酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合的制作方法

专利名称：酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合的制作方法
技术领域：
本申请提供了通过将活性部位特异陪伴分子(ASSC)与蛋白质替代治疗联合来提高所施用蛋白质稳定性和功效的改良的蛋白质替代疗法。本申请进一步提供了包含纯化蛋白质和ASSC的组合物。
背景技术：
蛋白质缺乏病蛋白质是在细胞内根据特定基因的基因组核苷酸序列通过转录、翻译和其它过程合成的。蛋白质缺乏病可以由编码基因的突变引起，该突变导致(i)蛋白质不能合成；(ii) 缺乏生物学活性的蛋白质的合成；或(iii)包含正常或部分生物学活性、但不能够适当加工以达到蛋白质的天然区室的蛋白质的合成。源于遗传突变的蛋白质缺乏病也叫做遗传病。除了源于遗传突变的蛋白质缺乏病外，一些蛋白质缺乏病可以由疾病或者疾病治疗(例如化学疗法)的副作用或者营养不量的后果引起。当前疗法蛋白质的缺乏会导致多种疾病，一些疾病是由突变的、错折叠的蛋白质引起的(构象疾病-下同)。用于治疗蛋白质缺乏病的一种当前疗法是蛋白质替代疗法，该方法一般涉及静脉内、皮下或肌内灌注纯化形式的相应野生型蛋白质，或者植入生物易蚀固体形式的蛋白质以便持续释放。由于所灌注的蛋白质会被迅速地降解，所以蛋白质替代疗法的一个主要的复杂因素是蛋白质治疗有效量的实现和维持。克服该问题的当前方法是多次高成本的高剂量灌注。蛋白质替代疗法具有几个额外的限制，例如大规模产生、纯化和贮藏正确折叠蛋白质上的困难、得到糖基化的天然蛋白质上的困难、抗蛋白质免疫反应的产生以及在具有明显牵涉中枢神经系统的疾病中不能够穿过血-脑屏障。使用包含编码功能蛋白质的核酸序列的重组载体的基因治疗，或者使用表达功能蛋白质的经遗传修饰的人细胞的基因治疗，也可以用来治疗蛋白质缺乏病和能从蛋白质替代中受益的其它疾病。虽然该方法有希望，但由于技术难题使该方法受到了限制，例如载体不能够感染或转导正在分裂的细胞、靶基因的低表达、以及基因一旦被递送后对表达的调节。第三，治疗蛋白质缺乏病的相对较新的方法涉及到小分子抑制剂的使用以降低所缺乏酶蛋白质的天然底物，从而改善病理学。此种“底物剥夺”的方法已经在称作溶酶体贮积病或鞘糖脂贮积疾病的一类大约40种相关酶疾病中被具体地描述。这些可遗传疾病的特征是缺乏能够催化降解细胞内糖脂的溶酶体酶，导致脂类不正常积累，这打乱了细胞的功能。计划用于治疗的小分子抑制剂对于抑制参与糖脂合成的酶是特异的，该种抑制降低了需要由所缺乏酶降解的细胞内糖脂的量。该方法也受到了限制，因为糖脂对于生物学功能是必需的，并且过度的剥夺会引起副作用。具体而言，糖脂能够被脑用来从神经元的神经节苷脂传递信号到其它神经元。如果糖脂太少或太多，神经元传递信号的能力受到阻碍。如下作为特异陪伴分子进行讨论的第四种方法使突变型蛋白质免受内质网内的降解。蛋白质在内质网内的加工蛋白质在细胞质内合成，并且新合成的蛋白质以很大程度未折叠的状态分泌进入内质网(ER)的腔内。通常，蛋白质折叠受自组装原则的控制。新合成的多肽根据它们的氨基酸序列折叠成它们的天然构象(Anfinsen等,Adv. Protein Chem. 1975 ；29 :205-300)。在体内，蛋白质折叠是复杂的，因为环境温度和高蛋白质浓度的结合会刺激聚集过程，在该过程中通常埋于疏水核心内的氨基酸会与它们相邻的氨基酸发生非特异的相互作用。为了避免出现这种问题，通常通过特定的一组称作分子侣伴的蛋白质促进蛋白质的折叠，分子侣伴阻止了初生多肽链的聚集并且能够结合到未折叠的蛋白质上以致于蛋白质以天然构象重折叠(Hartl，Nature 1996 ；381 :571-580)。分子侣伴实际上存在于所有类型的细胞和大部分细胞区室内。一些参与蛋白质的转运并且允许细胞在诸如热休克和葡萄糖饥饿的应激条件下存活(Gething等，Nature 1992 ；355 :33-45 ；Caplan, Trends Cell.Biol. 1999 ；9 :262-268 ；Lin 等，Mol. Biol. Cell. 1993 ；4 :109-1119 ;Bergeron等，Trends Biochem. Sci. 1994 ；19 :124-128)。