专利名称：抗cd4蛋白的单克隆抗体及其活性片段及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可特异性结合人表面抗原分化簇4(Cluster ofDifferentiation 4,CD4)蛋白的单克隆抗体，及其保守性变体或活性片段，其多肽或多肽类似物的相关编码序列，产生所述单克隆抗体的细胞株，及应用该抗体或片段用于预防、免疫治疗和诊断的方法和用途；预防或治疗灵长类，包括人类在内的，感染源以CD4+细胞的主要目标细胞引起的疾病这些疾病包括获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)，艾滋病相关的疾病，人类免疫缺陷柄毒(human immunodeficiencyvirus, HIV)感染。
背景技术：
上世纪发现HIV以来，许多研究者致カ于HIV的病毒分子生物学、免疫、疫苗等方面的研究，但对于HIV疫苗及其免疫疗法的发展仍存在许多的困难，包括HIV-I的变异性，病毒的多种传播途径/方式，以及有关预防HIV感染所必需的免疫反应仍有分岐等。HIV-I病毒是约100纳米的包膜病毒。其RNA基因组及ー些活性蛋白包裹在由衣壳蛋白组成的锥形核心中，病毒膜的内部为衣壳蛋白，包膜位于病毒颗粒的最外层，其主体为磷脂双分子层，嵌有由env基因编码的gpl20和gp41组成的刺突状(spike)结构。HIV包膜刺突状结构与细胞第一受体CD4蛋白接触后发生构象变化，然后与第二受体趋化因子受体蛋白(chemokine receptors,包括CCR5、CXCR4等)作用，最终实现膜融合,释放病毒的基因侵入细胞。HIV病毒包膜糖蛋白是以gpl60的前体形式在细胞中表达出来的，成熟的包膜糖蛋白被剪切为约481个氨基酸的gpl20糖蛋白和约345个氨基酸的gp41糖蛋白(Ratner，L.等人，Nature，1985，313 :277-284)。gpl20和gp41在HIV包膜上以三聚体的功能单位形式存在，參与病毒与细胞受体的结合及病毒与细胞融合的感染过程(Kwong，P. D.等人，Nature,2002,420 :678-682 ；Diskin, R.等人，Nat Struct Mol Biol,2010,17 :608-613 ;Buzon, V.等人，PLoS Pathog，2010，6 (5) :el000880.)。HIV-I包膜糖蛋白gpl20通过与细胞受体CD4蛋白(Maddon, P. j.等人，Cell,1986，47 =333-348)以及与共受体(co_rec印tor，主要为CCR5或CXCR4蛋白)的相互作用感染宿主细胞(Alkhatib, G.等人，Science, 1996, 272 :1955-1958 ；Deng, H.等人，Nature,1996，381 :661-666 ；Dragic,T.等人，Nature，1996，381 :667-673 ；Feng, Y.等人，Science，1996，272 :872-877)。与细胞受体的结合引起病毒包膜糖蛋白gpl20构象改变，进而诱导与包膜糖蛋白的跨膜单位gp41结构重排(rearrangements)使病毒与细胞融合(Wyatt,R.等人，Science,1998,280 :1884-1888 ；Pierson, T. C.等人，Curr Top Microbiol Tmmunol,2003,281 1-27)。0)4全称表面抗原分化簇4 (Cluster of Differentiation 4),是表达在包括辅助T细胞、调节T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等细胞表面的糖蛋白，是辅助T细胞的表面标记(surface markers)之一，是其行使其功能的重要受体,參与调节T免疫细胞的増殖、淋巴因子的释放以及參与免疫细胞的相互作用，调节抗体的产生。同时是许多病原体(包括人免疫缺陷病毒等)感染⑶4+细胞的受体糖蛋白(Isobe，Μ.等人，Proc NatlAcad Sci USA, 1986 ；83(12) :4399-402 ；Ansari-Lari,M. A.等人，Genome Res. 1996 ；6(4)314-26 ；Bofill, Μ.等人，Clin Exp Immunol. 1992 ;88 (2) :243-52)。与很多其他细胞表面受体/标记分子相似，CD4蛋白也属于免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily)的成员。完整的⑶4是由⑶4基因编码的433个氨基酸膜糖蛋白，其分子量约为55kDa-62kDa，包括由1_375位氨基酸组成的4个细胞膜外部结构域(domain)，376-395位氨基酸构成的跨膜区和396-433位氨基酸构成的细胞质内尾部(cytoplasmic tail) (Maddon P. J.等人，Cell, 1985，42 :93-104 ;Littman，D. R.等A, Cell, 55 541 ) 0其中细胞外的4个结构域分别为第一结构域(domain 1，简称D1，包括第1-100位氨基酸)，第二结构域(domain2，简称D2，包括第101-180位氨基酸)，第三结构域(domain 3,简称D3,包括第181-290位氨基酸)和第四结构域(domain 4,简称D4,包括第 291-375 位氨基酸)(Maddon, P. J.等人，Cell, 1985 ；42 :93-104 ；Maddon, P. J.等人，Cell, 1986 ；47 :333-348 ；Maddon, P. J.等人，Cell, 1988 ；54 :865-874 ；ffang, J. H.等人，Nature，1990，348 :411-418);其中Dl和D3在结构上类似于免疫球蛋白可变区结构域(immunoglobulinvariable domain, IgV domain), D2 和 D4 在结构上类似于免疫球蛋白恒足凶结构域(immunoglobulin constant domains, IgC domainノ。作为HIV感染细胞的受体蛋白，CD4蛋白在艾滋病毒的复制周期中发挥重要的作用(Dalgleish, A. G.等人，Nature, 1984 ；312 :763-767 ；Klatzmann, D.等人，Science,1984 ；225 :59-63 ；Klatzmann, D.等人，Nature, 1984,312 :767-768)。CD4 的第一个结构域(Dl)中的⑶R3样区(⑶R3-like region)和HIV-1包膜糖蛋白gpl20的第二免疫球蛋白样互补决定区(CDR2-like region)直接參与了相互作用(Arthos, J.等人，Cell,1989,57 :469-481 ；Clayton, L. K.等人，Nature, 1989,339 :548-551 ；Mizukami, T.等人，
Proc Natl Acad Sci USA. 1988,85 :9273-9277 ； BatiniC- D.等人，J Biol Chem. 1992，267 :6664-6671 ；Camerini, D.等人，Cell. 1990,60 :747-754 ；Kalyanaraman, V. S.等人，JImmunol. 1990，145 :4072-4078 ；Lifson, J. D.等人，Science. 1988,241 :712-716 ；Truneh,A.等人，J Biol Chem. 1991,266 :5942-5948 ；Diskin,R.等人，NatStruct Mol Biol. 2010，17 :608-613)，两个蛋白分子的相互作用引起CD4-gpl20复合物发生构象变化，使gpl20蛋白可以进一步与细胞第二受体，即趋化因子受体5 (chemokine receptor-5, CCR5)或CX趋化因子受体4(CX chemokine receptor-4, CXCR4)结合。与细胞第二受体的结合引发糖蛋白三聚体构象改变，使HIV表面的gp41蛋白插入细胞膜，最终导致病毒包膜和细胞膜的融合(Kuritzkes, D. R.，Curr opinHIV AIDS. 2009,4 :82-87 ；Briz, V.等人，J AntimicrobChemother. 2006,57 :619-627 ；Castagna, A.等人，Drugs. 2005,65 :879-904)。CD4+细胞被HIV感染后，细胞功能和细胞的数量都受到明显的影响，其中T细胞数量的减少一方面是由于病毒的裂解型感染，同时也与HIV感染后的CD4+细胞发生与其他感染的或未感染的⑶4++细胞的融合现象有关(Sodroski, J.等人，Nature, 1986, 322 470-474)。CD4+细胞耗尽，会导致患者机体表现为免疫抑制，从而越来越容易受到机会性感染和发生恶性肿瘤。这种免疫抑制现象在后天免疫缺损综合症(艾滋病，AIDS)患者中广泛存在。通常艾滋病临床表现为与艾滋病毒相关的复合症状特点，如持续性全身淋巴结肿大，发烧和体重下降等的综合征。在某些情况下，由于艾滋病毒感染CD4+脑细胞使艾滋病伴随有中枢神经系统紊乱(Popovic, Μ.等人，Science，1984，224 :497-500)。人类免疫缺陷病毒的攻击对象是CD4+细胞，在病毒引起艾滋病的过程中，患者体内CD4+细胞的数量与病情的发展有着密切的关系，所以CD4+细胞数量的检测对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。由于抗⑶4抗体具有通过干扰HIV与⑶4分子和/或第二受体相互作用进而影响HIV侵入受体细胞，发挥预防和/或治疗HIV感染的作用，ー些研究者正在研究抗⑶4抗体阻断艾滋病毒与细胞相互作用的关系和应用。目前报道的在阻断艾滋病毒感染CD4+受体细胞中作用明显，同时具有应用于HIV感染引发的艾滋病方面具有良好前景的抗CD4抗体如5A8和DB-81，其识别的表位均位于CD4蛋白的D2结构域(Song, R.等人，J Virol. 2010，84 :6935-6942 ；Burastero, S. E.等人，J Transl Med. 2009Nov 28 ；7 :101)。已经报道了关于抗⑶4其他表位或结构域的单克隆抗体的研究，如可用于外周血CD4抗原检测的单克隆抗体等特定领域的单克隆抗体，但相关报告中也报道了这些抗体在 艾滋病治疗上的不足之处。例如，与⑶4分子Dl结构域结合的抗体Leu3A和0KT4A具有阻断感染艾滋病毒引起的细胞合胞体形成现象的作用(Sattentau Q. J.等人，Science, 1986, 234 :1120-1123 ;Jameson B. A.等人，Science. 1988, 240 :1335-1339 ;Peterson A.等人，Cell. 1988, 54 :65-72)。但是由于这些抗体的识别表位与HIV包膜糖蛋白gpl20识别的表位重叠，这些抗体无法与结合了包膜糖蛋白gpl20的⑶4蛋白分子反应，因此这些抗体作为艾滋病毒感染的治疗药物使用方面存在严重缺陷(Bates P. A.等人，Protein Eng. 1989，3 :13-21 ；McDougal J. S.等人，J Tmmunol. 1986,137 :2937-2944 ；Landau N. R.等人，Nature. 1988，334 :159-162 ；Dalgleish A. G.等人，Lancet. 1987,2 :1047-1050)，同时在机体内也会由于机体的免疫抑制而存在应用缺陷(Samuele E. B.等人，J Transl Med. 2009，7 :101)。据报道,识别⑶4分子D2结构域的单克隆抗体0KT4B(T. Kieber-Emmons T.