专利名称：一种核酸分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，具体是涉及ー种核酸分子及其应用。
背景技术：
microRNA(简写miRNA)是目前研究最热门的非编码小RNA之一，它是ー类长度约为22bp，由dicer酶从有特定ニ级结构的前体剪切加工成熟的，通过与mRNA完全或不完全配对来调节基因表达的RNA分子，它属于非编码小RNA家族的ー员，在物种之间是保守的。 miRNA參与调节细胞的生长，繁殖，分化，调亡等生命过程。超过一半的人类miRNA基因在基因组的位置被认为与癌症有关，如脆性位点，扩增相关的窄位点区，或者断裂位点区。miRNA基因在核内由RNA聚合酶II (Pol II)转录为初级前体(primary miRNA，简写pri-miRNA)，pri-miRNA含ー个7甲基鸟嘌呤(7_mG)的帽子和多聚腺苷酸的尾(PolyA)， 这些是RNA聚合酶II转录体的特征，pri-miRNA还包含stem-loop结构，pri_miRNA被 III 类 RNA 酶(RNase 111) Drosha 切割为约 70bp 的前体 miRNA (precursor miRNA，简写 pre-miRNA)，其它侧翼序列被认为在核内被降解(Lee Y，et al. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 23 :4051 4060) 。pre_miRNA 由白 Ran 依赖的核转运因子受体export-5(Exp。送至核外，在细胞质内由核酸酶RNase III dicer 加工为约 22bp 成熟的 miRNA (He L and Hannon G. 2004. MicroRNAs =Small RNAs with a big roie in the gene regulation. Nature Gnetics 5 :522-532)。成熟的 miRNAs 与一些蛋H 构成复合体，miRISC 调节基因的表达(Mourelators et al.，2002. miRNPs :a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev. 16(6) :720-728.)。 在复合体形成过程中，Dicer剪切产物(约22bp的双链miRNA)变成单链，也称为成熟的 miRNA，另一条链迅速消失。miRNA可以抑制mRNA的翻译，或者通过脱腺苷酸，脱帽等促进 mRNA降解，RNA processing body (P_body也称为GW body)可能在mRNA降解过程发挥了作用(BehM-Ansmant J, et al. 2006. microRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71 :523-530)1969 年 Britten 禾ロ Dabidson(Britten RJ, Davidson EH. 1969. Gene regulation for higher cells :a theory. Science 165(891) :349-357.)年提出设想从基因组翻译的活性RNAs分子与调控DNA序列形成复合物来激活ー些蛋白表达基因。Lee et al (Lee Rし，Feinoaum RL, Ambros V. 1993. The し· elegans heterochronic gene lin_4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,75 (5) :843-54.) /AffM 线虫(Caenorhabditis elegans)中发现ー个非编码蛋白的小RNA分子lin_4通过负调控 lin-14蛋白的表达来调控秀丽线虫的发育，进ー步发现lin4存在22nt和61nt的两种转录本且与lin-14蛋白的RNA的3’端非翻译区(UTR)有互补配对序列，并认为lin4与lin-14 通过RNA-RNA相互作用的形式来调控蛋白lin-14的表达。Reinhart et al (Reinhart BJ et al. 2000. The 21—nucleotide let_7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772) :901-906.)发现另一非编码小 RNA 分子 let-7通过调控1 in-41蛋白RNA分子的3，UTR来调控蛋白的1 in-41的表达从而调控秀丽线虫的发育。2001年Bartel，TuSChl，Ambr0S三个独立的实验室同时发现大量类似的非编码小RNA调控分子，并将其统称为microRNA(简称miRNA)，并不再使用stRNA(small temporal RNA) S—^^ (Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. 2001. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294 858-862 ；Lagos-Quintana Μ,Rauhut R,Lendeckel W,Tuschl Τ. 2001. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science(New York, NY 294:853-858.； Lee RC, Ambros V. 2001. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543) :862-864.)miRNA 统ー收录在英国 Sanger 中心的 miRNA 数据库中(http://www.sanger.ac.ck/)，目前在该数据库中注册的人类(Homo sapiens)的 miRNA 为 1921 条，小鼠(Mus musculus)的为 1157，大鼠(Rattus norvegicus)的为 680 条(Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. 2008. miRBase :tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36 :D154_158)。研究表明，microRNAs作为重要的效应分子參与了細胞信号传导的调控。转录因子 p53 和 p65 调控的相关的 microRNAs 已有相关报道(Bhaumik, D.，Scott, G. K.，Schokrpur, S. , Patil, C.K., Campisi, J. , and Benz, C. C. (2008). Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction oi metastatic potential m breast cancer ceils. Oncogene 27,5643-5647. Song, B. ， Wang, Y. ， Kudo, K. ， Gavin, E. J. ， Xi, Y. G. , and Ju, J. F. (2008). miR-192 Regulates Dihydrofolate Reductase and Cellular Proliferation through the p53_microRNA Circuit. Clinical Cancer Research 14, 8080-8086.)，然而对介导p53和p65互作的microRNAs尚未见报道。NF-κΒ转录因子在炎症、免疫反应、細胞増殖凋亡等过程中具有重要的调控作用。 NF-k B家族是ー类含有RHD结构域的蛋白，成员包括NFkBl、NFkB2(p52/pl00)、c-Rel、RelB 以及RELA(即p65)，其中p65作为最重要的成员參与了細胞的转化以及肿瘤的发生。研究表明，在炎症反应中激活NF-k B有助于肿瘤的发生和发展(Karin，Μ. (2006). Nuclear factor-kappa B in cancer development and progression. Nature 441,431—436),在月市癌模型中发现，肺癌的发生需要NF-kB的活性错误！未找到引用源。。除此之外，在癌症化疗及放疗中常常会导致非经典通路NF-kB的激活，从而引发癌症治疗的耐药性错误！未找到引用源。。直被认为是一个癌症治疗及预防的靶标分子(Li，F.，and Sethi, G. (2010). Targeting transcription ιactor NF-KappaB to overcome chemoresistance ana radioresistance in cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1805，167-180)错误！未找到引用源。，p65调节机理的阐述在癌症治疗中具有重要的意义。脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，縮写为DNA)是ー种长链脱氧核苷酸聚合物，4种主要的組成核苷酸包括脱氧腺嘌呤核苷酸(dA)，脱氧鸟嘌呤核苷酸(dG)，脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)，脱氧胞嘧啶核苷酸(dC)；核糖核酸(Ribonucleicacid，縮写为RNA)是一种长链核苷酸聚合物，4种主要組成核酸包括腺嘌呤核苷酸(A)，鸟嘌呤核苷酸(G)，尿嘧啶核苷酸(U)，胞嘧啶核苷酸(C). DNA与RNA在碱基组成上的主要区别是DNA用的是dA、dT、 dG、dC，而RNA用的是A、U、C、G，其中dA，dC，dG分別比A，C，G碱基在核糖2位上少ー个羟基-OH.DNA或者RNA的組成分子核苷酸又是由三部分組成的碱基，核糖，磷酸。其中的 核糖一般是五碳糖，碱基与核糖结合组成核苷。核糖2位碳原子连有羟基(-0H)的是核糖， 没有羟基的就是脱氧核糖。核苷酸之间通过核糖5位的磷酸集団与3位的羟基缩合形成磷 酸ニ脂键将核苷酸连在一起形成短链的寡核酸或者长链的DNA或者RNA，链的两端分別称 做5 ‘端、3，端。在分子生物学应用中应用较多的是短链的寡核酸，其碱基，核糖，磷酸可以分别被 修饰或集团替换，在提高核苷酸的稳定性的同吋，不影响该核苷酸发挥生物学功能。自然存 在的RNA形式及常见的修饰方法见下图。
权利要求
1.ー种核酸分子，其特征在于，其碱基组成为SEQ ID NO. 1、或SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、或 SEQ ID NO. 3、或 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 9。
2.—种核酸分子，其特征在于，其碱基组成为SEQ ID NO. 1、或SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、或SEQ ID NO. 3、或SEQ ID NO. 4，且含有修饰的核苷酸类似物，该修饰的核苷酸类似物为糖基修饰或磷酸骨架修饰或碱基修饰或末端修饰的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述核苷酸类似物是糖基修饰的核糖核苷酸，核糖核苷酸的2，-羟基被置換为H、OR、R、卤素、SH、SRI、NH2、NHR、NR2或CN，其中R是C1-C20的烷基、烯基、共轭基、或炔基，所述卤素是F、Cl、Br或I。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述核苷酸类似物是糖基修饰的核糖核苷酸，核糖被置換为核糖类似物结构为^,ΟμΝΗ^-Α,，其中含有该结构的包括双环或多环核糖，无环核糖，或肽核苷酸，其中X是F、Cl、Br或I。
5.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述修饰核苷酸类似物是含有修饰的非天然碱基的核苷酸，其碱基结构为CVmO^N^S^X^，其中含有该结构的包括嘌呤碱基类似物、嘧啶碱基类似物、化学或光交联基团，其中X是F、Cl、Br或I。
6.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述末端修饰饰的核苷酸的结构为 CmcAJN^S^X^，其中含有该结构的包括胆固醇、生物素、胆酸、叶酸、维生素、或荧光分子，其中X是F、Cl、Br或I。
7.权利要求1-6任一项所述的核酸分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述肿瘤为肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠
9.权利要求1-6任一项所述的核酸分子作为肿瘤诊断标记物的应用。
10.一种治疗肿瘤的药用组合物，其活性成包括有权利要求1-6任一项所述的核酸分子。
全文摘要
本发明提供一种核酸分子，其碱基组成为SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9，或其碱基组成为SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4，且含有修饰的核苷酸类似物，该修饰的核苷酸类似物为糖基修饰或磷酸骨架修饰或碱基修饰或末端修饰的核苷酸。用该核酸分子制备得到的抗肿瘤的药用组合物可以用于肺癌诊断及预后的判断。
文档编号A61P35/00GK102533770SQ20121007171
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者冯世鹏, 尹梦回, 张必良, 王玮 申请人:广州市锐博生物科技有限公司