在分子侣伴中，Bip(免疫球蛋白重链结合蛋白，Grp78)是特征最清楚的ER的陪伴分子(Haas，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991 ；167 :71-82)。像其它分子侣伴一样，Bip与ER内的许多分泌蛋白和膜蛋白在这些蛋白质的整个成熟过程中发生相互作用，虽然在折叠平稳进行过程中这种相互作用通常很弱并且是短寿命的。一旦完成天然蛋白质的构象，分子侣伴不再与蛋白质相互作用。结合到在折叠、装配或正确糖基化方面失败的蛋白质上后的Bip变得稳定， 并且导致了蛋白质通过ER相关途径的降解。该过程作为ER内的“质量控制”系统起作用， 保证了只有那些正确折叠和装配的蛋白质能够转运出ER用于进一步的成熟，并且错折叠的蛋白质滞留其中进行随后的降解(Hurtley等，Annu. Rev. Cell. Biol. 1989 ；5 :277-307)。某些DNA突变导致氨基酸替代，这种替代进一步阻止并且在许多情况下排除突变型蛋白质的正确折叠。为了纠正这些错折叠，研究人员尝试了使用多种分子。已经表明在一些疾病中高浓度的甘油、二甲基亚砜(DMSO)、三甲胺-N-氧化物(TMAO)或者重水抑制降解途径并增加突变型蛋白质的细胞内转运(Brown等，Cell Stress Chaperones 1996 ；1 117-125 ；Burrows 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 ；97 :1796-801)。虽然其功能机制还不清楚，但是这些化合物被认为是能够促进一般蛋白质折叠的非特异的化学陪伴分子。虽然它们对于细胞内蛋白质折叠缺陷的生物化学检查是有用处的，但起功效时要求该类化合物的高剂量使得它们在临床上应用困难或不适宜用于临床。这些化合物还缺乏特异性。特异的陪伴分子策略先前的专利和公开描述了拯救内源性酶蛋白质特别是错折叠的溶酶体酶免受通过ER质量控制机制而降解的治疗策略。该策略使用对与特定溶酶体病相关的缺陷溶酶体酶特异的小分子可逆竞争性抑制剂。该策略如下由于突变型酶蛋白质在ER内不正确折叠
4(Ishii 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996 ；220 ;812_815)，酶蛋白质被滞留于正常的转运途径(ER—高尔基体一内体一溶酶体)并且被快速地降解。因此，促进突变型蛋白质正确折叠的功能性化合物将作为针对突变型蛋白质的位点特异的陪伴分子而在促进从ER质量控制系统内顺利逃脱。由于已知酶的一些抑制剂占据酶的催化中心，导致了体外其构象的稳定。这些特异的陪伴分子可以称作活性部位特异陪伴分子(ASSC)。在Fan 等的美国专利号 6，274，597,6, 583，158,6, 589，964 和 6，599，919 和 2002 年 11月26日申请的待决美国申请系列号10/304，396 (此处完全引用作为参考)中已经专门阐述了参与溶酶体贮积病的酶的策略。例如，半乳糖的小分子衍生物，I-脱氧半乳糖野尻霉素(nojirimycin) (DGJ),是一种突变型法布里(Fabry)酶α -半乳糖苷酶A ( a-Gal Α)的有效的竞争性抑制剂，能够有效提高中性pH下突变型α-Gal A(R301Q)的体外稳定性并且增强从具有R301Q或者Q279E突变的法布里病人中建立的淋巴母细胞中突变型酶的活性。 此外，过量表达突变型(R301Q) a -Gal A的转基因小鼠经口施用DGJ会在主要器官大量地提高酶活性(Fan等，Nature Med. 1999 ；5 :112-115)。对错折叠蛋白质的成功拯救取决于特异抑制剂在体内达到的浓度，该浓度低于酶的完全抑制浓度，相比之下底物剥夺方法中需要酶的抑制浓度。除了溶酶体贮积病外，现在认为大量并且多种疾病也是由于采用非天然蛋白质构象所导致的构象疾病，这可能导致蛋白质在ER内滞留并最终导致蛋白质的降解(Kuznetsov 等，N. Engl. J. Med. 1998 ；339 1688-1695 ；Thomas 等，Trends Biochem. Sci. 1995；20 :456-459 ;Bychkova等，FEBS Lett. 1995；359 :6_8 ；Brooks,FEBS Lett. 1997； 409 :115-120)。ASSC表现出拯救除了酶外的突变型蛋白质的表达。