等人，Biochim Biophys Acta. 1989，989 :281-300)对于HIV包膜糖蛋白 gpl20 与 CD4 蛋白的结合具有明显的干扰作用(McDougal J. S.等人，J. Immunol.，J Immunol. 1986,137 :2937-2944 ；Lundin K.等人，J Tmmunol Methods. 1987,97 :93-100 ；Lamarre D.等人，EMBO J. ,1989,8 3271-3277)，但是其阻止HIV感染的细胞形成合胞体现象的作用明显比0KT4A弱，在治疗中的弱点更加突出(SattentauQ. J.等人，Science. 1986,234:1120-1123 ；Moore J. P.等人，Science. 1990,250 :1139-42)。其他表位的抗CD4抗体还包括MT151，VIT4，和MT321等(Sattentau Q. J.等人，Science. 1986,234 :1120-1123)，这些抗体识别的表位与HIV包膜糖蛋白gpl20结合的表位在构象上有一定的重叠(Sattentau Q. J.等人，J Exp Med，1989，170 :1319-1334 ;Bates P. A.等人，Protein Eng. 1989,3 :13-21 ；Landau N. R.等人，Nature. 1988,334 159-162 ；Merkenschlager M.等人，J Immunol. 1990,145 :2839-2845 ；Benkirane Μ.等人，J Virol. 1995,69 :6898-6903)。本发明的抗体识别⑶4蛋白Dl (D1-2)结构域上的表位，当有HIV存在/⑶4蛋白与HIV包膜糖蛋白gpl20结合后，该表位可与本发明之单克隆抗体表现出更好的反应活性，显著阻断HIV侵入细胞，使病毒不能在细胞中复制，阻断由于HIV感染引起的细胞病变，从而阻止病毒在细胞间的传播。这样的抗体在阻断HIV感染及艾滋病等相关疾病治疗新方式方面具有应用价值。
发明内容
本发明提供了可特异性结合人表面抗原分化簇4(Cluster ofDifferentiation4,0)4)蛋白的单克隆抗体，即可阻断人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)侵入⑶4+细胞，抑制HIV感染、阻断HIV在⑶4+间传播，治疗艾滋病活性的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可与人表面抗原分化簇4蛋白的第一结构域(Dl，第1-113位氨基酸)上的表位结合 ，也可与包含此结构域的第1-2结构域(D1-2，第1-180位氨基酸)结合，以及与包含第一结构域的其他形式的截短的人表面抗原分化簇4蛋白、重组表达的CD4、细胞表面的CD4蛋白结合。同时本发明之抗体对人类免疫缺陷病毒gpl20与CD4蛋白的相互作用无明显阻断作用，本发明之单克隆抗体可阻断HIV病毒感染细胞，阻断HIV病毒在受体细胞中的复制。另外，本发明提供了抗CD4抗体的多种同源形式单克隆抗体、免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的ー个免疫活性区段)，如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、单链抗体分子或由含有ー个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明还提供了重组抗体、重组嵌合抗体、重组人源化抗体等由人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。以及本发明抗体的CDR功能区域的模拟物质。本发明提供了杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及包含本发明的单克隆抗体的药物组合物和医药诊断设备和试剂盒。本发明也提供了利用本发明的单克隆抗体探測、诊断、预防和治疗哺乳动物，包括人类在内的，感染源以CD4+细胞为主要目标细胞的疾病这些疾病包括获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)，艾滋病相关的疾病，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染的疾病。在ー个方面，本发明提供了ー种单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有至少ー项选自以下的特征(i)特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白；(ii)与含有人表面抗原分化簇4蛋白Dl结构域的截短形式的人表面抗原分化簇4多肽特异性反应；(iii)对人免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gpl20与人表面抗原分化簇4蛋白的反应无明显影响；和(iv)阻断人免疫缺陷病毒感染⑶4+细胞及再感染，和/或阻断由此引起的疾病，例如艾滋病。在一个实施方式中，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链的⑶R1、⑶R2和⑶R3和其中所述抗体的轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3分别是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤产生的单克隆抗体15A7的重链⑶R1XDR2和⑶R3和轻链⑶R1、CDR2 和 CDR3。在一个实施方式中，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链的⑶R1XDR2和⑶R3和其中所述抗体的轻链的⑶R1XDR2和⑶R3分别是杂交瘤产生单克隆抗体14G7的重链⑶R1、⑶R2和⑶R3和轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3。在一个实施方式中，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区和轻链可变区分别是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤产生的单克隆抗体15A7的重链可变区和轻链可变区。在一个实施方式中，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区和轻链可变区分别是杂交瘤产生的单克隆抗体14G7的重链可变区和轻链可变区。在一个实施方式中，本发明提供了特异性结合人表面抗原分化簇CD4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示或由SEQ ID NO :1的核苷酸序列编码；其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示或由SEQ ID NO 3的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，本发明提供了特异性结合人表面抗原分化簇CD4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:18所示或由SEQ ID NO :17的核苷酸序列编码；其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO 20所示或由SEQ ID NO 19的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，本发明的抗体包含一个或多个选自SEQ ID NOs :5_7的重链⑶R ;和/或包含ー个或多个选自SEQ ID NOs 8-10的轻链⑶R ；在一个实施方式中，本发明所述抗体的重链⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5-7或由SEQ ID NO :11-13的核苷酸序列中一个或多个编码；在一个实施方式中，本发明所述抗体的轻链⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 8-10或由SEQ ID NO :14-16的核苷酸序列中一个或多个编码；在一个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分为Fab、Fab'、F(ab/ ) 2、Fv或单链抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体包含一个或多个选自SEQ ID N0s:21_23的重链⑶R ;以及包含一个或多个选自SEQ ID NOs 24-26的轻链⑶R ；在一个实施方式中，本发明所述抗体的重链⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 21-23或由SEQ ID NO :27-29的核苷酸序列中一个或多个编码；在一个实施方式中，本发明所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 24-26或由SEQ ID NO :30-32的核苷酸序列中一个或多个编码；在一个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分为Fab、Fab'、F(ab/ ) 2、Fv或单链抗体。在一个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分结合人表面抗原分化簇4蛋白的Kd值小于I X IO-5M0在一个实施方式中，本发明所述的单克隆抗体包括非CDR区，该非CDR区是来自不是鼠类的物种。在另ー个方面，本发明提供了特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白的单克隆抗体，其是保藏号为CCTCC NO C201098的杂交瘤细胞15A7产生的，其相应的杂交瘤细胞是CCTCC NO C201098的杂交瘤细胞。在另ー个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区。在一个实施方式中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。在另ー个实施方式中，所述的核酸分子序列为SEQ ID NO :1。在另ー个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区。在一个实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:4。在另ー个实施方式中，所述的核酸分子序列为SEQ ID NO :3。在另ー个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区。在一个实施方式中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:18。在另ー个实施方式中，所述的核酸分子序列为SEQ ID N0:17。
