专利名称：针对csf-1r的抗体的制作方法
针对CSF-1R的抗体本申请是申请日为2009年3月11日、发明名称为“针对CSF-1R的抗体”的中国专利申请200980108967. 9 (国际申请号PCT/EP2009/001733)的分案申请。CSF-1(集落剌激因子-I)是由多种类型细胞特别表达的细胞因子。它是表达CSF-I受体(CSF-IR)的单核巨噬细胞系细胞的分化、生长和存活因子(SHERR.Colony-stimulating factor-lreceptor，blood. 1990，第 75 卷，第 I 期，第 1-12 页·)。CSF-IR是由c-fms原癌基因编码的酪氨酸激酶受体，其含有一个胞内激酶结构域和以5个免疫球蛋白样亚结构域构成的一个配体结合胞外区。对CSF-I的应答导致增加的存活、生长、分化和功能的可逆改变。c-fms基因本身是巨噬细胞分化标记。c-fms表达的程度强于包括溶菌酶和巨噬细胞特异性蛋白酪氨酸磷酸酶在内的其他巨噬细胞特异性基因表达的程度(HUME,等人· Regulation of CSF-IReceptor expression. Molecular reproductionand development. 1997，第 46 卷，第 I 期，第 46-52 页·)。 除了单核巨噬细胞系细胞之外，CSF-IR也由许多类型的人肿瘤表达。在乳腺癌中，CSF-IR表达与更大的肿瘤尺寸和存活降低相关(KLUGER，等人.Macrophagecolony-stimulating factor-lreceptor expression is associated with poor outcomein breast cancer by large cohort tissue microarray analysis. Clinical cancerresearch. 2004,第 10卷，第 I 期，第 173-7 页.；SCHOLLj 等人· Anti-colony-stimulatingfactor-lantibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates withmarked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the NationalCancer Institute. 1994，第86卷，第2期，第120-6页.)。在卵巢上皮癌中，大部分的原发性和转移肿瘤强烈地表达CSF-IR并且转移肿瘤往往共表达CSF-I和CSF-1R。CSF-IR也由肿瘤浸润性巨嗷细胞表达(CHAMBERS，等人· Overexpression of epithelial macrophagecolony-stimulating factor (CSF-I) and CSF-IReceptor: a poor prognostic factor inepithelial ovarian cancer, contrasted with a protective effect of stromal CSF-1.Clinical Cancer Research. 1997，第 3 卷，第 6 期，第 999-1007 页·)。在卵巢癌和子宫内膜癌中，RNA印迹分析显示绝大部分的肿瘤共表达CSF-I和CSF-1R，而仅在正常子宫内膜组织样品内微弱地检测到CSF-1R(BAI0CCHI，等人· Expression of the macrophagecolony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies.Cancer. 1991，第67卷，第4期，第990-6页.)。在子宫颈癌中，与正常子宫内膜相比，CSF-1R表达在肿瘤基质和肿瘤上皮中均上调(KIRMA，等人.Elevated expression of theoncogene c-fms and its ligand，the macrophage colony-stimulating factor-1, incervical cancer and the role of transforming growth factor—betal in inducingc-fms expression. Cancer res. —2007，第 67 卷，第 5 期，第 1918-26 页·)。在肾癌中，表达高水平CSF-IR的肿瘤相关性巨噬细胞的浸润与肿瘤进展相关(HEMMERLEIN，等人.Expression of acute and late-stage inflammatory antigens, c-fms, CSF-Ij andhuman monocytic serine esterase 1，in tumor-associated macrophages of renal cellcarcinomas. Cancer immunology, immunotherapy. 2000，第 49 卷，第 9 期，第 485-92页.)。CSF-IR由接近100%的前列腺上皮内瘤形成或癌样品表达(IDE,等人.Expressionof colony-stimulating factor lreceptor during prostate development and prostatecancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002，第 99 卷，第 22 期，第 14404-9页.)。也已经在急性成髓细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞白血病中检测到CSF-IR表达(RAMBALDI,等人.Expression of the macrophage colony-stimulating factor andc-fms genes in human acute myeloblasts leukemia cells.Journal of ClinicalInvestigation. 1988，第 81 卷，第 4 期，第 1030-5 页·)。