例如，发现小的合成化合物会稳定突变型形式的肿瘤抑制基因蛋白P53的DNA结合结构域，因此允许蛋白质维持活性构象(Foster等,Science 1999 ；286 :2507-10)。已经表明通过小分子受体拮抗物和配体可以摇救受体的合成(Morello 等，J. Clin. Invest. 2000 ； 105 :887-95 ;Petaja_Repo 等， EMBO J. 2002 ；21 :1628-37)。已经证明甚至通过使用通道阻断药物或底物对膜通道蛋白质和其它质膜转运蛋白进行药学摇救(Rajamani等，Circulation 2002 ； 105 :2830-5 ；Zhou 等，J. Biol. Chem. 1999 ；274 :31123-26 ；Loo 等，J. Biol. Chem 1997 ；272 :709-12)。上述所有文献显示ASSC有能力特异地拯救包括但不限于酶、受体、膜通道蛋白质和DNA转录因子在内的突变型蛋白质。除了突变型蛋白质以外，ASSC还表现出能够稳定野生型蛋白质，导致它们的产量和稳定性提高。如在一个实例中，已经证明特定ASSC即DGJ能够增加用编码野生型a -Gal A序列的载体转染的C0S-7细胞内野生型a -Gal A的数量和活性。ASSC拯救过量表达的野生型酶，否则这些酶会滞留于ER质量控制系统，因为在C0S-7细胞中所述酶的过量表达和过量产生超过了该系统的容量并且导致聚集和降解(见03年2月28日申请的美国申请系列号 10/377，179)。总之，当应用蛋白质替代治疗例如施用替代蛋白质治疗蛋白质缺乏病或其它疾病时，本领域需要提高生物学功效和成本效率的方法。发明概述本发明提供了增强纯化蛋白质稳定性的方法，该方法包括将于可药用载体中的蛋白质与活性部位特异陪伴分子相互接触。
纯化的蛋白质可以是重组蛋白质并且可以是保留活性的全长的或截短的蛋白质。本发明还提供了通过将于可药用载体中的蛋白质与活性部位特异陪伴分子相互接触使得蛋白质在体外的贮存期限得到提高的方法。可药用载体中的蛋白质可以是冷冻干燥的或者是水溶液。本发明进一步提供了延长纯化蛋白质在用于可药用载体中的蛋白质施用的个体内的半衰期和体内活性的方法，该方法包括将蛋白质与于可药用载体中的活性部位特异陪伴分子相接触。本发明提供了用于对患有需要进行蛋白质替代的疾病(例如蛋白质缺乏疾病)的个体进行治疗的方法，其包括对个体施用纯化的替代蛋白质和能够稳定替代蛋白质的活性部位特异陪伴分子(ASSC)。在一个实施方案中，替代蛋白质是一种与构象疾病相关的蛋白质。在一个优选地实施方案中，构象疾病是溶酶体贮积病。在一个实施方案中，溶酶体贮积病是法布里病。在另一个实施方案中，溶酶体贮积病是戈谢病。本发明还提供了在蛋白质替代治疗的同时增强突变型内源性蛋白质的稳定性的方法，该蛋白质由于在ER内的缺陷性的折叠和加工而变得缺乏。随着所施用的对应于突变型蛋白质的替代蛋白质稳定性的增加，内源性蛋白质的稳定性和因此而来的活性增强了。本发明进一步提供了通过将宿主细胞与包含针对蛋白质的ASSC的培养基相接触而增加由非哺乳动物宿主细胞产生的重组蛋白产量的方法。本发明进一部提供了于可药用载体中的包含纯化蛋白质和针对纯化蛋白质的 ASSC的组合物。附图
简述图I表明使用部位特异陪伴分子I-脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ，I μ Μ)的野生型和突变型a-Gal A稳定性分别提高，野生型a-Gal A是从用带有人野生型a-Gal A cDNA的重组杆状病毒感染的Sf-9细胞的培养基中纯化的，突变型a -Gal A是从过量表达人突变型(R301Q) α-Gal A的转基因小鼠的心脏匀浆液中收集的。实验前，将小鼠用作为饮用水的 O. 5mM DGJ处理一周。将突变型(A)和野生型(B)的酶在浓度为1μΜ(〇)，0. 1μΜ(·)， O. 03μΜ(4)或ΟμΜ(没有DGJ ; )的DGJ存在的条件下，分别于37°C和42°C用O. IM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7. O)进行预培育，对于突变型酶为37°C对于野生型酶为42°C。 酶活性报导为与未进行预培育的酶相比的相对值。DGJ可以作为稳定剂防止突变型和野生型酶的变性/降解。发明详述本发明通过将蛋白质与活性部位特异陪伴分子(ASSC)相接触有利地改进了用于治疗疾病或病症的蛋白质替代疗法的疗效。本发明的优点体现在(a)提高非哺乳动物细胞产生蛋白质的效率；(b)增加治疗蛋白质的稳定性，表现为更长的贮存期限和更好的体内半衰期和活性；(C)在体内转运包括跨细胞膜转运时维持蛋白质活性部位的结构；和(d)拯救内源性突变型蛋白质，该蛋白质在合成过程中发生错折叠并随后从内质网中清除掉。本发明进一步提供了包含蛋白质和特异性稳定蛋白质的活性部位特异陪伴分子 (ASSC)的制剂。