在另ー个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区。在一个实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:20。在另ー个实施方式中，所述的核酸分子序列为SEQ ID N0:19。在另ー个方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子的表达载体。在另ー个方面，本发明提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞。在另ー个方面，本发明提供了检测样品中人表面抗原分化簇4蛋白的方法，其包括如下步骤a)将所述的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分接触；b)检测所述的单克隆抗体与所述样品中的蛋白的反应；c)检测所述的单克隆抗体与所述样品中的蛋白及人免疫缺陷病毒包膜蛋白的反应。在一个实施方式中，所述的单克隆抗体附着在固相载体上。在另ー个实施方式中，所述的固相载体选自微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。在优选的实施方式中，所述的单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相上，该方向能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。在另ー个实施方式中，所述的单克隆抗体是通过其恒定区域而附着在所述固相上的。在ー个具体实施方式
中，所述的反应是通过酶显色进行測定的。在另ー个具体的实施方式中，所述的反应是通过荧光进行測定的。在又ー个具体的实施方式中，所述的反应是通过化学发光进行进行測定的。在一个优选的实施方式中，上述方法中所述的单克隆抗体为Fab、Fab'、F(ab' )2或Fv。在另ー个优选的实施方式中，所述的样品来自于鸟类或人类。在另ー个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。在一个实施方式中，本发明的药物组合物进ー步包括其它抗病毒成分。在另ー个实施方式中，本发明的药物组合物中的抗体为Fab、FaV、F(ab' )2 或 Fv。在另ー个方面，本发明提供了治疗受试者中由人免疫缺陷病毒感染引发的疾病的方法，其包括向所述的受试者施用治疗上有效量的本发明的药物组合物。在另ー个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体用于制备治疗或预防以CD4+细胞为目标细胞的疾病(如艾滋病)的药物的用途。在另ー个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体用于制备阻断HIV感染CD4+细胞及再感染的药物的用途。在另ー个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体用于人表面抗原分化簇4蛋白模拟表位肽筛选的用途。在另ー个方面，本发明提供了上述模拟表位肽用于制备预防以CD4+为目标细胞的疾病(如艾滋病)的疫苗的用途。在另ー个方面，本发明提供了上述模拟表位肽用于制备治疗或诊断以CD4+为目标细胞的疾病(如艾滋病)试剂盒的用途。
图I是人⑶4胞外区氨基酸序列，图中标注Dl结构域，D2结构域，D3结构域，D4结构域四个结构域的起止位置。
图2是重组人⑶4蛋白表达纯化的SDS-PAGE结果，各图依次为A :⑶4(dl) ；B CD4(d2) ;C:CD4(d3) ;D:CD4(d4) ;E:CD4(dl_2) ;F :sCD4(即 D1-D4结构域);各小图各道样品从左至右依次为1 :蛋白分子量marker ；2 :诱导后表达菌体；3 :2M尿素上清；4 :4M尿素上清；5 :8M尿素上清；6 :纯化后样品；7 BL21空载菌体。图3是各稀释度的单克隆抗体15A7阻断不同亚型HIV实验株病毒感染Tzm-bl细胞的曲线图，实验株病毒包括HIVnm_3 (B亚型)，HIV89.6 (B亚型)，HIV94ugu4 (D亚型)，HIVsu4 (C亚型)，HIVffcsc249 (D/C 亚型)。图4是各稀释度的单克隆抗体14G7阻断不同亚型HIV实验株病毒感染Tzm-bl细胞的曲线图，实验株病毒包括HIVnm_3 (B亚型)，HIV89.6 (B亚型)，HIV94ugu4 (D亚型)，HIVsu4 (C亚型)，HIVffcsc249 (D/C 亚型)。图5 是单克隆抗体 15A7 与 Tzm_bl 细胞，U87. CD4. CXCR4 细胞和 U87. CD4. CCR5 细胞结合的免疫荧光的激光共聚焦显微镜检测结果，其中使用的对照为anti-p24的单克隆抗体H5F4。图6 是单克隆抗体 14G7 与 Tzm_bl 细胞，U87. CD4. CXCR4 细胞和 U87. CD4. CCR5 细胞结合的免疫荧光的激光共聚焦显微镜检测结果，其中使用的对照为anti-p24的单克隆抗体H5F4。图7 是重组蛋白 CD4 (dl)、CD4 (d2)、CD4 (d3)、CD4 (d4)、CD4 (dト2)和 sCD4 阻断15A7抗体与细胞反应的流式细胞仪检测結果。图8 是重组蛋白 CD4 (dl)、CD4 (d2)、CD4 (d3)、CD4 (d4)、CD4 (dl_2)和 sCD4 阻断14G7抗体与细胞反应的流式细胞仪检测結果。图9是单克隆抗体15A7和14G7的单链抗体表达质粒图。图10是单抗纯化SDS-PAGE结果，各道样品从左至右依次为1 :蛋白分子量Marker ；2 :单克隆抗体15A7还原处理样品；3 :15A7抗体Fab片段还原处理样品；4 :15A7抗体F(aV )2片段还原；5 :单克隆抗体15A7非还原处理样品；6 :15A7抗体Fab非还原处理样品；7:15A7抗体F(ab' )2非还原处理样品。图11是单克隆抗体15A7及其F(ab' )2、Fab抗体片段和HIVNM_3病毒反应，阻断其进入Tzm-bl细胞的结果，对照为缓冲液。图12是Tzm-bl细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为ー抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat. No. F9006Sigma)为ニ抗标记待测细胞；B 小图是用 FITC 标记的 anti-CD4(Cat. No. 555346，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CD4受体蛋白；C小图是用PE标记的anti-CXCR4(Cat. No. 555974，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CXCR4受体蛋白；D小图是用PE_Cy5标记的anti-CCR5 (Cat. No. 556889，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CCR5受体蛋白；E小图为无标记的细胞对照。图13是MT4细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为一抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat. No. F9006Sigma)为二抗标记待测细胞；B 小图是用 FITC 标记的 anti-CD4 单抗(Cat. No. 555346，BD Biosciences)标记待测细胞表面的⑶4受体蛋白；C小图是用PE标记的anti-CXCR4单抗(Cat. No. 555974，BDBiosciences)标记待测细胞 表面的CXCR4受体蛋白；D小图是用PE_Cy5标记的anti_CCR5单抗(Cat. No. 556889，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CCR5受体蛋白出小图为无标记的细胞对照。图14是H9细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为一抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat. No. F9006Sigma)为二抗标记待测细胞；B 小图是用 FITC 标记的 anti-CD4 单抗(Cat. No. 555346，BD Biosciences)标记待测细胞表面的⑶4受体蛋白；C小图是用PE标记的anti-CXCR4单抗(Cat. No. 555974，BDBiosciences)标记待测细胞表面的CXCR4受体蛋白；D小图是用PE_Cy5标记的anti_CCR5单抗(Cat. No. 556889，BD Biosciences)标记待测细胞的CCR5受体蛋白；E小图为无标记的细胞对照。图15是U87.⑶4. CXCR4细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为一抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat. No. F9006Sigma)为二抗标记待测细胞；B小图是用FITC标记的anti-⑶4单抗(Cat. No. 555346，BDBiosciences)标记待测细胞表面的⑶4受体蛋白；C小图是用PE标记的anti_CXCR4单抗(Cat. No. 555974，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CXCR4受体蛋白山小图是用PE-Cy5 标记的 anti-CCR5 单抗(Cat. No. 556889, BD Biosciences)标记待测细胞表面的CCR5受体蛋白；E小图是无标记的细胞对照。图16是U87.⑶4. CCR5细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为一抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat. No. F9006Sigma)为二抗标记待测细胞；B小图是用FITC标记的anti-⑶4单抗(Cat. No. 555346，BDBiosciences)标记待测细胞表面的⑶4受体蛋白；C小图是用PE标记的anti_CXCR4单抗(Cat. No. 555974，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CXCR4受体蛋白；D小图是用PE-Cy5 标记的 anti-CCR5 单抗(Cat. No. 556889，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CCR5受体蛋白；E小图是无标记的细胞对照。图17是人外周血单个核细胞(PBMC)细胞表面不同受体的流式细胞仪检测结果，其中A小图是用单克隆抗体15A7为一抗，FITC标记的兔抗鼠抗体(RAM-FITC，Cat.No. F9006Sigma)为二抗标记待测细胞；B小图是用FITC标记的anti-⑶4单抗(Cat.No. 555346，BDBiosciences)标记待测细胞表面的CD4受体蛋白；(小图是用PE标记的anti-CXCR4单抗(Cat. No. 555974, BD Biosciences)标记待测细胞表面的CXCR4受体蛋白；D 小图是用 PE-Cy5 标记的 anti-CCR5 单抗(Cat. No. 556889，BD Biosciences)标记待测细胞表面的CCR5受体蛋白；E小图是无标记的细胞对照。