免疫组织化学和原位杂交所取得的结果已经展示CSF-I在侵入性乳腺癌细胞中表达的特异性，同时未在管内(intra-canal)或非侵入性肿瘤细胞中观察到此类产生(SCH0LL,等人·Anti-colony-stimulating factor-lantibody staining in primarybreast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltratesand prognosis. Journal of the National Cancer Institute.1994，第 86 卷，第 2期，第 120-6 页.；TANG，等人.M-CSF(monocyte colony stimulating factor)andM-CSF receptor expression—by breast tumour cells:—M-CSF mediated recruitmentof tumour infiltrating monocytes . Journal of cellular biochemistry. 1992,第50卷，第4期，第350-6页.)。侵入性肿瘤细胞产生CSF-I与患者血浆中CSF-I的浓度升高相关，其中与正常受试者中低于300pg/ml相比，它可以超过1000pg/ml。高血清浓度与疾病的晚期状态和不良的短期预后相关(SCH0LL，等人.Circulating levelsof colony-stimulating factor las a prognostic indicator in 82patients withepithelial ovarian cancer. British journal of cancer. 1994,第 69 卷，第 2 期，第342-6页；SCHOLL Circulating levels of the macrophage colony stimulating factorCSF-Iin primary and metastatic breast cancer patients. Breast cancer researchand treatment. 1996，第39卷，第3期，第275-83页·)。另外，已经显示CSF-1剌激肿瘤细胞的运动性和侵入性(D0RSCH，等人· Macrophage colony-stimulating factorgene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumorsuppression. European Journal of immunology. 1993，第 23 卷，第 I 期，第 186-90页.；WANGj 等人.Induction of monocyte migration by recombinant macrophagecolony-stimulating factor. Journal of immunology.1988，第 141 卷，第 2 期，第575-9 页· ；FILDERMAN，等人· Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) enhancesinvasiveness in CSF-IReceptor-positive carcinoma cell lines.Cancer res. _1992,第52卷，第13期，第3661-6页.)。CSF-I也对骨髓细胞系的前体具有趋化作用，这促进单核细胞在肿瘤中浸润。然而，这些单核细胞的存在不足以观察到肿瘤被免疫系统破坏(D0RSCH，等人.Macrophagecolony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophageinfiltration but not tumor suppression.European Journal of immunology. 1993，第23卷，第I期，第186-90页.)。似乎在患有乳腺、卵巢或胰腺肿瘤的患者中通常所观察到的高血清含量上，CSF-I指导这些单核细胞分化成巨噬细胞并且不分化成能够提呈肿瘤抗原并因而启动针对肿瘤细胞的有效细胞毒性免疫应答的树突细胞(SCHOLL. Circulatinglevels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1in primary andmetastatic breast cancer patients. Breast cancer research and treatment. 1996,第39 卷，第 3 期，第 275-83 页· ；BARON,等人· Modulation of MHC class II transportand lysosome distribution by macrophage—colony stimulating factor in humandendritic cells derived from monocytes. Journal of cell science. 2001,第 114卷，第 pt5 期，第 999-1010 页.)。CSF-I对破骨细胞的增生和分化也是必需的(CECCHINI，等人.Role of CSF-Iinbone and bone marrow development. Molecular reproduction and development. 1997,第46卷，第I期，第75-83页.)。破骨细胞是从造血前体细胞(hematopoieticprecursor)衍生的表达CSF-1R的多核细胞，它们主要负责骨发育、稳态和修复期间降解矿化骨。在多种骨骼疾病如骨质疏松症、恶性高血钙症、类风湿性关节炎、肿瘤转移和Paget病中，破骨细胞的骨吸收超过成骨细胞的骨形成,从而导致骨量下降、骨骼脆弱和骨折(BRUZZANITI,等人.Molecular regulation of osteoclast activity. Reviews in
endocrine. 2006，第7卷，第1_2期，第123-39页)。例如，患有晚期乳腺癌的患者经常发生骨转移。骨转移导致顽固疼痛和骨折高风险，原因在于肿瘤推动的骨丢失(骨质溶解)，其中骨丢失因提高的破骨细胞活性所致(CICEK,等人· reast cancer bone metastasisand current small therapeutics). Cancer metastasis reviews. 2006,第 25 卷，第4期，第635-44页.)。已经显示骨质溶解与高水平的循环性CSF-I有关(KITAURA，等A · M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.The journal of clinicalinvestigation. 2005,第 115 卷，第 12 期，第 3418-27 页)。·CSF-I途径也参与介导疾病如炎性肠疾病中的肠道炎症(MARSHALL，等人.CSF-I)导致抑制 DSS 诱导的结肠炎(Blockade of colony stimulating factor-1 (CSF-I) leadsto inhibition of DSS-induced colitis. Inflammatory bowel diseases. 