本发明是以这样的发现为基础的，即在遗传病和其它疾病的治疗中ASSC能够作为蛋白质替代疗法的联合治疗而使用。使用本领域已知的方法可以对ASSC进行筛选和鉴定。一旦鉴定出一种对特定疾病有用的ASSC，则可将ASSC施用于接受蛋白质替代治疗的病人，以增强替代蛋白质在恰当细胞区室中的吸收、提高循环中蛋白质的稳定性，以及根据需要提高在转运进入细胞期间的蛋白质的稳定性。在制造、贮存和体内使用过程中，陪伴分子可以稳定蛋白质的活性形式。定义在每个术语所使用的本发明上下文中和其所使用的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有本领域中其通常的含义。为了在描述本发明的组合物和方法以及怎样使用它们方面对医师提供额外的指导，一些术语在下面讨论，或者在说明书的其它地方讨论。具体定义.术语“蛋白质替代”是指将非天然的、纯化的蛋白质导入患有该蛋白质缺乏病的个体中。所施用的蛋白质可以从天然来源得到(例如用于治疗RSV和单核细胞增多症的人丙种球蛋白)或者通过重组表达得到(如下面比较详细的描述)。该术语还指纯化蛋白质向个体的导入，此处所述的个体需要施用纯化蛋白质或者从纯化蛋白质的施用中受益，例如患有蛋白质缺乏的个体。所导入的蛋白质可以是纯化的、经体外产生的重组蛋白或者从诸如胎盘或动物乳汁的离体组织或液体中或者植物中纯化的蛋白质。术语“通过蛋白质缺乏表征的疾病”指存在由蛋白质缺乏或数量不足导致的出现病理变化的任何疾病。该术语包含导致生物学失活蛋白质产物的蛋白质折叠疾病，即构象疾病。在传染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺问题、放射病、营养缺乏、中毒、或其它环境或外部创伤中可涉及到蛋白质不足。术语“稳定正确构象”指化合物或肽或其它分子与在体外例如在制剂中和体内与野生型蛋白质或者能够行使野生型功能的突变型蛋白质结合从而使野生型或突变型蛋白质的结构可以维持其天然或正确形式的能力。这种作用通过(i)蛋白质贮存期限的提高；
(ii)每单位量的蛋白质的较高的活性；或者(iii)体内效能更强中的一种或多种实践性地证明了。这通过表达时提高的从ER中的产量、对由于温度提高或离液剂的存在所导致对解折叠的较大抗性以及通过相似的方法实验性地观察到。如此处所使用，术语“构象病”或“构象疾病”指采用的蛋白质构象所导致的疾病， 其中所述的蛋白质构象不能被具有正常生物学活性的野生型蛋白质在天然条件下正常地形成，这种疾病会导致蛋白质在ER中滞留和破坏。降低的蛋白质水平导致生理性不平衡， 其表现为一种疾病或病症。在一个具体的实施方案中，构象疾病是溶酶体贮积病。如此处所使用，术语“活性部位”指蛋白质具有一些特异生物学活性的区域。例如，它可以是结合底物或其它结合配偶体(partner)的部位和贡献直接参与产生和打断化学键的氨基酸残基的部位。在本发明中活性部位可以包括酶的催化位点、抗体的抗原结合位点、受体的配体结合结构域、调节物的结合结构域或者分泌蛋白质的受体结合结构域。活性部位还可以包括反式激活、蛋白质-蛋白质相互作用、或转录因子和调节物的DNA结合结构域。如此处所使用，术语“活性部位特异陪伴分子”指能够特异地与蛋白质活性部位可逆相互作用并且增强稳定分子构象形成的包括蛋白质、肽、核酸、糖类在内的任何分子。如此处所使用，“活性部位特异陪伴分子”不包括存在于细胞ER中的内源性普通陪伴分子如Bip、钙联接蛋白或钙网蛋白，或者通常的非特异化学陪伴分子如重水、DMSO或ΤΜΑ0。一般定义如此处所使用术语“纯化的”指在降低或消除无关材料即污染物存在的条件下被分离的材料，其中所述无关材料包括最终所得材料之来源的天然材料。例如，纯化的蛋白质优选地基本上没有在细胞内能与其结合的其它蛋白质或核酸；纯化的核酸分子优选地基本上没有在细胞内的蛋白质或其它无关核酸分子。如此处所使用，术语“基本上没有”在材料的分析测试上下文中可以操作性地使用。优选地，基本上不含杂质的纯化的材料为至少95%的纯度；更加优选地，至少97%的纯度，并且更加优选地还可以至少99%的纯度。