图18是流式细胞仪检测的单克隆抗体15A7标记表达了 HIV的293FT细胞的情况，其中使用的对照细胞为空白的293FT细胞，对照抗体为anti-p24的单克隆抗体H5F4。图19是单克隆抗体15A7与表达了 HIV的293FT细胞的免疫荧光的激光共聚焦显微镜检测结果，其中使用的对照细胞为空白的293FT细胞，对照抗体为anti-p24的单克隆抗体H5F4。图20是各种截短的⑶4蛋白，包括重组蛋白⑶4 (dl)、⑶4 (d2)、⑶4 (d3)、⑶4 (d4)、CD4(dl-2)和sCD4阻断HIVNM_3感染Tzm-bl细胞的效果。图21是纯化的截短CD4蛋白与单克隆抗体15A7的免疫印迹反应结果。其中Al小图是截短CD4蛋白还原SDS-PAGE图，A2小图是截短CD4蛋白还原胶免疫印迹反应图；B1小图是截短CD4蛋白非还原胶图,B2小图是截短CD4蛋白非还原胶免疫印迹反应。各小图各道样品依次为 I :蛋白分子量 marker ；2 CD4(dl) ；3 CD4(d2) ；4 CD4 (d3) ；5 CD4(d4)；6 :CD4(dl-2) ；7 :sCD4 ；8 :对照蛋白；9 BL21 空载菌体。图22是用15A7标记TZM_bl细胞的流式细胞仪检测结果，其中包括加入HIVNM_3和不加hivnm_3两种情况。图23是重组蛋白CD4(dl)、CD4(dl_2)和重组sCD4阻断15A7中和HIVNL4_3感染Tzm-bl细胞的中和实验检测结果。图24 是用 CD4(dl)、CD4(dl_d2)和重组 sCD4 与转染了 pNL4_3 的 293FT 细胞反应，用单克隆抗体15A7作为二抗，再用FITC标记的兔抗鼠抗体标记后进行流式细胞仪检测的结果，其中A小图为单克隆抗体15A7的反应结果；B小图为用anti-CD4单抗(克隆号Q4120，Cat. No. C1805Sigma)作为对照标记待测细胞表面⑶4受体蛋白的反应结果。图25是单克隆抗体15A7与点突变⑶4(dl-2)蛋白的免疫印迹反应结果。其中Al小图是各点突变⑶4(dl-2)蛋白还原SDS-PAGE图；A2小图是各点突变⑶4(dl_2)蛋白非还原样SDS-PAGE图；B1小图是各点突变⑶4(dl-2)蛋白还原样免疫印迹反应杂交图；B2小图是各点突变⑶4(dl-2)蛋白非还原样免疫印迹反应杂交图。各小图各道样品顺序依次为 I :蛋白分子量 marker ；2 CD4 (dl-2)-N73A ；3 CD4 (dl-2)-R59A ；4 CD4 (dl-2)-K46A ；5 CD4(dl-2)-F43A ；6 :对照蛋白 CD4(dl_2)。
具体实施例方式本发明申请中涉及的有关术语的定义如下本发明中的“表面抗原分化簇4”一词指任何由表面抗原分化簇4基因编码的表面抗原分化簇4蛋白。本发明中的“⑶4+细胞” 一词指细胞表面具有⑶4糖蛋白的细胞，其中包括⑶4+T淋巴细胞和⑶4+细胞系，如TZM-bl、H9和C8166等。本发明中的“⑶4第一结构域(Dl) ”一词指第I至第98位的截短的表面抗原分化
簇4多肽。本发明中的“⑶4第二结构域(D2) ”一词指第99至第183位的截短的表面抗原分化簇4多肽。本发明中的“⑶4第一结构域(D3)”一词指第184至第291位的截短的表面抗原分化簇4多肽。
本发明中的“⑶4第一结构域(D4) ” 一词指第292至第365位的截短的表面抗原分化簇4多肽。本发明中的“⑶4第一/ニ结构域(D1-2)”一词指第I至第183位的截短的表面抗原分化簇4多肽。本发明中的“重组可溶性⑶4(s⑶4，rs⑶4，D1_4) ”ー词指第I至第365位的截短的表面抗原分化簇4多肽。本发明中的“抗CD4抗体” ー词是指识别位于表面抗原分化簇4蛋白分子上的表位的抗体，即与表面抗原分化簇4蛋白上的表位结合的抗体。本发明中的“包膜糖蛋白” ー词指人类免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白。包膜糖蛋白 介导人类免疫缺陷病毒针对宿主细胞的吸附和进入过程。其前体形式为gpl60，经过加工后为gpl20和gp41，在人类免疫缺陷病毒包膜上以聚合体的功能单位形式存在。本发明中的“抗体” ー词指任意ー种免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过ニ硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区，和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称为互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDRU LCDR2、LCDR3,重链(H)的CDR包含HCDRl、HCDR2、HCDR3。其由 Kabat 等人命名，见 Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition(1991),第 1-3 卷，NIHPublication 91-3242, Bethesda MD)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些类还进ー步分成亚类，如 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 或 IgA2 等。本发明中的“抗体” ー词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的ー个免疫活性区段)，如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、单链抗体分子或由含有ー个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由ー个特定的人免疫球蛋白中的ー个或多个CDR区结合ー个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。在片段蛋白分子中仅包含重链CDR中的I个⑶R，2个⑶R，3个⑶R可实现相同表位的识别作用。在片段蛋白分子中仅包含轻链⑶R中的I个⑶R，2个⑶R至3个⑶R区段同样可实现实现相同表位的识别作用。只保留鼠单抗的I个或2个CDR区，其余都是全新的氨基酸序列，获得的新抗体仍具有亲本鼠单抗的活性。1998年，Rader等将鼠单抗LM609可变区上的HCDR3和IXDR3移植到人源抗体序列中，成功获得仅保留鼠HCDR3和LCDR3的人源化抗体(Rader C，Cheresh DA, Barbas CF 3rd.A phage display approach for rapid an11bodyhumanIza11on !designed combinatorialV gene libraries. Proc Natl AcadSci U S A. 1998，95 (15) :8910-5)。2000 年，Klimka 等获得只保留鼠HCDR3的抗⑶-30的人源化抗体(Klimka A,Matthey B,Roovers RC，et al，Human anti_CD30 recombinant antibodies by guided phageantibody selection usingcell panning. Br J Cancer. 2000，83 (2) :252-60)。
抗体相关的“ Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经ニ硫键结合起来的抗体分子的一部分。“Fab' ”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。F(ab/ )2 指的是 Fab'的ニ聚体。抗体的“ Fe”指的是第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经ニ硫键结合成的抗体的一部分。抗体的Fe段有多种不同的功能，但不參与抗原的结合。抗体的“Fv”段指的是能结合 完整的抗原结合位点的抗体的最小片段。ー个Fv片段包括一条轻链的可变区结合到一条重链的可变区。本发明中的“单链抗体”或“scFv”指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过ー个肽链连接而成的工程抗体(Houston 1988)本发明中的“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv连接抗体的Fe段形成的工程抗体。本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨
基酸或原子基团。本发明中的“单抗” 一词指的是来自一群高度同源的抗体分子中的ー个抗体或抗体的ー个片段，也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的単一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的，但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Kohler G.等人，Nature, 1975,256 :495-497)，也可采用重组DNA技术获得(如參见U. S. P 4，816，567)。本发明中的“嵌合抗体” ー词指的是抗体轻链或/和重链的一部分是源自某ー特定物种或属于某一特定抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体，而抗体轻链或/和重链的另一部分是源自另一物种或属于另ー抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体。不管怎样，这种抗体片段仍保留了对目标抗原的结合活性(U. S. P 4, 816, 567 ;Morrison等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 6855 (1984))。本发明中，“人源化抗体”一词指的是人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是有预期特异性、亲和性和反应性的小鼠、大鼠或兔抗体。另外，人源免疫球蛋白的构架区(FR)的氨基酸序列也可被相应的非人源抗体的氨基酸序列所替换。而且，人源化抗体的氨基酸残基也可以既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的CDR区或构架区序列。这些人工修饰的目的是进ー步完善或优化抗体性能。总之，人源化抗体是指含有至少ー个、通常是两个几乎完整的可变区，其中对应的所有或几乎所有的CDR区是来自非人源抗体，其中的全部或几乎全部的FR区是来自人源抗体。理想的人源化抗体至少含有免疫球蛋白的Fe区的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fe区。更多详细内容请參阅Jones P. T.等人，Nature,1986, 321:522-525 ；Reichmann L.等人，Nature. 1988,332 :323-327 ；Presta,Curr Opin StructBiol，1992，2 :593_596and Clark M. Immunol Today 2000,21 :397-402.本发明涉及的“被分离”ー词，指的是天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某ー种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。比如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为被分离。