专利名称：一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂。
背景技术：
造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞 分化的能力。造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病(如急性白血病、慢性粒细胞白血病等)、非恶性难治性血液病(如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等)遗传性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海贫血等)和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，与上述三种来源的造血干细胞相t匕，胎盘中所含造血干细胞的数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。目前从胎盘分离制备造血干细胞的技术还不成熟，现有技术中有采用研磨法和酶法制备胎盘造血干细胞的报道。但是，研磨法较为粗糙，细胞不能从组织中完全分离，数量少，而且研磨的方法对细胞有伤害，影响活力。而酶法多是采用单一酶来进行酶解制备，其中绝大部分为IV型胶原酶，如申请号为01131190. 8的中国专利“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法”，其中记载了利用单一胶原酶制备胎盘造血干细胞的方案，但并未公开造血干细胞数量和活力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂，使得所述制备方法能够提高所制备的胎盘造血干细胞的数量和活力。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤步骤I、将胎盘预处理后，用IV型胶原酶消化液和II型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，分别收集第一滤液和第一滤渣，所述IV型胶原酶消化液中IV型胶原酶质量百分比为0. 02-0. 2%，所述II型胶原酶消化液中II型胶原酶质量百分比为0. 01-0. 1% ；步骤2、将所述第一滤渣用I型胶原酶消化液和步骤I所述II型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，分别收集第二滤液和第二滤渣，所述I型胶原酶消化液中I型胶原酶质量百分比为0. 02-0. 2% ；步骤3、合并第一滤液和第二滤液并离心，弃上清后重悬沉淀，将得到的重悬液加至人淋巴细胞分离液中，然后密度梯度离心，收集中间一层的白膜层细胞液并离心，弃上清后即得胎盘造血干细胞。其中，作为优选，所述胎盘与IV型胶原酶消化液的体积比为6:1，所述胎盘与II型 胶原酶消化液的体积比为6:1，所述胎盘与I型胶原酶消化液的体积比为6:1。本发明所述IV型胶原酶消化液、I型胶原酶消化液和II型胶原酶消化液均优选用DMEM/F12 (gibco)培养液溶解配制，除此之外也可用本领域其他常规培养液溶解配制。本发明所用胎盘由某医院妇产科提供，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。现有技术通常采用单一的胶原酶(主要是IV型胶原酶)来进行酶解消化胎盘，进而制备出胎盘造血干细胞，但是单一的胶原酶无法充分酶解消化胎盘的各种组织，使得制备的胎盘造血干细胞的数量较少，而且活力也不高。因此，本发明采用IV型胶原酶和II型胶原酶联合、I型胶原酶和II型胶原酶联合进行两次消化胎盘组织，利用不同类型胶原酶的特性，高度消化组织，释放出更多的造血干细胞。胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，当拟消化的组织内含较多结缔组织或胶原成分时，可采用胶原酶解离细胞法，而胎盘正属于这一类组织。I型胶原酶用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离，用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞；IV型胶原酶包含至少7种蛋白酶成分，它能消化多种组织；II型胶原酶适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离。各种胶原酶对胶原的酶切位点不同，选择恰当类型的胶原酶联合起来消化胎盘组织效果会提高。作为优选，所述消化在37°C恒温条件下消化20_60mino在本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领域公知，即对胎盘进行消毒、除去胎盘包膜以及洗涤的步骤，在酶解消化胎盘之前，本领域技术人员均知晓这些预处理步骤。为了能够提高酶解消化的效果，本发明还可以将胎盘剪成l-2mm3的小块。在本发明所述制备方法中，所有洗涤和重悬均优选为采用生理盐水洗涤和重悬。另外，在步骤I和步骤2中，所述过滤均优选为采用50-300目的筛网过滤。为了进一步提高最后获得的胎盘造血干细胞的数量，作为优选，在步骤I之后、步骤2之前还包括以下步骤将所述第一滤渣洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合并至所述第一滤液。同时，在步骤2之后、步骤3之前还包括以下步骤将所述第二滤渣洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合并至所述第二滤液。