2007,第 13卷，第2期，第219-24页.)、参与介导急性同种异体移植物排异反应期间的巨噬细胞增生(J0SE,等人.Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophageproliferation and accumulation in renal allograft rejection. American journal oftransplantation. 2003,第3卷，第3期，第294-300页·)，并参与受感染巨卩遼细胞中的HIV-1 复制(KUTZA,等人· Macrophage colony-stimulating factor antagonists inhibitreplication of HIV-Iin human macrophages. Journal of immunology. 2000 卷，第 164期，第 4955-4960 页·)。出于这些原因，已经提出通过多种化合物抑制CSF-I活性用于治疗癌症和骨降解。
背景技术：
WO 01/30381涉及CSF-I活性的抑制物在产生治疗肿瘤疾病的药物中的用途。两种所提出用于抑制CSF-I活性的方法是抑制CSF-I活性本身和抑制CSF-IR的活性。优选针对CSF-I或其受体的中和抗体作为CSF-I活性的抑制物。WO 03/059395描述了用于治疗癌症的组合产品，其包含能够抑制CSF-I活性的物质和具有细胞毒活性的物质。WO 2005/068503公开了通过施用针对CSF-I的抗体至受试者用于预防和治疗骨质溶解、癌转移和与癌转移有关骨丢失的方法。EP 1488792A涉及通过有效抑制CSF-IR酪氨酸激酶活性显示出选择性抑制分化、增殖或介体释放的单环和/或双环芳基或杂芳基喹唑啉化合物的用途。该申请也涉及此类化合物用于制造抑制异常细胞增殖的药物的用途。US 2005059113涉及与CSF-1特异性结合的抗体及其抗原结合部分。该发明也涉及人抗CSF-I抗体及其抗原结合部分。该申请发明也提供使用核酸分子的基因治疗方法，其中所述的核酸分子编码包含人抗CSF-I抗体的重和/或轻免疫球蛋白分子。发明公开本发明涉及与CSF-IR特异性结合的抗体。 如整个申请书范围内通篇范围所用，术语“a”和“an”以如此含义使用，它们意指“至少一个”、“至少头一个”、“一个或多个”或“多个”所指的组分或步骤，除非上下文清楚地指出相反。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。无论在本文中何处使用，术语“和/或”包括“和”、“或”和“由该术语连接的要素的全部或任何其他组合”的意思。如本文中所用的术语“约”或“大约”意指在给定值或区间的20%范围内，优选10%范围内并且更优选5%范围内。如本文中所用，术语“含有”和“包含”意指药盒、产物、组合物和方法包括所指的组分或步骤，但不排除其他组分或步骤。当用来定义产物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应当排除有任何实质意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所提及组分组成的组合物不会排除痕量杂质和可药用载体。“由……组成”应当意指排除超过痕量要素之外的其他组分或步骤。如本文中所用，术语“与……特异性结合”指在蛋白质和其他生物学物质异质群体存在下确定靶蛋白存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，本发明抗体偏好地与CSF-IR的至少部分结合并且不以明显的量与试验样品中存在的其它组分结合。本发明抗体与CSF-IR靶之间的特异性结合意指结合亲和力是至少IO3M'并且优选地是IO5M-1UO6M'IO7M'IO8M'IO9IT1 或 IOiciM'如本文中所用，术语"CSF-1R"指人CSFl受体。人CSF-I受体已经被测序并且其氨基酸序列如SEQ ID N0:29中所述。如本文中所用，〃抗体〃或〃Ab〃以最广泛的含义使用。因此，〃抗体〃或〃Ab〃可以是天然存在的或人造的，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(HlAbs)和/或其功能片段。本发明抗体意图包括完整免疫球蛋白分子，例如多克隆抗体、单克隆抗体(HlAb)、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、动物抗体(例如骆驼抗体)、嵌合抗体以及(由任意已知技术(如但不限于酶切割、肽合成或重组技术)提供的)部分、片段、区域、肽及其衍生物，例如没有轻链的免疫球蛋白(见例如US6，005, 079)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体片段、双抗体、Fd、CDR区或抗体的能够结合抗原或表位的任意部分或肽序列。如果某抗体能够特异性地与某分子反应从而使此分子与该抗体结合，则该抗体〃能够结合〃此分子。抗体片段或部分可以缺少完整抗体的Fe片段，更迅速地从循环中清除，并且可以比完整抗体具有更少的非特异性组织结合作用。可以使用本领域熟知的方法，例如通过用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)的蛋白酶切法，从完整抗体产生抗体的例子。例如，见Wahl等人，24J. Nucl. Med. 316-25 (1983)。抗体的部分可以通过以上任意方法产生或可以通过表达重组分子的一部分产生。例如，可以将重组抗体的⑶R区分离并亚克隆入适宜的表达载体。如本文中所用，术语〃可变区〃指轻链(VL)或重链(VH)的含有结合识别特异性决定簇的可变区或结构域。可变结构域参与抗原识别并形成抗原结合位点。如本文中所用，术语"构架区"指轻链和重链可变区的在相同物种中不同抗体之间至少85%同源(即除CDR之外)的部分。如本文中所用，术语“同源的”指两条多肽的氨基酸的比较，其中通过使用 Smith-Waterman 算法(SMITH,等人· Identification of common molecularsubsequences. Journal of Molecular Biology. 1981,第 I47 期，第 I95-7 页·)比对时，所述多肽大致具有指定百分数的相同氨基酸。例如，“85%同源”指比较两条多肽的氨基酸，其中所述多肽在最佳比对时具有85%的氨基酸同一'丨生。