这里的“被分离”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的ー种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携帯的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或Pl来源的人工染色体(PAC);噬菌体如入噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体 还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。本发明中“宿主细胞” 一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。“中和抗体” 一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。“序列相同百分比” 一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。对于某ー个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺ロ，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂得为比对设定合适的测量參数，包括为使用最大可比性的ー些运算法则达到全长序列的比较。“特异性结合” ー词指的是，两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到的或很弱。在某些实施方式中，某抗原特异性抗体是指以亲和カ(KD) く 10_5M (如10_6M、10_7M、10_8M、10_9M、KTkiM等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(k JktJ，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行測定。抗体本发明所述单抗能够特异性结合表面抗原分化簇4受体。本发明的ー个方面涉及能特异性结合表面抗原分化簇4受体的单抗及其相应的抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明所述单抗是由小鼠杂交瘤细胞株15A7所分泌的。这些单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，这些单抗15A7由杂交瘤细胞15A7产生，并命名为15A7。单抗15A7能特异性结合表面抗原分化簇4蛋白。小鼠杂交瘤细胞15A7已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC, Wuhan University, Wuhan, China)进行保藏，保藏号是CCTCC NO C201098 (杂交瘤细胞15A7，保藏时间2010年10月22日)。本发明的单抗还包括能阻断单抗15A7结合表面抗原分化簇4蛋白的单抗。这些单抗结合的表面抗原分化簇4蛋白的表位可以与单抗15A7所识别的表位相同。这些单抗所识别的表位也可以和单抗15A7所识别的表位在空间上有重叠。这样的单抗可以降低单抗15A7与表面抗原分化簇4受体蛋白的结合力至少30 %，或至少40 %，或优选至少50 %，或更优选至少60 %,或更优选至少70 %,或更优选至少80 %,或更优选至少90 %,或更优选95%，或最优选99%。本发明的单抗不能显著抑制HIV包膜糖蛋白gp 120与人表面抗原分化簇4蛋白结合。这些抗体影响HIV包膜糖蛋白gpl20与人表面抗原分化簇4蛋白(或重组人表面抗原 分化簇4蛋白sCD4及截短的人表面抗原分化簇4蛋白)至多30 %，或更优选20 %，或最优
选0%。本发明的单抗与人表面抗原分化簇4蛋白结合(含细胞表面、重组表达和截短的人表面抗原分化簇4蛋白)的结合在HIV包膜糖蛋白gpl20存在的情况下不受影响，这样的单抗在HIV包膜糖蛋白gpl20与表面抗原分化簇4受体蛋白的复合物的结合力影响为30 %，或优选为20 %，或更优选为5 %。可以米用常规方法如Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中描述的方法，测定某一未知单抗降低某一已知单抗结合表面抗原分化簇4蛋白的能力。例如，先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体和特定浓度的标记后的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中孵育，洗涤后測定不同稀释度的待测抗体已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越強，已知抗体结合抗原的能力就越弱。通常，抗原是预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法測定未标记单抗阻断已标记单抗的能力。可以采用Kohler等在Nature 256 :495 (1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单杭。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用福氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髄瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG,进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies Principles andPractice, pp. 59-103, Academic Press,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有ー种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如M0P-21和MC-Il小鼠肿瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA),和 SP-2/0 或X63_Ag8_653细胞株(AmericanType Culture Collection, Rockville, Md. USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor, J. Immunol. , 133 :3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antiboay ProductionTechniques and Applications,pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc.，New York,1987)。杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法有免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，流式细胞术(FACS)。例如，Munson等在Anal. Biochem. 107 220(1980)描述的Scatchard分析法可用来测定单抗的亲和力。当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和カ和反应性确定之后，目的细胞株可以通过(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp.59-103, AcademicPress, 1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。 利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。本发明的单抗还可以通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E. coli细胞、猿猴C0S、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。本发明的抗体对人表面抗原分化簇4蛋白结合具有高特异性和高亲和力。这些抗体对其它灵长类表面抗原分化簇4受体蛋白有交叉反应性。本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另夕卜，所述抗体也可以是保持了对表面抗原分化簇4受体蛋白亲和カ的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab'、F(ab' )2、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和カ可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(參见Morimoto等人，J. Biochem. Biophys. Methods 24 :107-117 (1992) andBrennan 等人，Science 229 81(1985))。另タ卜，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson, Curr. Opin. Immunol. 11 :548-557(1999) ；Little 等人，Immunol. Today,21 364-370 (2000) ) 0比如，Fab '片段可以直接从E. coli细胞中获得或化学偶联形成F(ab' )2 片段(Carter 等人，Bio/Technology, 10 :163-167 (1992))。再如，F(ab' )2 片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab、Fab'或F(ab' )2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。抗体核酸序列本发明涉及特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白(含细胞表面的、重组表达的和重组表达的截短的人表面抗原分化簇4蛋白)的抗体或抗体片段的编码核酸分子。编码抗体的核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓利用常规技术可以測定这些分子的核酸序列。本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗人表面抗原分化簇4蛋白抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另ー方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗人表面抗原分化簇4蛋白抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另ー方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的⑶R序列。互补决定区(complementary determinant region, Q)R)是与抗原表位结合的部位，本研究中的⑶R序列通过IMGT/V-QUEST(http://imgt. cines. fr/textes/vquest/)进行确定。但是不同的划分方法得到的CDR序列稍有不同。本发明的一方面涉及编码单抗15A7重链和轻链可变区序列的核酸分子。单抗15A7重链可变区序列的核酸分子对应于SEQ ID N0:1。单抗15A7轻链可变区序列的核酸分子对应于SEQ ID N0:3。本发明还涉及包含了单抗15A7重链和轻链可变区序列的核酸分子变体或类似体。