专利名称：一种人工脂质体的制备方法
技术领域：
本发明属于药学领域，涉及一种蛋白质药物脂质体的制备方法，具体涉及一种人工脂质体的制备方法。
背景技术：
由于脂质体独特的物理、生理和药理特征，如具有备整合亲水性和疏水性药物能力、生物适应性好、毒性低、无免疫系统响应及其在作用位点活性药物的靶向缓释能力等， 因此，作为治疗型或诊断型活性试剂，脂质体载体的研究一直以来得到广泛的关注。自从发现脂质体以来，其产品的大小能够从微米到纳米有效地控制；部分载体系统通过表面改性后与多肽、蛋白质和抗体进行了功能性整合。目前，FDA机构已经批准如阿米卡星/HSPC/ CH/DSPG，胞壁酰二肽/DSPC/PS (1:1)等25种以上的脂质体剂型药物在临床试验，部分药品已进入临床应用阶段。脂质体的制备技术主要采取以下4种途径水相搅拌、超声技术(探头超声和水浴超声分散技术)、反向蒸发技术以及冷冻脱水干燥技术。脂质体药物为兼具亲水基团和疏水基团的产品，分别通过以下4种不同的途径对靶向细胞发挥作用网状内皮组织中巨噬细胞和嗜中性粒细胞的内吞作用、药物与细胞表面弱的疏水性(或静电)等非选择性作用以及药物和细胞表面组分的选择性作用、磷脂双分子层插入血清细胞膜并释放到细胞质中、月旨质体转移到细胞内膜或亚细胞器膜中。在以上情况中，较难判断竞争性优势的作用途径，同时对于1种以上的协同作用过程目前尚未清楚。对于治疗型和诊断型脂质体药物，尽管开展了广泛深入的研究工作。然而，在具体药品的开发应用中，脂质体仍存在明显的不足。例如，网状内皮组织细胞对脂质体的生物降解速率很快，导致活性药物组分很难达到稳定、持久的缓释和传递功效。为了克服以上的不足，在脂质体药物的构建中成功采用了 2类聚合材料的改性方法通过亲水性聚合材料如聚乙烯乙二醇(PEG)对现有的脂质体表面进行修饰；此外，可将预包裹的载药脂质体整合到聚合物基质系统中，从而有效控制脂质体药物的缓释和传递。然而，在预包裹载药脂质体与聚合基质的复合构建中，涉及的学科范围广泛同时技术要求严格，需要药学、生物材料科学、化学、分子及细胞生物学相关的研究人员通力合作才能实现。脂质体药物体系具有稳定性差、药物半衰期短和体内药物清除速率快等不足，使用亲水性聚合材料改性后能够明显改善脂质体的药理特性。这种方法兼具了载药脂质体和包裹基质材料的优点，药物的稳定性提高，同时持久的药物传递能力增强。然而，使用亲水性聚合材料的最大缺点在于生物适应性差。为实现载药脂质体与聚合材料的复合构建，须将脂质体暴露在有机溶剂并进行热超声，导致药物的生物活性明显下降。当前，脂质体的构建耦合聚合基质的包裹技术是国内外制药行业的研究热点。这种研究不仅有望提高药物稳定性和持久的缓释控制，维持体内药物水平和延长用药的时间间隔，减小药物对肠胃道等组织的毒副作用；同时有望高效保留药物活力，保证临床的治疗效果。为此，构建并开发了不同的技术用来将载药脂质体包裹进聚合性骨架结构中。总体来看，这种研究仍处于基础的探索阶段，距离临床的成功应用仍有大量的技术难题等待解决。对现有脂质体载体的改性进行技术革新是制药行业的另一个研究热点。磷脂类 (PC)脂质体在国内外的报道已有很多，但PC如蛋黄卵磷脂(EPC)或大豆卵磷脂(SPC)具有构型多变(锥形和圆柱形异构)导致形成的载药脂质体的稳定性较低。在常见的口服或静脉滴注等给药途径中，尽管脂质体药物的药效高，但体液生理条件如酶催化使得载体的稳定性差，直接导致了药物水平的维持和清除时间很短(通常维持数小时)，因此在临床中需要持续给药。专利申请人曾将EPC和SPC分别与无机离子进行杂交，得到了稳定性好、生物适应性高、等电点适中、分离和纯化过程简单且不溶的胶束纳米材料(参见专利 CN102107131A)。相对于其他的脂质体系统，载体材料的制备具有条件十分温和、工艺流程简单等优点，产品分散性高、粒度小(约5nm，与蛋白质和药物分子的几何尺寸具有相同数量级)且分布均勻。蛋黄卵磷脂锆Ur (EPC) 2)和大豆卵磷脂锆Ur (SPC) 2)作为脂质体载体，具有以下的优点1.脂质体制备条件非常温和，避免采用有机溶剂和热超声，有效地预防了蛋白质分子的构型变化和活力下降；2.脂质体药物与基质、底物的分离过程简单，离心和洗涤操作可方便地实现了脂质体纳米颗粒的纯化；3.稳定性高和机械强度适中的载体是保证脂质体药物对于溶剂和加热等条件维持稳定的前提；4.载体对蛋白质药物的吸附容量大， 且通过条件选择可进行人为控制；5.载体与蛋白质的几何尺寸相似，吸附动力学同时兼具主动和被动2个过程，产品的制备周期短。为实现药物的有效传递和安全使用，使用脂质体构建耦合聚合物骨架包裹技术开发新型缓释药物具有非常重要的意义。尽管脂质体技术适用于活性药物的缓释和传递等代谢动力学，然而广泛应用在药剂学时仍然有明显的不足，主要集中在脂质体药物的药效和生物适应性二个方面。具体表现为血浆半衰期短、稳定性差、活力下降、毒副作用强和长期的缓释和传递控制能力低等。聚合材料的表面改性或复合包裹技术能够克服脂质体药物的部分缺点；但是，一方面加剧了包裹药物的构型转变(如蛋白质药物的熔融和纤维化)以及活力下降，另一方面对机体组织的细胞造成了一定的代谢负荷。此外，聚合骨架复合包裹的技术要求极高，需要相关的多学科研究人员通力协作才有可能实现。在为数不多的研究报道中，改性或包裹的脂质体产品的制备工艺繁杂、条件苛刻且工艺周期长。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工脂质体的制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的
一种人工脂质体的制备方法，以纳米球形颗粒的蛋黄卵磷脂锆& (EPC)2或者大豆卵磷脂锆&(SPC)2作为载体，以苦瓜蛋白MAP30、首乌蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作为包裹蛋白，其中载体与包裹蛋白的质量比为74. 3-77. 7:22. 3-25. 7，制备时， 在蛋黄卵磷脂锆ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂锆ττ (SPC) 2的载体材料中加入磷酸盐缓冲溶液， 在温度为4°C，转速为3500rpm的条件下搅拌得到无色、透明的分散液，将包裹蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中，然后缓慢滴加至分散液液中，在低温条件下快速搅拌至形成稳定的脂质体，离心分离出蛋白质后反复洗涤并离心，经低温冷冻干燥得固体产品，固体产品低温保存或无菌生理盐水封存后置于低温条件下储藏，即得成品。