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物学鉴定和本领域已知的其它方法估计出来。在一个特定的实施方案中，纯化的意思是指污染物的水平低于施用于人或非人动物的规管局所接受的水平。在优选的实施方案中，术语“大约”和“约”通常指根据测量的性质和精度而定的测量数量的可接受程度的误差。一般地，例证的误差程度在给定数值或数值范围的20%以内，优选地在10 %以内，并且更加优选地在5 %以内。备选地，并且尤其是在生物学系统中， 术语“大约”和“约”可指给定数值的一个数量级内的数值，优选地在10倍或5倍以内，并且更加优选地在2倍以内。除非另外声明，当文中指出数字的量是近似的时，是指不进行表述性的陈述而引用的术语“大约”或“约”。“基因”是编码功能性“基因产物”的核苷酸序列。通常，基因产物是功能性蛋白质。 然而，基因产物还可以是细胞内其它类型的分子，例如RNA (例如tRNA或者rRNA)。为了本发明的目的，基因产物还指在细胞内可以发现的mRNA序列。术语“表达”意思是指通过活化参与相应基因或DNA序列转录和翻译的细胞内功能而允许或导致基因或DNA序列中的信息变成表现形式，例如产生RNA (例如rRNA或mRNA) 或蛋白质。DNA序列由细胞表达以形成诸如RNA(例如mRNA或rRNA)和蛋白质的“表达产物”。表达产物本身例如最终的RNA或蛋白质可以称作被细胞“表达的”。术语“转染”意思是指将外源核酸导入细胞内。术语“转化”意思是指将“外来的”(即外部的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞以致于宿主细胞表达导入的基因或序列以产生目的物质，其中所述的目的物质在本发明中一般是指被所导入基因或序列编码的RNA，也可以是被所导入基因或序列编码的蛋白质或酶。所导入的基因或序列还可以称作“克隆的”或“外来的”基因或序列，可以包括调节或控制序列(例如被细胞的遗传机制所使用的起始、终止、启动子、信号、分泌或其它序列)。基因或序列可包括非功能性序列或未知功能序列。接受并表达所导入DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化了”并且是一个“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自于许多来源，包括与宿主细胞同一属或种的细胞或不同属或种的细胞。术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意思是指运载体，通过该运载体将DNA或 RNA序列(例如外来基因)导入宿主细胞从而转化宿主和促进所导入序列的表达(例如转录和翻译)。术语“表达系统”意思是指在适宜条件下的宿主细胞和相容的载体，该适宜条件例如为了表达由载体携带的并已导入宿主细胞的外来DNA所编码的蛋白质。常用的表达系统包括大肠杆菌(E. coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞例如Sf9、Η 5或S2细胞和杆状病毒载体和表达系统、以及哺乳动物宿主细胞和载体。
术语“突变型”和“突变”意思是指遗传物质例如DNA中的任何可检测的变化或此种变化的任何过程、机制或结果。它包括基因结构(例如DNA序列)发生改变的基因突变、源于任何突变过程的基因或DNA、或由修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(如 RNA、蛋白质或酶)。如此处所使用术语“突变型蛋白质”是指从含有能导致蛋白质序列改变的遗传学突变的基因翻译而来的蛋白质。在一个特定的实施方案中，此种突变导致蛋白质在通常存在于ER内的条件下不能达到其天然构象的能力。在实现此种构象上的失败导致了蛋白质被降解，而不是通过蛋白质转运系统中它们的正常途径转运至它们在细胞内的正常位置。 其它突变可以导致活性的降低或周转更快。“野生型基因”指编码在体内具有正常生物学功能活性的蛋白质的核酸序列。野生型核酸序列可含有不同于已知公布的、能导致对生物学活性影响很小或没有的氨基酸替代的改变的、核苷酸的变化。术语野生型也可包括为了编码相对于内源或天然蛋白质能够提高或增强活性的蛋白质而经过改造的核酸序列。“野生型蛋白质”指由野生型基因编码的蛋白质，当在体内表达或导入时该蛋白质具有功能性生物学活性。