另ー方面，本发明还涉及各种分离的核酸分子的变体。具体地，核酸变体的序 列与核酸序列SEQ ID NO USEQ ID NO :3的同一性至少达70%、优选至少达75%、更优选至少达80 %、更优选至少达85 %、更优选至少达90 %、最优选至少达95 %。本发明还提供能特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白的抗体片段的编码序列的核酸分子。本发明更进ー步涉及编码氨基酸序列为SEQ ID NO :2的抗体重链可变区的分离的核酸分子。本发明还涉及编码氨基酸序列为SEQ IDNO :4的抗体轻链可变区的核酸分子。本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。抗体多肽序列单抗15A7重链和轻链可变区氨基酸序列可以从对应的核酸序列中推导得到。单抗15A7重链可变区氨基酸序列是SEQ ID N0:2。单抗15A7轻链可变区氨基酸序列是SEQID NO :4。另ー方面，本发明提供了重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO :2的序列相似性至少达70 %，优选是至少75 %，优选是至少80 %，优选是85 %，再优选是至少90 %，最优选是至少95%的抗体。另ー方面，本发明提供了轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO 4的序列相似性至少达70 %，优选是至少75 %，优选是至少80 %，优选是85 %，再优选是至少90 %，最优选是至少95%的抗体。单抗15A7的重链和轻链可变区的⑶R的氨基酸序列分别是单抗15A7重链的CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs :5_7。单抗15A7轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs :8_10。另ー方面，本发明提供了抗⑶4单抗重链或片段，其含有选自SEQID NOs :5_7的一个或多个CDR。另ー方面，抗⑶4单抗的重链或片段的⑶R含有的氨基酸序列可以在SEQ IDNOs :5-7上出现ー个或多个氨基酸的突变或增添或缺失。优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过I个氨基酸。另ー方面，本发明提供了抗⑶4单抗轻链或片段含有选自SEQ IDNOs :8-10的ー个或多个CDR。另ー方面，抗人⑶4单抗的轻链或片段的⑶R含有的氨基酸序列可以在SEQ IDNOs :8-10上出现ー个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨 基酸不超过I个氨基酸。上述抗体或CDR的可变区的氨基酸发生突变、添加或缺失之后的变体仍然保留特异性结合CD4的能力。本发明也包含这样的抗原结合片段的变体。本发明的单抗变体可以通过传统的基因工程方法获得。本领域的技术人员完全知晓利用核酸突变改造DNA分子的方法。另外，编码重链和轻链变体的核酸分子也可以通过化学合成获得。嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白另ー方面，本发明也提供了嵌合抗体，它是由鼠源单抗15A7或其变体的重链和/或轻链完整的或部分的可变区结合人源单抗恒定区组成的。而且，本发明也包括人源化抗体，它们是由鼠源单抗15A7或其变体的ー个或多个CDR嫁接到人源抗体的框架上组成的。另ー方面，本发明还提供了偶联了某种分子的完全或部分的含有本发明所述单抗的融合蛋白。嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白都可以利用传统的基因工程技术获得。如，编码单抗的DNA可以通过突变的方法把人源抗体的重链和轻链的恒定区的序列替换成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison,等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 81 :6851 (1984)),或通过把整个或部分免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白编码序列进行共价偶联而获得嵌合或人源化抗体或融合蛋白。中和抗体另ー方面，本发明提供了能够中和人免疫缺陷病毒的抗CD4抗体。在一个实施方式中，这种中和抗体能够中和人免疫缺陷病毒感染⑶4+细胞的活性的至少60%，或至少70 %，或优选至少75 %，或优选至少80 %，或优选至少85 %，或优选至少90 %，更优选至少95%，最优选至少99. 99%。在体外中和HIV病毒实验中，IC50中和活性浓度优选在O. 0001-10 μ g/mL 之间，或优选为 50μ g/mL。本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和人免疫缺陷病毒的感染细胞活性。如本发明的实施例中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某ー个特定CD4单抗的中和活性。检测方法本发明还提供了ー种利用本发明所述单克隆抗体检测标本中的CD4抗原或其模拟物和/或抗体的方法。一方面，本发明提供了⑶4和⑶4相关治疗的检测方法，包括以下步骤⑴将本发明的单克隆抗体或其片段与上述样品中的抗原结合而行成抗体-抗原或抗体片段-抗原复合物；( )检测该样品复合物以确定样品中是否有CD4抗原或其模拟物。检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。竞争法比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单抗包被到固相支持物上而进行的。同时加入预先定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。在夹心法中，样品中的目标抗原被夹在包被单抗和标记单抗之间，然后再加入标记物比如酶的底物，通过底物顔色的变化检测并判定抗原的存在。开展基于夹心法的免疫学检测，例如，先把含有ー种未知数量目标抗原的样品加入到用物理或化学方法预先包被了本发明中所述单克隆抗体的固相支持物上进行反应。然后，加入本发明所述的标记单抗进行反应。孵育后，冲洗该支持物，再对结合到该支持物上的标记物的活性进行检測。 标记物可以是放射性同位素如125碘、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、3半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2'-连氮基-双(3-こ基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯ニ胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2'-螺旋金刚烧)_4_甲氧基-4-(3" _憐酸基)苯基-I，2-ニこ氧基烧(针对喊性憐酸酶)、对硝基苯-3-D-半乳糖和甲基伞形酮-D-半乳糖(针对3半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、表位标记如FLAG或HA表位、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、^-半乳糖苷酶或こ酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或ニ硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG ;突光基团如伞形三糖(umbelliferone)、突光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀緑、ニ苯こ烯、突光黄、Cascade蓝、ニ氯三嗪基突光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、突光镧系络合物如包括铕和铺、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其突光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantum dot):或放射性材料如14C、123I、124I、131I、Tc99m、35S或3H ;或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R. Lakowicz (Editor)所编的 Principles of FluorescenceSpectroscopy, Plenum Pub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P. Hoagland 的第六版的Molecular ProbesHandbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即 Qdots)，參见 U. S. P 6, 207, 392。Qdots 可从 Quantum DotCorporation 购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group II-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe、BaTe、ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS,HgSe, HgTe和其混合物以及Group III-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs, InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。在某些实施方式中，突光能量受体连接到检测探针作为标记物。在ー实施方式中，荧光能量受体可以通过化合物与单线态氧反应形成荧光化合物而形成，或通过化合物与一辅助化合物反应并将其转化为荧光化合物而形成。这类化合物可以包括于本发明装置中的缓冲液中。在其它的实施方式中，荧光能量受体可以是包括化学发光剂或基团的化合物的一部分，例如，荧光能量受体可以包括稀土金属如铕、钐、碲等金属络合物。这些材料因其具有尖锐的发光谱带而特别具有吸引力；而且，镧系标记物如铕(III)可以提供有效的长时间的信号发射，同时不易光漂白，因而可以使得含有处理/反应样品的测试装置在需要的情况下可以放置较长一段时间。在各种异源和同源免疫測定法中，已经使用长寿命的荧光铕(III)络合物纳米微粒作为标记物,例如可以參见Huhtinen等人Clin. Chem. 20040ct ；50(10) :1935-6。但这些内部标记的纳米微粒与时间分辨荧光检测一起使用时，測定性能可以改善。在异源測定中，低浓度下測定的动态范围可以扩展；而且，通过使用检测抗体涂 敷的高特异活性纳米微粒标记物，而不是使用常规标记的检测抗体，測定的动力学特性也可以改善。在同源測定中，对于荧光共振能量转移来说，铕(III)纳米微粒是很有效的供体，从而可以进行简单、快速和高效的筛选。在ー实施方式中，标记物如此处披露的荧光标记物，包括与生物分子偶联的纳米微粒标记物。换句话说，纳米微粒可以用作检测或捕捉探针。例如，本发明中，可以利用连接到单抗或链霉抗生物素蛋白(SA)的铕(III)-标记的纳米微粒来检测样品中特定的分析物，如纳米微粒基的免疫測定。纳米微粒可以作为附着特定结合剂的底物，这些特定结合剂是针对分析物和检测(如标记物)或捕捉成分的。