如Kabat数据库(Kabat等人,任选引用)中所定义，重链和轻链的可变区均划分成包含被三段高变序列或互补决定区(CDR)隔断的4个构架亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的区段，CDRl位于FRl和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间并且CDR3位于FR3和FR4之间。在不规定具体亚区域为FR1、FR2、FR3 或FR4的情况下，如其他人所称的构架区代表在单条天然存在免疫球蛋白链的可变区范围内的联合FR。如本文中所用，FR代表四个亚区域之一，并且FR’代表构成构架区的四个亚区域的两个或多个亚区域。不同轻链或重链的构架区的序列在一个物种内部是相对保守的。抗体的构架区是组成性轻链和重链的联合构架区并且起到定位和比对CDR的作用。CDR主要负责形成抗体的结合位点，该结合位点赋予针对抗原表位的结合特异性和亲和力。在提供抗原结合区的H或L链可变区内部是称作“高变区”的更小序列，原因是特异性相异的抗体之间的极端差异性。此类高变区也称作“互补决定区”或“⑶R”区。这些⑶R区构成抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。CDR代表可变区内部的不连续氨基酸段，但是无论物种是什么，已经发现这些关键氨基酸序列在可变重链区和轻链区内部的位置具有在可变链的氨基酸序列内部相似的位置。全部抗体的可变重链和轻链对于各自轻(L)和重⑶链而言均具有3个⑶R区，每一⑶R区与其余⑶R区是不连续的(称作LI、L2、L3、Hl、H2、H3)。所接受的 CDR 区已经由 Kabat 等人，252J. Biol. Chem. 6609-16(1977)描述，并且CDR环可以通过检验线性氨基酸序列期间应用这些规则进行鉴定。然而，用于定义CDR-H3 环的规则可以不同(见第 4 章,Antibody Engineering:Methods & Protocols) (Lo编著.Humana Press, Totowa, NJ, 2004),并且在没有实验技术如圆二色性法、核磁共振或X射线晶体分析法的情况下，可能无法鉴定一些⑶R-H3环的实际边界。在全部哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即高度保守)区和可变区，并且在可变区内部，存在CDR和由重链或轻链可变区内部但⑶R之外的氨基酸序列构成的所谓“构架区”。⑶R区也可以使用Chothia命名法(CH0THIA 和 LESK. Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins (1987). J Mol Biol. 1987 年 8 月 20 日；196 (4) : 901-17.)定义。因此，在某些实施方案中，⑶R是Kabat定义的⑶R，并且在其他实施方案，⑶R是Chothia定义的CDR0谈到抗体的CDR区所识别的抗原决定簇时，这也称作“表位”。换句话说，表位指任何分子的能够被抗体识别并结合的那个部分(相应的抗体结合区可以称作互补位)。通常，表位由分子化学活跃的表面基团例如氨基酸或糖侧链组成并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
]如本文中所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指从单个克隆得到的抗体。使用杂交瘤技术可制备单克隆抗体，如HARLOW. Antibodies:A Laboratory manual.第2版.ColdSpring Harbor: Laboratory press, 1988.和 HAMMERLING,等人· Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas. New York:Elsevier, 1981.第 563-681 页中公开的那些杂交瘤技术。如本文中所用，术语“人抗体”指具有衍生自或极为匹配人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。因而，如本文中所用，术语“人抗体”指这样的抗体，其中该蛋白质的基本上每个部分与人种系抗体基本相似。“基本相似”指这样的抗体，其具有与人种系抗体的核酸序列至少80%、优选85%、更优选90%并且甚至更优选95%同源的核酸序列。如本文中所用，术语“Fab”指包括重链和轻链的可变区并显示结合活性的抗体分子区域。“Fab”包括一条重链和一条轻链的聚集物(通常称作Fab)，无论任何上述链是否、共价或非共价聚集，只要该聚集物能够与特定抗原或抗原家族选择性反应。Fab片段是包含VL和第二多肽的异二聚体，其中所述第二多肽包含VH和CHl结构域。在优选的实施方案中，抗体是Fab’片段。Fab’片段异于Fab片段之处在于Fab’片段在重链CHl结构域羧基末端含有几个残基，包括抗体“铰链区”的一个或多个半胱氨酸。“F (ab ’)2 ”指通过胃蛋白酶处理抗体获得的抗体片段或指通过其他技术如重组技术获得的等同蛋白质。F(ab’)2片段具有两个抗原组合位点并仍能够交联抗原。“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由处于紧密、非共价缔合状态的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。每个可变结构域的三个⑶R正是以这种构型相互作用以定义VH VL 二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这6个⑶R赋予抗原结合特异性至抗体。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合位点更低的亲和力进行。“单链？￥”或“80 ￥”包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链内。优选地，scFv还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头,所述多肽接头能够使scFv形成对抗原结合作用所需的结构(LENNARD. Standard protocols for the constructionof scFv libraries. Methods in molecular biology. 2002,第 178 期,第 59-71 页·)。如本文中所用，术语“抗体片段”指抗体的能够与CSF-IR特异性结合的一个或多个片段。