进一步地，所述的载体与包裹蛋白的质量比为75-77:23-25。蛋黄卵磷脂锆(ττ (EPC) 2)和大豆卵磷脂锆(& (SPC) 2)作为脂质体载体，具有以下的优点1.脂质体制备条件非常温和，避免采用有机溶剂和热超声，有效地预防了蛋白质分子的构型变化和活力下降；2.脂质体药物与基质、底物的分离过程简单，离心和洗涤操作可方便地实现了脂质体纳米颗粒的纯化；3.稳定性高和机械强度适中的载体是保证脂质体药物对于溶剂和加热等条件维持稳定的前提；4.载体对蛋白质药物的吸附容量大，且通过条件选择可进行人为控制；5.载体与蛋白质的几何尺寸相似，吸附动力学同时兼具主动和被动2个过程，产品的制备周期短。脂质体包裹的蛋白质分别选择治疗型天然植物药物、脂肪水解酶和免疫诊断试齐U，天然植物蛋白质粗提物分别来自苦瓜种籽和何首乌，为核糖体失活I-型的抗癌药物； 脂肪酶用于水解血液中胆固醇、甘油酯和非游离脂肪酸。本发明免使用水溶性聚合骨架的包裹基质，在脂质体制备中未使用任何有机溶剂、未进行超声处理等工艺条件，构建这种药物脂质体具有重要的临床、医学意义，具有广泛的开发应用价值。脂质体的制备方法采取水相悬浮吸附技术，在低温和搅拌条件下制得人工产品， 载体粒度约为5nm，和蛋白质大小具有相同的数量级。载体粒度小，导致脂质体中蛋白含量大；同时，制备过程中存在主动和被动2种吸附作用。制备过程在一定的吸附动力学条件下实施，设计考察工艺，正交筛选并优化动力学的影响因子。一方面有利于获得组成稳定、蛋白质含量高的脂质体产品；另一方面，有利于考察影响蛋白质药物缓释的具体因素。脂质体药物在进入体液环境后，盐度、PH和脂质体(蛋白质)浓度的梯度变化，药物进行有效释放和传递。其中，蛋白质分子的释放过程呈现主动扩散的特性；同时，稳定的生理酶催化条件有效地促进载体材料的降解，药物释放同时具有侵蚀的扩散特性。本发明方法具有工艺简单、条件温和、重复性高等特点，采用的载体类型为蛋黄卵磷脂锆^"(EPC)2或者大豆卵磷脂锆^(SPC)2的纳米球形颗粒，制备的重复性好且粒度分布均勻，载体对蛋白质药物、酶分子有很高的吸附容量，脂质体中蛋白质含量高达 22. 3-25. 7%，比常见人工脂质体的蛋白包裹效率高1-2个数量级，采用如附图1的构型吸附，蛋白质分子均勻分布在聚合载体的疏水性特殊区域，避免形成蛋白质团聚结构，这种定位、有序构型分布有利于提高蛋白质的生物可利用度；脂质体结构稳定、结合牢固，其稳定储藏时间长达6-10个月，对热的耐受性温度高达60-80°C。
图1为人工脂质体复合物的构型示意图2为苦瓜蛋白质药物MAP30在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验
结果；
图3为苦瓜蛋白质药物MAP30在大豆卵磷脂锆(Zr(SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验
结果；
图4为首乌蛋白质药物GAP31在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验
结果；
图5为首乌蛋白质药物GAP31在大豆卵磷脂锆(Zr(SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果；
图6为脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC) 2)纳米载体的吸附动力学实验结果；
图7为脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂锆(Zr (SPC) 2)纳米载体的吸附动力学实验结果；
图8为牛血清白蛋白(BSA)在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结
果；
图9为牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂锆(Zr (SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结^ ο实施例1
制备苦瓜蛋白MAP30与蛋黄卵磷脂锆& (EPC)2的复合脂质体苦瓜蛋白(来自种子)粗提物，经SDS-PAGE凝胶电泳确认分子量为30 kDa，准确称量6. 8 mg MAP30溶解在1. 0 ml 磷酸盐缓冲液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用；蛋黄卵磷脂锆纳米载体(5nm， 球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量201. 6 μg & (EPC) 2颗粒载体，力口入1.49 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml MAP30 蛋白储备液，分别搅拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量201. 6 μg Zr (EPC) 2颗粒载体，分别加入1. 49 ml不同pH磷酸盐缓冲液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 条件下高速搅拌 (3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白储备液，搅拌15. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2颗粒载体，加入1.49 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 52)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白储备液，搅拌15. 0 小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液 CpH 8. 52)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例1人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；最大蛋白质含量对应的吸附时间为15小时，最佳pH 8. 52，蛋白质的最大百分含量M.0 士 1. 