有关标记物的实例可以參见 U. S. P 4，695，554 ;4，863，875 ;4，373，932 ;和 4，366，241。U. S. P4，313，734和4，373，932中则披露了胶体金属和染色颗粒。而U. S. P 4，954，452中则披露了如何制备和使用非金属的胶体；U. S. P 4，252，459中披露了用作标记物的有机聚合物乳胶颗粒。把标记物结合到抗原或抗体上的方法，可以通过顺丁烯ニ酰亚胺法(J. Biochem.(1976)，79，233)、生物素活化法(J. Am. Chem. Soc. (1978)，100，3585)、疏水结合法、酯活化法或异氰酸酉旨法(Igaku Shoin, " Enzymeimmune assay techniques " , 1987) 0如果上述标记物为放射性同位素，则需使用好的防辐射的工作台面或液体防护设备。如果上述标记物为酶，需加入底物，酶的活性通过比色法或荧光计測定。如果上述标记物为荧光物质、发光物质或有色物质，測定方法可以相应的使用本领域熟知的方法进行测定。治疗方法和药物组合物本发明的抗体及其活性片段及其同源物提供了一种预防和/或治疗CD4+细胞相关的病毒感染及相关疾病患者的方法，尤其是人免疫缺陷病毒(HIV)感染及其相关的疾病包括艾滋病，包括对患者施用一定量的包含本发明所述单抗的有药物活性的药物成分。本发明还提供了ー种含有本发明所述的单抗的药物成分或在此基础上得到的盐类药物。本发明的药物组合物可进ー步包含其它用于预防和/或治疗HIV感染的药剂，可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。例如，本发明的抗体及其活性片段及其同源物可以和能抑制反转录酶的抗反转录药剂，如AZT—同使用，或与能抑制HIV蛋白酶的药剂ー同使用；此外，本发明的药物组合物进ー步包含抗病毒药剂例如干扰素，免疫抑制剂如环胞菌素，但不仅限于这些。此外，ー种或多种抗体同源物也可与ー种或多种前述治疗剂一同使用。此种组合疗法的优点是可使用较低剂量的治疗药剂，因此可避免当使用単一药剂时可能会有的毒性或副作用。 本发明的药物组合物包含依据本发明的ー种或多种免疫治疗有效量的抗体同源物，或其衍生物，且优选的为药学可接受的载体。“免疫治疗有效量”指足够能防止因HIV感染或艾滋病，或由原靶为表达CD4的细胞的感染因子所引起的其他疾病所造成的免疫应答作用的量。“药学可接受的载体”指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其他不适影响的载体。合适的药学可接受的载体包括，例如，ー种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、こ醇和其他类似物，以及上述物质的组合。药学可接受的载体可进ー步包括能提高抗体或其活性片段或其同源物的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化齐U、防腐剂或缓冲液。本发明所述药物成分的施用方式可以是传统的施用途径，包括静脉滴注、肌肉注射、阴道、ロ服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃夕卜、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。优选的是注射及输液形式。本发明的组成可以有许多不同形式。这些包括，例如，固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液货悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。优选的形式视施用方式及其预防或治疗应用而定。优选的组合物是注射用及输液用的溶液的形式。适合肠胃外途径注射的药物成分可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、こ醇、多羟基化合物(如丙烯こニ醇、聚こ烯ニ醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如こ烷油酸，如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性，如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。本发明所述的药物组合物还可含有ー些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如parabens,chlorobutanol,苯酹，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。ロ服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剤，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚こ烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酷；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚こニ醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型，是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素こ烷，醋酸纤维素，聚こ烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯ニ酸醋酸纤维素，邻苯ニ甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有ー种或ー组具有改良释放速率的赋形齐 。本发明所述药物成分还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺钾，朽1檬酸，croscarmellosesodium, crospovidone,抗坏 血酸，こ烷基丙烯酸盐，こ烷基纤维素，明胶，氢氧基丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，甘露醇，甲基こ丁烯酸盐，调味薄荷，聚こニ醇，气化硅胶，ニ氧化硅，こ醇酸淀粉钠，硬脂酸延胡索酸钠，山梨醇，木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”ー词，依赖于所用药物的溶解性，如药物是不可溶的，可制成快速的雾化剂型，如药物是可溶的，则可制成快速的溶剂型。类似形式的固相成分也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚こニ醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适，也可用上述ー种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。用于ロ服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，液体剂型也可含有本领域常用的ー些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如こ烧基醇，异丙基醇，こ烧基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀こ_■醇，1，3- 丁烯こニ醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚こニ醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。除了这些惰性稀释液，药物成分也可包括保湿剂、乳化剤、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，药物成分还可包括こ氧基化均聚こ醇，聚氧こ烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。本发明所述药物成分也可制成适合兽用治疗的混合物，或符合兽用的盐类，或符合兽用的溶剂或初成药，井根据普通兽医和兽医从业者的要求制成最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。本发明优选的药物组合物与那些用于人被动免疫的其他抗体的组合物类似，例如肿瘤治疗抗体。优选的施用方式是非肠道施用。本发明所述ー个或多个单抗可以结合其它抗病毒试剂用于预防和或治疗CD4+细胞相关的疾病，包括但不限于人类免疫缺陷感染及其相关疾病。单抗可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2, IL-12和五羧链胞酸，但不仅限于这些。
此领域技术人员应不难了解，本发明抗体同源物或其活性片段的免疫治疗有效量将视施用程序、所施用的抗体同源物的单位剂量、抗体同源物是否与其他药剂一同使用、病人的免疫及健康情况、所施用的特定抗体同源物的抗病毒活性而定。实施例下面结合具体实施例与附图，对本发明进一歩加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。实施例I.可抑制HIV感染⑶4+细胞的抗⑶4单克隆抗体的制备小鼠6周龄雌性BALB/c鼠为厦门大学生命科学院实验动物中心提供。杂交瘤的制备我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体，详细万法參见 Ed Harlow 等人，Antibodies A Laboratory Manual, Cold Sp ring HarborLaboratory 1988.简要过程如下小鼠免疫将溶于PBS的重组s⑶4抗原溶液与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射实施例2中制备的纯化重组s⑶4抗原g (总体积50UL)。首次免疫后15天和29天，分别用同样剂量的重组抗原溶液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。融合前72小时，尾静脉加强注射5 u g不加佐剂的抗原I次进行加强免疫。融合取血清中和效价最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髄瘤细胞，混合后离心，经50%聚こニ醇(PEG2000)作用I分钟，使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。加入50mL含有20% FBS的RPMI1640培养基重悬融合细胞，将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后，分置于96孔细胞培养板中(200 y L/孔)于5%ニ氧化碳培养箱(ESPECBNA-311)37°C培养。3 天后，用含有 20% FBS 的 HT 培养基(I. 36Img 黄嘌呤(hypoxanthn，H)、0. 388mg 胸腺嘧啶核苷(thymidine, T)，加 RPMI 1640 (GIBC0 公司)培养基至 IOOmL045 50°C条件下溶解后，过滤除菌。半保留换液。杂交瘤的筛选融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清利用下述HIV感染TZM-bl细胞中和检测方法96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液。