上述对滤渣的重复洗涤可以最大程度上避免残留在未消化胎盘组织(即滤渣)上的细胞损失。在本发明所述制备方法步骤3中，需要利用人淋巴细胞分离液对两次的滤液进行分离，在这之前优选用500-1000g离心力对合并的滤液离心，然后弃上清重悬沉淀。在密度梯度离心时，由于人淋巴细胞分离液密度小于红细胞、大于单个核细胞，离心后处于中间的白膜层就是单个核细胞的细胞液，其中包含有造血干细胞，所述密度梯度离心的离心力优选为500-800g，离心时间优选为10-20min。白膜层细胞液处于中间一层，在分离过程中难免带有一些人淋巴细胞分离液，而且白膜层细胞液较为粘稠，因此离心的时候需要较大的离心力。作为优选，本发明所述白膜层细胞液的离心具体为将所述白膜层细胞液先用400_700g的离心力离心5_10min,弃上清重悬沉淀,接着将重悬液用300-500g的离心力离心5-10min。此外，本发明还提供一种由本发明所述制备方法制备的胎盘造血干细胞，经流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。在与研磨法、单一胶原酶法制备的胎盘造血干细胞的对比试验中，本发明制备方法制备的造血干细胞活力明显高于其余两种方法制备的造血干细胞的活力，而且在造血干细胞数量上也较高。本发明还提供一种胎盘造血干细胞注射剂，由本发明所述胎盘造血干细胞和含质量百分比为10-30%血清白蛋白的生理盐水组成，所述注射剂可根据不同细胞数来决定含血清白蛋白的生理盐水的添加量，做成不同规格的产品。由以上技术方案可知，本发明采用IV型胶原酶和II型胶原酶联合、I型胶原酶和II型胶原酶联合，利用不同类型胶原酶的特性充分消化胎盘制备胎盘造血干细胞，由此提高了所制备的胎盘造血干细胞的数量和活力。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射 齐U。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂进行详细说明。实施例I :本发明所述制备方法制备胎盘造血干细胞选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。在无菌超净台内，取l_2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘包膜除去剪取胎盘组织，将剪碎的胎盘组织放入烧杯中用生理盐水反复冲洗1-3次，洗去残留在胎盘组织表面的血液，然后用手术剪将胎盘组织剪成l_2mm3大小。将剪碎的胎盘转移到试剂瓶内，按胎盘与胶原酶体积比6:1相继加入质量百分比为0. 1%的IV型胶原酶消化液和质量百分比为0. 05%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化45min。消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第一滤液中备用。将第一滤渣收集到试剂瓶内，同样按胎盘与胶原酶体积比6:1的比例相继加入质量百分比为0. 1%的I型胶原酶消化液和质量百分比为0. 05%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37°C恒温水浴锅中消化30min。
消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第二滤液中。合并第一滤液和第二滤液，以800g离心力离心lOmin，弃去上清，收集细胞(沉淀部分)。将收集的细胞用生理盐水悬浮，将重悬液加到人淋巴细胞分离液中，650g密度梯度离心15min，收集中间一层的白膜层细胞液。将收集的白膜层细胞液先用400g的离心力离心5min，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用300g的离心力离心lOmin，弃上清后即得胎盘造血干细胞(沉淀部分)。将最后得到的细胞用流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。实施例2 :细胞数量和活力的对比用与实施例I相同来源、体积的胎盘分别用现有的研磨法、单一胶原酶法来制备胎盘造血干细胞，其中涉及到重悬、洗涤、离心等步骤的地方均与实施例I中一致，在单一胶原酶法中，所采用的单一胶原酶消化液的量和胶原酶质量百分比均与实施例I中对应的胶原酶消化液的量和胶原酶质量百分比相同，最后对这几种方法制备出的胎盘造血干细胞的数量和活力进行检测，结果见表I。表I细胞数量和活力
IV型胶原酶 II型胶原酶 I型胶原酶研磨法实施例I法
法法法
造血干细胞
3.21 X IO6 6.34 X IO6 4.32 x IO6 5.21 乂 IO6 2.50 x IO7
数量(个)______
造血干细跑
65°/o83%78%80%92%
活力(％) _____由上表可以看出，采用本发明多种胶原酶联合消化法制备的胎盘造血干细胞的数量均高于其他几种方法制备的细胞数量，而且在细胞活力上也比较高。
实施例3 :本发明所述制备方法制备胎盘造血干细胞选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。在无菌超净台内，取l_2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘包膜除去剪取胎盘组织，将剪碎的胎盘组织放入烧杯中用生理盐水反复冲洗1-3次，洗去残留在胎盘组织表面的血液，然后用手术剪将胎盘组织剪成l_2mm3大小。将剪碎的胎盘转移到试剂瓶内，按胎盘与胶原酶体积比10:1相继加入质量百分比为0. 2%的IV型胶原酶消化液和质量百分比为0. 1%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化35min。 消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第一滤液中备用。将第一滤渣收集到试剂瓶内，同样按胎盘与胶原酶体积比10:1的比例相继加入质量百分比为0. 2%的I型胶原酶消化液和质量百分比为0. 1%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37°C恒温水浴锅中消化25min。消化完毕加入100-500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第二滤液中备用。合并第一滤液和第二滤液，以IOOOg离心力离心lOmin，弃去上清，收集细胞(沉淀部分)。将收集的细胞用生理盐水悬浮，将重悬液加到人淋巴细胞分离液中，500g密度梯度离心20min，收集中间一层的白膜层细胞液。将收集的白膜层细胞液先用700g的离心力离心lOmin，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用500g的离心力离心5min，弃上清后即得胎盘造血干细胞(沉淀部分)。