0% ；在注射生理盐水和磷酸盐缓冲液中分散后得无色透明悬浮液；固相条件下，蛋白质热脱附温度为80 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率< 5%)的时间达9个月； 用于核糖体失活型高效抗癌药物稳定剂型的构建和开发，能够用于如I-型HIV的治疗。图2为苦瓜蛋白质药物MAP30在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果；其中实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间15 h，和磷酸盐缓冲溶液(pH 8.52，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例2制备苦瓜蛋白MAP30与大豆卵磷脂锆& (SPC)2的复合脂质体准确称量苦瓜蛋白6. 8 mg溶解在1. 0 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用；大豆卵磷脂锆纳米载体(5nm，球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量201. 6 μg &(SPC)2颗粒载体，加入1.49 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0. 01 ml MAP30蛋白储备液，分别搅拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0、 10. 0,12. 0,15. 0,18. 0,20. 0 和 24. 0 小时，高速离心(12000 rpm) 20min 后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量， 确定最佳吸附时间。准确称量201. 6 Pg &(SPC)2 颗粒载体，分别加入 pH 为 5. 00、5. 49、5. 89、6. 39、 6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02和9. 90磷酸盐缓冲液(1. 49 ml),在4 °C条件下高速搅拌 (3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白储备液，搅拌15. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2颗粒载体，加入1.49 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 9. 02)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白储备液，搅拌15. 0 小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液 CpH 9. 02)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例2人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；产品中蛋白质吸附最大的时间为15小时，最佳pH 9. 02，蛋白质的最大百分含量对.4 士 1. 2% ；在注射生理盐水和磷酸盐缓冲液中分散后得无色透明悬浮液；固相条件下，蛋白质热脱附温度为72 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率彡5%)的时间达6个月；用于核糖体失活型高效抗癌药物稳定剂型的构建和开发，用于I-型HIV的治疗。附图3为苦瓜蛋白质药物MAP30在大豆卵磷脂锆(Zr (SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间15 h，和磷酸盐缓冲溶液 (pH 9.02，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例3
制备首乌蛋白GAP31与蛋黄卵磷脂锆&(EPC)2的复合脂质体首乌蛋白粗提物来自何首乌，经SDS-PAGE凝胶电泳确认分子量为31 kDa。准确称量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸盐缓冲液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用；蛋黄卵磷脂锆纳米载体(5nm， 球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量201. 6 μg & (EPC)2颗粒载体，力口入1.49 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入 0.01 ml GAP31 蛋白储备液，分别搅拌 0. 5、1. 0、4. 0、7. 0、10. 0、12. 0、15. 0、18. 0、 20. 0和24. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量201. 6 μg Zr (EPC) 2颗粒载体，分别加入1. 49 ml不同pH磷酸盐缓冲液 CpH 4. 50,5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4。(条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0. 01 ml GAP31蛋白储备液，搅拌20. 0小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2颗粒载体，加入1.49 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 5. 00)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白储备液，搅拌20. 0 小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液 CpH 5. 