术语“正常的野生型活性”指蛋白质在细胞内的正常的生理功能。 蛋白质的功能性可通过已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。术语“经遗传修饰的”指在导入包含编码基因产物的编码序列和控制编码序列表达的调节元件的核酸之后，表达特定基因产物的细胞。核酸的导入可以通过包括基因寻靶和同源重组在内的本领域已知的方法来实现。如此处所使用，该术语还包括已经经过工程改造例如通过基因活化技术表达或过量表达内源性基因或基因产物的细胞，此处所述的基因和基因产物不能由该细胞正常表达。短语“可药用”，不论其是否与本发明的药用组合物联合使用，指当施用于人时能够生理性耐受的并且一般不产生不利反应的分子和组合物。优选地，如此处所使用，术语 “可药用”意思是指联邦政府或州政府规管局认可的或者美国药典或其它用于动物的并且更加具体地用于人的一般公认的药典中列出的。术语“载体”指化合物与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药用运载体可以是无菌液体例如水和油。水或水溶液、 盐溶液和水溶右旋糖和甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射溶液。适当的药用运载体在 E. W. Martin 的 “Remington，s Pharmaceutical Sciences”,第 18 版中进行了描述。术语“治疗有效量”和“有效量”指足以导致治疗反应的化合物的量。在ASSC和蛋白质以复合物形式施用的实施方案中，术语“治疗有效量”和“有效量”指足以导致治疗反应的复合物的量。治疗反应可以是使用者(例如临床医生)所识别的作为对治疗有效反应的任何反应。因此，治疗反应通常是疾病或病症的一种或多种症状的缓解。值得注意，为了本发明的目的，由于当体内施用时ASSC的稀释(和随后的由于平衡的变化导致的结合转换)、生物利用率和代谢，在纯化的治疗蛋白质的体外产生、运输或贮存过程中呈抑制性效应的ASSC浓度也可构成“有效量”。通过蛋白质缺乏所表征的疾病当前有大约1100种已知的遗传性疾病是以蛋白质缺乏或在特定的组织中丧失功能为特征的。理论上这些疾病可以通过蛋白质替代治疗来治疗。本发明的方法着眼于对当前适用于蛋白质替代治疗的蛋白质的共治疗(co-therapy)，该蛋白质替代治疗可以是现在CN 102580067 A
可得的或者在将来是可得的。在此种疾病中，个体的一些细胞或所有细胞缺乏足够功能的蛋白质、包含失活形式的蛋白质或者包含对于生物学功能而言不足够的水平。更进一步，被鉴定为由能够导致蛋白质缺乏的蛋白质折叠改变的突变和突变型蛋白质在ER滞留所产生的构象性失调的疾病名单正在增加。它们包括囊性纤维化、α I-抗胰蛋白酶缺乏、家族性高胆固醇血症、法布里病、阿尔茨海默氏病(Selkoe， Annu. Rev. Neurosci. 1994 ； 17 :489-517)、成骨不全(Chessler 等，J. Biol. Chem. 1993 ； 268 :18226-18233)、糖类缺乏的糖蛋白综合症(Marquardt 等，Eur. J. Cell. Biol. 1995 ； 66 :268-273)、马-兰综合症(Bradford 等，Biochem. J. 1999 ；341 :193-201)、遗传性盲 (Kaushal 等，Biochemistry 1994 ；33 :6121_8)、格兰茨曼血小板无力症(Kato 等，Blood 1992 ；79 :3212-8)、遗传性凝血因子 VII 缺乏病(Arbini 等，Bloodl996 ；87 :5085-94)、眼皮肤白化病(Halaban 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 ；97 =5889-94)和蛋白质 C 缺乏病(Katsumi等，Blood 1996 ；87 :4164-75)。最近，在X-连锁的疾病肾上腺脑白质营养不良(ALD)中一个突变导致缺陷的过氧化物酶体转运蛋白的错折叠，它可以通过低温培养受影响细胞来进行拯救(Walter等，Am. J. Hum. Genet. 2001 ；69 :35-48)。一般公认的是突变在基因的整个序列中均匀发生。因此，可以预测来源于所缺乏蛋白质的错折叠的表型会存在于许多其它遗传病中。