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(VH VL)中轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不能允许相同链上两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补性结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双抗体可以与一个或多于一个表位结合。双抗体更充分地在 P0LJAK. Production and structure of diabodies. Structure. 1994,第 2卷，第 12 期，第 1121-3 页·，HUDSON,等人· High avidity scFv multimers; diabodiesand triabodies. Journal of immunological methods. 1999,第 231 卷,第 1-2 期,第177-89 页·和 KIPRIYANOV. Generation of bispecific and tandem diabodies. Methodsin molecular biology. 2002 卷,第 178 期,第 317-31 页中描述。已经开发多种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过蛋白酶解消化完整抗体得到。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均可以在大肠杆菌(E. coil)中表达并从中分泌出来，因而允许大量生产这些片段。用于产生抗体片段的技术将是本领域技术人员显而易见的。在其他实施方案，选择的抗体是单链Fv片段(scFv) ο如本文中所用的“结构域抗体”(dAbs)由抗体的最小功能性结合单位组成，其对应于抗体的重(VH)链或轻(VL)链的可变区。结构域抗体具有大约13kDa或小于完整抗体十分之一大小的分子量。如本文中所用，“Fd”指由VH和CHl结构域组成的抗体片段。术语“抗体”或“Ab”也指本领域技术人员熟知的其他抗体片段，例如在H0LLIGER， 等人.Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Naturebiotechnology. 2005,第 23 卷，第9期，第 1126-36 页·和 H00GENB00M,等人.Natural anddesigner binding sites made by phage display technology. Immunology today. 2000，第21卷，第8期，第371-8页中描述的抗体片段。根据一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含⑴至少一个⑶R，其中所述⑶R包含始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列的、始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列的或始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列的至少5个连续氨基酸；或，(ii)至少一个⑶R，其中所述⑶R包含始于SEQ ID NO: 4第44位置并终于第56位置的序列的、始于SEQ ID NO: 4第66位置并终于第76位置的序列的或始于SEQ ID NO: 4第109位置并终于第117位置的序列的至少5个连续氨基酸。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含至少一个⑶R，其中所述CDR彼此独立地在包含以下序列的至少5个连续氨基酸的CDR组中选择始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列或始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含2、3、4或5个并且甚至更优选6个CDR，其中所述CDR彼此独立地在包含以下序列的至少5个连续氨基酸的⑶R组中选择始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列
或始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(iii) 2个并且甚至更优选3个⑶R，其中所述⑶R彼此独立地在包含以下序列的至少5个连续氨基酸的⑶R组中选择始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，或 (iv) 2个并且甚至更优选3个⑶R，其中所述⑶R彼此独立地在包含以下序列的至少5个连续氨基酸的⑶R组中选择始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列或始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)彼此独立地选自如以下序列中所述⑶R的组中的至少一个⑶R 始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列和始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列；或(ii)彼此独立地选自如以下序列中所述⑶R的组中的至少一个⑶R 始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列和始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含彼此独立地选自如以下序列中所述⑶R的组中的至少一个CDR 始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列和始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含彼此独立地选自如以下序列中所述⑶R的组中的2、3、4或5个并且甚至更优选6个⑶R :始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列和始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含
(iv) 2个并且甚至更优选3个⑶R，其中所述⑶R彼此独立地在如以下序列中所述⑶R的组中选择始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列，始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列，或(iv) 2个并且甚至更优选3个⑶R，其中所述⑶R彼此独立地在如以下序列中所述⑶R的组中选择始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，