00)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例3人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白(淡黄)色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；蛋白质在载体吸附的稳定时间为20小时，缓冲液的最佳pH=5. 00，产品中蛋白质的最大百分含量23. 5 士 1. 2% ；在注射生理盐水和磷酸盐缓冲液中分散后得无(浅黄)色透明悬浮液；固相条件下，蛋白质热脱附温度为78 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率< 5%)的时间达10个月；用于核糖体失活型高效抗癌药物稳定剂型的构建和开发， 杀灭如I-型HIV病毒。附图4为首乌蛋白质药物GAP31在蛋黄卵磷脂锆(Zr (EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间20 h，和磷酸盐缓冲溶液 (pH 5.00，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例4
制备首乌蛋白GAP31与大豆卵磷脂锆&(SPC)2的复合脂质体首乌蛋白粗提物来自何首乌，SDS-PAGE凝胶电泳确认其分子量为31 kDa。准确称量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸盐缓冲液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用；大豆卵磷脂锆纳米载体(5nm， 球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量201. 6 μg & (SPC)2颗粒载体，力口入1.49 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入 0. 01 ml GAP31 蛋白储备液，分别搅拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量201. 6 μg Zr (SPC) 2颗粒载体，分别加入1. 49 ml不同pH磷酸盐缓冲液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 条件下高速搅拌 (3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白储备液，搅拌15. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2颗粒载体，加入1.49 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 5. 89)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白储备液，搅拌15. 0 小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液 CpH 5. 89)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例4人工脂质体产品冷冻干燥3天得产品白(浅黄)色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；蛋白质在载体吸附的稳定时间为15小时，缓冲液的最佳pH=5. 89，产品中蛋白质的最大百分含量23. 8 士 1. 2% ；在注射生理盐水和磷酸盐缓冲液中分散后得无(浅黄)色透明悬浮液；固相条件下，蛋白质热脱附温度为75 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率< 5%)的时间达8个月；用于核糖体失活型高效抗癌药物稳定剂型的构建和开发，滴注杀灭如I-型HIV等病毒。附图5为首乌蛋白质药物GAP31在大豆卵磷脂锆(Zr (SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间15 h，和磷酸盐缓冲溶液 (pH 5.89，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例5
制备脂肪酶CRL与蛋黄卵磷脂锆^(EPC)2的复合脂质体脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)购自Sigma公司，其中蛋白质含量为2. 84% (质量百分比)，SDS-PAGE凝胶电泳确认分子量约为60 kDa。准确称量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，离心分离并洗涤不溶物，上清液收集并调节总体积为1.0 ml (CRL浓度为 3.42 mg/ml)，保存备用；蛋黄卵磷脂锆纳米载体(5nm，球形颗粒)依专利(CN102107131A) 中方法制备。准确称量900 μg & (EPC) 2颗粒载体，加入1.4 ml磷酸盐缓冲液(pH 7.40)， 在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0. 1 ml CRL蛋白储备液， 分别搅拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0、19. 0 和 24. 0 小时，高速离心(12000 rpm)20min 后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量MO μg Zr (EPC) 2颗粒载体，分别加入1. 4 ml不同pH磷酸盐缓冲液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白储备液，搅拌14.0小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (EPC) 2 颗粒载体，加入 1. 4 ml 磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白储备液，搅拌14.0小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例5人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；产品中蛋白质吸附的稳定时间为14小时，最佳pH 8. 59，蛋白质的最大百分含量23. 9 士 1. 2% ；固相条件下，脂质体中的蛋白质热脱附温度为64 0C (5小时以内)；在磷酸缓冲溶液中，脂质体稳定(蛋白质脱附率< 5%)的时间达6个月；用于构建和开发新型、高效的生物酶，催化脂肪水解和酯交换合成的反应。附图6为脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黄卵磷脂锆(& (EPC) 2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间14 h，和磷酸盐缓冲溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例6