溶酶体贮积病许多遗传性蛋白质缺乏病是酶的缺乏。如上面所指出，一大类遗传性酶的疾病涉及到溶酶体酶的突变并且称作溶酶体贮积病(LSD)。溶酶体贮积病是一组由鞘糖脂、 糖原、粘多糖积累导致的疾病。溶酶体疾病的例子包括但不限于戈谢病(Beutler等， The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001 ;Scriver 等著，3635-3668 页，McGraw-Hill, New York)、GMl 神经节苷脂病(相同，3775-3810 页)、 岩藻糖苷忙积症(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 1995. Scriver, C. R.，Baudet, A. L.，Sly, ff. S.和 Valle, D.著，2529-2561 页，McGraw-Hill, New York)、粘多糖贮积病(相同，3421-3452页)、庞皮病(相同，3389-3420页)、胡-沙综合症(Hurler-Scheie disease) (Weismann 等，Science 1970 ; 169, 72-74)、尼曼病 A 和 B (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001. Scriver 等著， 3589-3610 页，McGraw-Hill，New York)和法布里病(相同，3733-3774 页)。LSD 和它们相关的缺乏酶的名单可以从下面的表I中找到。在下面具体讨论了 2种疾病。法布里病法布里病是由溶酶体α -半乳糖苷酶A(a -Gal Α)活性缺乏所引起的鞘糖脂代谢白勺X-连锁的先天性障碍(Desnick等,The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，Scriver 等著，3733-3774 页，McGraw-Hill, New York 2001 ;Brady 等， N. Engl. J. Med. 1967 ;276，1163-1167)。这种酶的缺陷导致具有α-半乳糖残基的中性鞘糖脂主要是神经酰胺己三糖苷(GL-3)在体液和组织的溶酶体中进行性沉积。发病率估计在男性中为大约I : 40，000，并且在全世界范围内的不同人种群中均有报道。在典型的发病男性中，临床表现形式包括血管角皮瘤、肢端感觉异常、少汗症、以及特征性角膜和晶状体浑池(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001, Scriver等著,3733-3774页，McGraw-Hill, New York)。发病男性的预期寿命缩短了，并且
10由于心脏、脑和/或肾脏的血管性疾病导致通常在第4个或第5个十年内出现死亡。与此相比，患有温和的“心脏变异”的患者具有正常a -Gal A酶活性的5_15%，并且存在左心室肥大和心肌症。当没有这种心脏变异的人严重发病时而这种心脏变异患者基本上仍没有症状。最近发现在带有不可解释的左心室肥大心肌症的成年男性患者中有11%的人存在心脏变异，这表明法布里病的发病频率比先前估计的要高(Nakao等，N. Engl. J. Med. 1995 ； 333，288-293)。a -Gal A 基因位于 Xq22 (Bishop 等，Am. J. Hum. Genet. 1985 ；37 A144)并且已经报道了编码a -Gal A的全长cDNA和完整的12_kb基因组序列(Calhoun等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985 ；82 ;7364_7368 ；Bishop 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 ；83 4859-4863 ;Tsuji 等，Eur. J. Biochem. 1987 ； 165 ;275_280 ;和Kornreich等，Nucleic Acids Res. 1989 ；17 :3301-3302)。对导致法布里病的突变的遗传异质性已经进行了标记(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001, Scriver 等著， 3733-3774页，McGraw-Hill，New York. ;Eng等，Am. J. Hum. Genet. 