将最后得到的细胞用流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。按照实施例2的方法进行对比试验，检测结果显示，本实施例制备方法制备的胎盘造血干细胞数量在IO7数量级，活力高于92%，而其他制备方法的细胞数量在IO6数量级，细胞活力低于85%。实施例4 :本发明所述制备方法制备胎盘造血干细胞选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。在无菌超净台内，取l_2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘包膜除去剪取胎盘组织，将剪碎的胎盘组织放入烧杯中用生理盐水反复冲洗1-3次，洗去残留在胎盘组织表面的血液，然后用手术剪将胎盘组织剪成l_2mm3大小。将剪碎的胎盘转移到试剂瓶内，按胎盘与胶原酶体积比3:1相继加入质量百分比为0. 02%的IV型胶原酶消化液和质量百分比为0. 01%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化60min。
消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第一滤液中备用。将第一滤渣收集到试剂瓶内，同样按胎盘与胶原酶体积比3:1的比例相继加入质量百分比为0. 02%的I型胶原酶消化液和质量百分比为0. 01%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化40min。消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50 -300目筛网过滤，收集第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第二滤液中备用。合并第一滤液和第二滤液，以600g离心力离心lOmin，弃去上清，收集细胞(沉淀部分)。将收集的细胞用生理盐水悬浮，将重悬液加到人淋巴细胞分离液中，600g密度梯度离心18min，收集中间一层的白膜层细胞液。将收集的白膜层细胞液先用600g的离心力离心lOmin，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用400g的离心力离心lOmin，弃上清后即得胎盘造血干细胞(沉淀部分)。将最后得到的细胞用流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。按照实施例2的方法进行对比试验，检测结果显示，本实施例制备方法制备的胎盘造血干细胞数量在IO7数量级，活力高于92%，而其他制备方法的细胞数量在IO6数量级，细胞活力低于85%。实施例5 :本发明所述制备方法制备胎盘造血干细胞选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。在无菌超净台内，取l_2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘包膜除去剪取胎盘组织，将剪碎的胎盘组织放入烧杯中用生理盐水反复冲洗1-3次，洗去残留在胎盘组织表面的血液，然后用手术剪将胎盘组织剪成l_2mm3大小。将剪碎的胎盘转移到试剂瓶内，按胎盘与胶原酶体积比7:1相继加入质量百分比为0. 15%的IV型胶原酶消化液和质量百分比为0. 07%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化40min。消化完毕加入100-500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第一滤液中备用。将第一滤渣收集到试剂瓶内，同样按胎盘与胶原酶体积比7:1的比例相继加入质量百分比为0. 15%的I型胶原酶消化液和质量百分比为0. 07%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37°C恒温水浴锅中消化30min。消化完毕加入100-500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第二滤液中备用。合并第一滤液和第二滤液，以500g离心力离心lOmin，弃去上清，收集细胞(沉淀部分)。将收集的细胞用生理盐水悬浮，将重悬液加到人淋巴细胞分离液中，700g密度梯度离心14min，收集中间一层的白膜层细胞液。将收集的白膜层细胞液先用550g的离心力离心lOmin，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用400g的离心力离心lOmin，弃上清后即得胎盘造血干细胞(沉淀部分)。将最后得到的细胞用流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。按照实施例2的方法进行对比试验，检测结果显示，本实施例制备方法制备的胎盘造血干细胞数量在IO7数量级，活力高于92%，而其他制备方法的细胞数量在IO6数量级，细胞活力低于85%。实施例6 :本发明所述制备方法制备胎盘造血干细胞
选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。在无菌超净台内，取l_2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘包膜除去剪取胎盘组织，将剪碎的胎盘组织放入烧杯中用生理盐水反复冲洗1-3次，洗去残留在胎盘组织表面的血液，然后用手术剪将胎盘组织剪成l_2mm3大小。将剪碎的胎盘转移到试剂瓶内，按胎盘与胶原酶体积比4:1相继加入质量百分比为0. 06%的IV型胶原酶消化液和质量百分比为0. 03%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒温水浴锅中消化50min。消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第一滤液中备用。将第一滤渣收集到试剂瓶内，同样按胎盘与胶原酶体积比4:1的比例相继加入质量百分比为0. 06%的I型胶原酶消化液和质量百分比为0. 03%的II型胶原酶消化液，拧紧瓶盖用封口膜封住瓶口，放入37°C恒温水浴锅中消化35min。消化完毕加入100_500ml生理盐水洗涤、用50-300目筛网过滤，收集第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用生理盐水(每次100-500ml)洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合