制备脂肪酶CRL与大豆卵磷脂锆^(SPC)2的复合脂质体脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)购自Sigma公司，蛋白质的质量百分比为2. 84%，SDS-PAGE凝胶电泳确认分子量约为60 kDa。准确称量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，离心分离并洗涤不溶物，上清液收集并调节总体积为1.0 ml (CRL浓度为3. 42 mg/ ml)，保存备用；大豆卵磷脂锆纳米载体(5nm，球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量900 μg & (SPC)2颗粒载体，加入1.4 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 40)，在4冗条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白储备液，分别搅拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0,19. 0 和 24. 0 小时，高速离心(12000 rpm)20min 后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量1. 26 mg & (SPC)2颗粒载体，分别加入1. 4 ml不同pH磷酸盐缓冲液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白储备液，搅拌19. 0小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (SPC) 2 颗粒载体，加入 1. 4 ml 磷酸
盐缓冲溶液(pH 8. 59)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白储备液，搅拌19.0小时，高速离心(12000 rpm) 20min后分离上清液。固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例6人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；产品中蛋白质吸附的稳定时间为19小时，最佳pH 8. 59，蛋白质的最大百分含量1 士 1. ;固相条件下，脂质体中的蛋白质热脱附温度为60 0C (5小时以内)；在磷酸缓冲溶液中，脂质体稳定(蛋白质脱附率< 5%)的时间达6个月；用于构建和开发新型、高效的生物催化剂，促进脂肪水解和酯交换合成的反应。附图7为脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂锆(Ir (SPC) 2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间19 h，和磷酸盐缓冲溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例7
制备牛血清白蛋白BSA与蛋黄卵磷脂锆&(EPC)2的复合脂质体牛血清白蛋白购自 Sigma公司，分子量为66. 5 kDa，蛋白质含量为90%。准确称量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸盐缓冲液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用(BSA浓度为3. 42 mg/ml)；蛋黄卵磷脂锆纳米载体(5nm，球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量1. 1 mg Zr (EPC) 2颗粒载体，加入1.4 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白储备液，分别搅拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. 0,14. 0,19. 0和24. 0小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用
0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量MO μg Zr (EPC) 2颗粒载体，分别加入1. 4 ml不同pH磷酸盐缓冲液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白储备液，搅拌19.0小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 ^g Zr (EPC) 2 颗粒载体，加入 1. 4 ml 磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白储备液，搅拌19.0小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例7人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；产品中最大蛋白质含量的吸附时间为19小时，最佳pH 8. 59，蛋白质的最大百分含量对.5 士 1.2%;固相条件下，蛋白质热脱附温度为70 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率(5%)的时间达9个月；用于构建和开发新型、稳定的免疫诊断试剂，用于生物和医学检测。附图8为牛血清白蛋白(BSA)在蛋黄卵磷脂锆(Zr(EPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间19 h，和磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。实施例8