1993 ；53 :1186-1197 ；Eng 等，Mol. Med. 1997 ；3 :174-182 ;和 Davies 等，Eur. J. Hum. Genet. 1996 ；4 :219-224)。到目前为止，除了小的缺失和插入和较大的基因重排外，多种错义、无义和剪接突变也已经进行了报道。戈谢病戈谢病是能够破坏脂肪葡糖脑苷脂的溶酶体酶β -葡糖脑苷脂酶的缺乏病。于是脂肪主要在肝脏、脾脏和骨髓中积累。戈谢病能够导致痛、疲劳、黄疸、骨损伤、贫血甚至死亡。戈谢病有三种临床表型。具有在生命的早期或早期成年人出现的I型的患者由于贫血、 低血小板数量、肝脏和脾脏的增大、骨骼的弱化和一些情况下的肺脏和肾的损伤，容易碰伤和出现疲劳。没有涉及脑的征兆。在II型中，早期发作，在3个月时出现肝脏和脾脏增大并且广泛涉及到脑。在2岁前的死亡率很高。III型的特征是肝脏和脾脏增大并且脑抽搐。 β -葡糖脑苷脂酶基因定位于人lq21染色体。其蛋白质前体包含536个氨基酸并且其成熟的蛋白质长度是497个氨基酸。虽然来源于任何人种群的个体都可能患此病，但是认为在来源于东欧的犹太人 (德系犹太人(Ashkenazi))的后代中戈谢病更加普遍。在德系犹太人的群体中，戈谢病是最常见的遗传病，发病率大约1/450。在一般大众中，大约在100，000人中有一个戈谢病患者。根据国家高雪氏基金(National Gaucher Foundation), 2，500个美国人患有戈谢病。其它酶缺乏疾病葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏病是最常见的X-连锁的人类酶缺乏病。G6H) 酶催化对于核糖的产生是必要的氧化还原反应，而核糖是DNA和RNA的主要成分。G6H)还参与维持细胞内NADPH的足够水平。在许多生物合成反应中NADPH是所需要的辅因子。带有该种缺乏病的个体的临床症状包括新生儿黄疸、腹痛和/或背痛、眩晕、头痛、呼吸困难 (不规则呼吸)和心悸。除了遗传病外，其它的酶缺乏病可以由来源于原发和继发疾病的组织或器官损伤引起。例如，由酒精中毒引起的损伤的胰腺组织或胰腺炎导致缺乏消化中需要的胰酶。当前，胰腺炎可以用酶替代治疗来进行治疗。表I :溶酶体贮积病，与之相关的缺陷酶，以及小分子活性部位特异陪伴分子
权利要求
1.施用于人的药物组合物，其在可药用载体中包含纯化的α-葡糖苷酶和针对α-葡糖苷酶的活性部位特异性陪伴分子，其中所述活性部位特异性陪伴分子是I-脱氧野尻霉素。
2.权利要求I所述的组合物，其中将α-葡糖苷酶、可药用载体和I-脱氧野尻霉素配制成冷冻干燥的粉末或无菌水溶液。
3.体外提高纯化的α-葡糖苷酶的稳定性的方法，其中纯化的α-葡糖苷酶用于施用于人，所述方法包括将可药用载体中的α-葡糖苷酶和有效量针对该α-葡糖苷酶的活性部位特异性陪伴分子相接触，其中所述活性部位特异性陪伴分子是I-脱氧野尻霉素。
4.权利要求3的方法，其中存在活性部位特异性陪伴分子时所述α-葡糖苷酶的体外贮存期限延长。
5.活性部位特异性陪伴分子的用途，用于制备改善疾病治疗的药物，其中所述疾病通过酶替代而治疗，活性部位特异性陪伴分子特异性结合替代酶，且其中所述酶是α -葡糖苷酶，并且其中所述活性部位特异性陪伴分子是I-脱氧野尻霉素。
6.权利要求5的用途，其还包含在药物的制备中使用纯化的野生型α-葡糖苷酶。
7.权利要求6的用途，其中活性部位特异性陪伴分子延长α-葡糖苷酶在个体体内的半衰期和活性。
8.权利要求5的用途，其中疾病是庞皮病。
9.提高非哺乳动物宿主细胞产生重组α-葡糖苷酶的方法，其中宿主细胞包含含有编码重组α-葡糖苷酶的核酸序列的表达载体，其中α-葡糖苷酶不是以无生物学活性构象错折叠的突变α -葡糖苷酶，所述方法包括将宿主细胞培养于包含I-脱氧野尻霉素的培养基中。
全文摘要
本申请提供了通过将蛋白质替代治疗与活性部位特异的陪伴分子(ASSC)相结合以提高所施用蛋白质的稳定性和功效而改进蛋白质替代治疗的方法。本发明进一步提供了包含纯化蛋白质和ASSC的组合物和施用该组合物的治疗方法。
文档编号A61KGK102580067SQ20121003310
公开日2012年7月18日 申请日期2004年2月2日 优先权日2003年1月31日
发明者樊建强 申请人:纽约大学西奈山医学院