始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列，始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID NOs: 11、12或13任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R或(ii)含有如SEQ IDNOs: 14、15 ;或16任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ IDNOs: 11、12、13、14、15或16任一个中所述氨基酸序列的至少一个CDR。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ IDNOs: 11、12、13、14、15或16任一个中所述氨基酸序列的2、3、4或5个并且甚至更优选6个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)如SEQ IDNOs: 11、12或13任一个中所述的至少一个CDR ;或(ii)在SEQID NOs: 14、15或16任一个中所述的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了如SEQ IDNOsilU 12、13、14、15或16任一个中所述的至少一个CDR。根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含如SEQ IDNOs: 11、12、13、14、15或16任一个中所述的2、3、4、5个并且甚至更优选6个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID NOs: 17、18或19任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R ;或(ii)含有如SEQ IDN0s:20、21或22任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ IDNOs: 17、18、19、20、21或22任一个中所述氨基酸序列的至少一个CDR。根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ ID勵8:17、18、19、20、21或22任一个中所述氨基酸序列的2、3、4、5个并且甚至更优选6 个 CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)如SEQ IDNOs: 17、18或19任一个中所述的至少一个CDR;或(ii)如SEQID NOs: 20、21或22任一个中所述的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了在SEQ IDN0s:17、18、19、20、21或22任一个中所述氨基酸序列的至少一个CDR。
根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含如SEQ IDNOs: 17、18、19、20、21或22任一个中所述的2、3、4、5个并且甚至更优选6个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID N0s:23、24或25任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R或(ii)含有如SEQ IDNOs: 26、27或28任一个中所述氨基酸序列的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ IDNOs: 23、24、25、26、27或28任一个中所述氨基酸序列的至少一个CDR。根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了含有如SEQ ID N0s:23、24、25、26、27或28任一个中所述氨基酸序列的2、3、4、5个并且甚至更优选6 个 CDR。
根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)如SEQ IDNOs: 23、24或25任一个中所述的至少一个CDR;或(ii)如SEQID NOs: 26、27或28任一个中所述的至少一个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了如SEQ IDN0s:23、24、25、26、27或28任一个中所述的至少一个CDR。根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含如SEQ IDN0s:23、24、25、26、27或28任一个中所述的2、3、4、5个并且甚至更优选6个CDR。根据一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如以下序列中所述的CDR 始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列和始于SEQ ID N0:2第117位置并终于第126位置的序列。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如以下序列中所述的⑶R 始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列和始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述的3个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述的3个⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含SEQ ID NOs: 17、18和19中所述的3个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID N0s:20、21和22中所述的3个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID N0s:23、24和25中所述的3个CDR。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID N0s:26、27和28中所述的3个CDR。