制备牛血清白蛋白BSA与大豆卵磷脂锆&(SPC)2的复合脂质体牛血清白蛋白购自 Sigma公司，分子量为66. 5 kDa，蛋白质含量为90%。准确称量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸盐缓冲液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存备用(BSA浓度为3. 42 mg/ml)；大豆卵磷脂锆纳米载体(5nm，球形颗粒)依专利(CN102107131A)中方法制备。准确称量1. 1 mg Zr (SPC) 2颗粒载体，加入1.4 ml磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白储备液，分别搅拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. O、14. O、19. O和24. O小时，高速离心(12000 rpm)20min后分离上清液。固体颗粒使用 0. Iml磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附时间。准确称量1. 26 mg & (SPC)2颗粒载体，分别加入1. 4 ml不同pH磷酸盐缓冲液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白储备液，搅拌Μ. O小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml相应pH磷酸盐缓冲溶液洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，确定最佳吸附酸度。分别称量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 μδ Zr (SPC) 2 颗粒载体，加入 1. 4 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)，在4 ° C条件下高速搅拌(3500 rpm)至载体完全悬浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白储备液，搅拌Μ. 0小时，高速离心(12000 rpnO20min后分离上清液。 固体颗粒使用0. Iml磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59)洗涤后离心，重复3次，合并上清液测定残余蛋白质量，计算蛋白质吸附容量。实例8人工脂质体产品
冷冻干燥3天得产品白色粉末，不溶于水和极性有机溶剂；产品中蛋白质吸附稳定时间为M.0小时，最佳pH 8. 59，蛋白质的最大百分含量对.2 士 1.2%;固相条件下，蛋白质热脱附温度为68 0C (5小时以内)；在模拟体外的生理条件下，脂质体稳定(蛋白质脱附率 ^ 5%)的时间达9个月；用于构建新型、稳定的生物和医学免疫诊断试剂盒。附图9为牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂锆(Zr(SPC)2)纳米载体的吸附动力学实验结果。实验条件T= 4 °C，搅拌速率3500 rpm，搅拌时间M h，和磷酸盐缓冲溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分别表示上清液蛋白质残余浓度和蛋白吸附量占总蛋白量的比例。
权利要求
1.一种人工脂质体的制备方法，其特征是以纳米球形颗粒的蛋黄卵磷脂锆ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂锆^(SPC)2作为载体，以苦瓜蛋白ΜΑΡ30、首乌蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作为包裹蛋白，其中载体与包裹蛋白的质量比为74. 3-77. 7:22. 3-25. 7， 制备时，在蛋黄卵磷脂锆ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂锆ττ (SPC) 2的载体材料中加入磷酸盐缓冲溶液，在温度为4°C，转速为3500rpm的条件下搅拌得到无色、透明的分散液，将包裹蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中，然后缓慢滴加至分散液液中，在低温条件下快速搅拌至形成稳定的脂质体，离心分离出蛋白质后反复洗涤并离心，经低温冷冻干燥得固体产品，固体产品低温保存或无菌生理盐水封存后置于低温条件下储藏，即得成品。
2.根据权利要求1所述的一种人工脂质体的制备方法，其特征是所述的载体与包裹蛋白的质量比为75-77:23-25。
全文摘要
本发明公开了一种人工脂质体的制备方法，属于药学领域，涉及一种蛋白质药物脂质体的制备方法。以纳米球形颗粒的蛋黄卵磷脂锆或者大豆卵磷脂锆作为载体，以苦瓜蛋白MAP30、首乌蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作为包裹蛋白，其中载体与包裹蛋白的质量比为74.3-77.7:22.3-25.7，制备时，在载体材料中加入磷酸盐缓冲溶液，在温度为4℃，转速为3500rpm的条件下搅拌得到无色、透明的分散液，将包裹蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中，然后缓慢滴加至分散液液中，在低温条件下快速搅拌至形成稳定的脂质体，离心分离出蛋白质后反复洗涤并离心，经低温冷冻干燥即得成品。本发明方法具有工艺简单、条件温和、重复性高，蛋白质吸附容量大，脂质体结构稳定的特点。
文档编号A61K38/38GK102552145SQ20121002325
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月2日 优先权日2012年2月2日
发明者乔元彪 申请人:吕梁学院