如权利要求5所述的靶向热敏脂质体组合物，其中所述搅拌的时间为M小时以上。
全文摘要
本发明属于靶向给药系统领域，具体涉及一种靶向热敏脂质体组合物，其特征在于所述组合物包括表面修饰有肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体，所述热敏脂质体中包含有抗肿瘤药物。本发明还涉及所述靶向热敏脂质体组合物的制备方法和所述靶向热敏脂质体组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。本发明的靶向热敏脂质体具有很好的靶向肿瘤的作用及抗肿瘤效果。
文档编号A61P35/00GK102552144SQ20121000996
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张强, 张烜, 王欣 申请人:北京大学