对于中和效果为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化，经3次克隆化后，得到所分泌的抗体能够稳定抑制HIV感染TZM-bl细胞的单克隆抗体细胞株(见实施例3)。筛选结果获得两株单克隆抗体，分别为15A7和14G7。抗体的类型及亚类鉴定以实施例2中制备的纯化s⑶4包被ELISA板。每孔加入单克隆抗体的细胞上清100 u L，37°C温育30分钟；在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次，每次间隔20秒，扣干，加入合适稀释度的HRP-山羊抗小鼠IgM、IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3抗体(Serotec公司)酶标ニ抗，于37°C温育30分钟；在TECAN全自动洗板机上用PBST洗涤5次，每次间隔20秒，扣干，加入显色液A (H2O2)和B (TMB)各I滴，于37°C显色10分钟，加入I滴终止液(2M H2SO4);在TECAN酶标仪上测量OD45tol(參比波长为620nm)，阈值为2倍的阴性均值，OD值大于阈值为阳性，OD值小于阈值为阴性。结果单克隆抗体15A7为IgGl 型，14G7 为 IgG2b 型。杂交瘤的培养稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在ニ氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔培养后转移至24孔，再转移至50mL细胞瓶中扩增培养。取10周龄的健康BALB/C小鼠，腹腔注射O. 5mL/只液状石蜡，1-2周后，每只小鼠腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞，7 10天后收集腹水。3000rpm离心15分钟，吸取中间澄清部分的液体，O. 45 μ m的微孔滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。单克隆抗体的纯化将腹水用O. 02M、pH7. 4 的 PBS (8ImL O. 2MNa2HP04,19mL O. 2MNaH2PO4，加生理盐水至1L)对倍稀释，搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度)，4°C过夜。4°C，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到33%饱和度，4°C静置过夜。4°C，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度)，4°C过夜。4°C，12，OOOrpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析袋中，放入50-100倍含20mM NaCl，pH 7. 8的120mM Tris-HCl缓冲液中4°C搅拌下脱盐12小时左右，期间更换3次以上透析液。取出后分装-20°C保存。实施例2.用做抗原的重组人⑶4片段多肽的制备
用做模板之人CD4胞外区片段的制备以TZM-bl细胞系(Cat. No. 8129NationalInstitutes of Health AIDS Research and ReferenceReagent Program)中的人CD4 cDNA为模板，CDWdDFG' -CGG CATATG AAG AAA GTG GTG CTG GGC-3')为正向引物，CD4(d4)R(5' -GCGAATTCTTACCATGTGGGCAGAACCTT-3')为反向引物，在 PCR 热循环仪(BiometraT3)按照如下条件进行PCR反应94°C 10分钟；随后是94°C 30秒，56°C 30秒，72°C I分钟的25个循环，最后为72°C延伸10分钟。得到特异的I. Ikb左右大小的用做制备各截短的重组人⑶4多肽之模板DNA片段。将上述获得的PCR产物与商售的pMD 18-T载体(TaKaRa公司生产)连接，经Nde I/EcoR I酶切鉴定，得到插入s⑶4基因的阳性克隆。利用M13 (+) /(-)引物，测序得经过上述方法制备的CD4胞外区的DNA片段保守序列，并用做制备各截短的重组人CD4多肽的模板。以如上获得的人CD4的N端胞外区的免疫球蛋白样结构域D1-D4序列为模板，利用表I中的正向引物(其5'端引入限制性内切酶NdeI)和反向引物(其5'端引入限制型内切酶EcoRI位点)。在PCR热循环仪(Biometra T3)按照如下条件进行PCR反应94°C 10分钟；随后是94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒的25个循环，最后为72°C延伸10分钟。其中，CD4(dl)所用正向引物为CD4(dl)F，反向引物为和CD4(dl)R;CD4(d2)所用正向引物为CD4 (d2) F，反向引物为和CD4 (d2) R ；CD4 (d3)所用正向引物为CD4 (d3) F，反向引物为和CD4 (d3) R ；CD4 (d4)所用正向引物为CD4 (d4) F，反向引物为和CD4 (d4) R ；CD4 (dト2)所用正向引物为CD4(dl)F，反向引物CD4(d2)R得到特异的DNA片段，为编码本发明所述各截短的人CD4的多核苷酸序列，其氨基酸序列如图I所示。表I.⑶4各结构域截短的重组蛋白克隆引物序列
权利要求
1.ー种单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有至少ー项选自以下的特征 (i)特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白； ( )与含有人表面抗原分化簇4蛋白Dl结构域的截短形式的人表面抗原分化簇4多肽特异性反应； (iii)对人免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gpl20与人表面抗原分化簇4蛋白的反应无明显影ロ向;和 (iv)阻断人免疫缺陷病毒感染CD4+细胞及再感染，和/或阻断由此引起的疾病，例如艾滋病。
2.ー种单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链的CDRl、CDR2和CDR3和所述抗体的轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3分别是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤产生的抗体15A7 或抗体 14G7 的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 和轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3。
3.ー种单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区和轻链可变区分别是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤产生的抗体15A7或抗体14G7的重链可变区和轻链可变区。
4.权利要求1-3任ー项蛋白的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO18 和 SEQID NO 20 所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQID NOs :5_7或由SEQ ID NOs :11-13的核苷酸序列编码，所述抗体的轻链⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs :8_10或由SEQ ID NOs 14-16的核苷酸序列编码；或者，所述抗体的重链⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs :21-23或由SEQ IDNOs :27-29的核苷酸序列编码，所述抗体的轻链CDRU CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs :24-26或由SEQ ID NOs :30-32的核苷酸序列编码。
6.如权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为Fab、Fabi、F{ah' )2、Fv或单链抗体。
7.如权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述的单克隆抗体结合人表面抗原分化簇4蛋白的Kd值小于I X 1(Γ5Μ。
8.如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述的单克隆抗体包括非CDR区，该非CDR区是来自非鼠类的物种。
9.一种特异性结合人表面抗原分化簇4蛋白的单克隆抗体，其是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤产生的抗体15Α7。
10.一种杂交瘤细胞株，其是CCTCC保藏号C201098的杂交瘤。
11.一种检测样品中人表面抗原分化簇4蛋白的方法，其包括如下步骤 a)将所述的样品与权利要求1-9任ー项的单克隆抗体或其抗原结合部分接触； b)检测所述的单克隆抗体与所述样品中的蛋白的反应； c)检测所述的单克隆抗体与所述样品中的蛋白及人免疫缺陷病毒包膜蛋白的反应； 优选地，其中所述的单克隆抗体或其抗原结合部分附着在固相载体上；优选地，其中所述的固相载体选自微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜；更优选地，其中所述的单克隆抗体或其抗原结合部分是按如此方向附着在所述固相上，该方向能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率；更优选地，其中所述的单克隆抗体或其抗原结合部分是通过其恒定区域而附着在所述固相上的。
12.—种治疗受试者中由人免疫缺陷病毒感染引发的疾病的方法，其包括向所述的受试者施用治疗上有效量的、权利要求1-9任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求1-9任一项所述的单克隆抗体用于制备治疗或预防以CD4+细胞为目标细胞的疾病(如艾滋病)的药物的用途，用于制备阻断HIV感染CD4+细胞及再感染的药物的用途。
14.ー种药物组合物，其包含如权利要求1-9任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体；优选地，其中所述的单克隆抗体或其抗原结合部分为Fab、Fab'、F (ab' ) 2 或 Fv。
全文摘要
本发明提供了抗CD4蛋白的单克隆抗体及其活性片段及用途，本发明的抗体可阻断人免疫缺陷病毒通过与人CD4蛋白结合侵入细胞。本发明的抗体可用于探测、诊断、预防和治疗以CD4细胞为目标细胞的疾病，特别是人免疫缺陷病毒(HIV)病毒引起的艾滋病。本发明还提供了相关的杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及包含该单克隆抗体的药物组合物和试剂盒。
文档编号A61P31/18GK102649818SQ201210047960
公开日2012年8月29日 申请日期2012年2月24日 优先权日2011年2月25日
发明者侯汪衡, 张军, 方楚, 曹芳, 王海虹, 顾颖, 高双全 申请人:厦门万泰沧海生物技术有限公司, 厦门大学