并至第二滤液中备用。合并第一滤液和第二滤液，以750g离心力离心lOmin，弃去上清，收集细胞(沉淀部分)。将收集的细胞用生理盐水悬浮，将重悬液加到人淋巴细胞分离液中，800g密度梯度离心lOmin，收集中间一层的白膜层细胞液。将收集的白膜层细胞液先用500g的离心力离心lOmin，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用300g的离心力离心lOmin，弃上清后即得胎盘造血干细胞(沉淀部分)。将最后得到的细胞用流式细胞仪检测其表面标志物⑶34和⑶45，结果显示⑶34阳性，⑶45阴性细胞含量为I. 5-1. 8%，表明含有较高量的造血干细胞。按照实施例2的方法进行对比试验，检测结果显示，本实施例制备方法制备的胎盘造血干细胞数量在IO7数量级，活力高于92%，而其他制备方法的细胞数量在IO6数量级，细胞活力低于85%。实施例7 :胎盘造血干细胞注射剂的制备
用含20% (质量百分比)人血白蛋白的生理盐水悬浮实施例I制备的造血干细胞，调整细胞数为4 X IO7个/mL分装到细胞保存袋内，制成胎盘造血干细胞注射剂。实施例8 :胎盘造血干细胞注射剂的制备用含30% (质量百分比)人血白蛋白的生理盐水悬浮实施例4制备的造血干细胞，调整细胞数为2 X IO7个/mL分装到细胞保存袋内，制成胎盘造血干细胞注射剂。实施例9 :胎盘造血干细胞注射剂的制备用含10% (质量百分比)人血白蛋白的生理盐水悬浮实施例6制备的造血干细胞，调整细胞数为3 X IO7个/mL分装到细胞保存袋内，制成胎盘造血干细胞注射剂。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤I、将胎盘预处理后，用IV型胶原酶消化液和II型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，分别收集第一滤液和第一滤渣，所述IV型胶原酶消化液中IV型胶原酶质量百分比为0.02-0. 2%，所述II型胶原酶消化液中II型胶原酶质量百分比为0. 01-0. 1% ； 步骤2、将所述第一滤渣用I型胶原酶消化液和步骤I所述II型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，分别收集第二滤液和第二滤渣，所述I型胶原酶消化液中I型胶原酶质量百分比为 0. 02-0. 2% ； 步骤3、合并第一滤液和第二滤液并离心，弃上清后重悬沉淀，将得到的重悬液加至人淋巴细胞分离液中，然后密度梯度离心，收集中间一层的白膜层细胞液并离心，弃上清后即得胎盘造血干细胞。
2.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，所述胎盘与IV型胶原酶消化液的体积比为6:1。
3.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，所述胎盘与II型胶原酶消化液的体积比为6:1。
4.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，所述胎盘与I型胶原酶消化液的体积比为6:1。
5.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，在步骤I之后、步骤2之前还包括以下步骤 将所述第一滤渣洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合并至所述第一滤液。
6.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，在步骤2之后、步骤3之前还包括以下步骤 将所述第二滤渣洗涤1-3次，收集每次洗涤后的冲洗液合并至所述第二滤液。
7.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，所述白膜层细胞液的离心具体为 将所述白膜层细胞液先用400-700g的离心力离心5-10min，弃上清重悬沉淀，接着将重悬液用300_500g的离心力离心5-10min。
8.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于，步骤I和步骤2所述消化为在37°C恒温条件下消化20-60min。
9.权利要求1-8任意一项所述制备方法制备的胎盘造血干细胞。
10.一种胎盘造血干细胞注射剂，其特征在于，由权利要求9所述胎盘造血干细胞和含质量百分比为10-30%人血白蛋白的生理盐水组成。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂。该制备方法将胎盘预处理后，用Ⅳ型胶原酶消化液和Ⅱ型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，分别收集第一滤液和第一滤渣；将所述第一滤渣用Ⅰ型胶原酶消化液和步骤1所述Ⅱ型胶原酶消化液消化，然后洗涤、过滤，收集第二滤液；合并两次滤液并离心，弃上清后重悬沉淀，将重悬液加至人淋巴细胞分离液中，然后密度梯度离心，收集中间一层的白膜层细胞液并离心，弃上清后即得胎盘造血干细胞。本发明采用Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶联合、Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶联合，利用不同胶原酶的特性充分消化胎盘制备造血干细胞，提高了所制备的造血干细胞的数量和活力。
文档编号A61K35/50GK102660499SQ20121016240
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者吕康涛, 李春波 申请人:郑州赛英科干细胞技术有限公司