在优选的实施方案中，所述的可变区还包含I个、更优选地2个、甚至更优选地3个并且明确优选地4个构架区，并且更优选地是人FR。如本文中所用，“人FR”是与天然存在的人抗体的构架区至少75%同源的构架区。根据一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中该可变区包含如SEQ ID NOs:6中所述的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中该可变区如SEQ ID N0s:6中所述。在另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中该可变区包含如SEQ ID NOs:9中所述的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方案中，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含可变区，其中该可变区如SEQ ID N0s:9中所述。在另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含两个可变区，其中所述可变区彼此独立地在以下可变区的组中选择(i)包含如以下序列中所述⑶R的可变区始于SEQ ID NO: 2第45位置并终于第54位置的序列，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列和始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列；(ii)包含如以下序列中所述⑶R的可变区始于SEQ ID NO:4第44位置并终于第56位置的序列，始于SEQ ID NO:4第66位置并终于第76位置的序列和始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列；(ii)包含在SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个CDR的可变区；(iii)包含在SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个CDR的可变区；(iv)包含在SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个CDR的可变区；(V)包含在SEQ ID NOs: 20、21和22中所述3个CDR的可变区；(vi)包含在SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个CDR的可变区；和(vii)包含在SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)第一可变区，其中所述的可变区包含如始于SEQ ID NO:2第45位置并终于第54位置的序列中所述的⑶R，如始于SEQ ID NO: 2第66位置并终于第87位置的序列中所述的⑶R和如始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列中所述的⑶R ；和(i)第二可变区，其中所述的可变区包含如始于SEQ ID N0:4第44位置并终于第56位置的序列中所述的CDR，如始于SEQ ID N0:4第66位置并终于第76位置的序列中所述的CDR，和如始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列中所述的⑶R。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含⑴包含如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个CDR的可变区，和、
(ii)包含如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个CDR的可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含⑴包含如SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个CDR的可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 20、21和22中所述3个CDR的可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含⑴包含如SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个CDR的可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)如SEQ ID NOs: 6中所述的可变区和(ii)如SEQ ID NOs:9中所述的可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含⑴重链可变区，包含如始于SEQ ID N0:2第45位置并终于第54位置的序列中所述的CDR，如始于SEQ ID N0:2第66位置并终于第87位置的序列中所述的⑶R，和如始于SEQ ID N0:2第117位置并终于第126位置的序列中所述的⑶R ;和(ii)轻链可变区，包含如始于SEQ ID N0:4第44位置并终于第56位置的序列中所述的CDR，如始于SEQ ID N0:4第66位置并终于第76位置的序列中所述的⑶R，和如始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列中所述的⑶R。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个CDR的重链可变区和(ii)含有如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个⑶R的轻链可变区。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个CDR的重链可变区和(ii)含有如SEQ ID N0s:20、21和22中所述3个CDR的轻链可变区。根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含了(i)含有如SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个CDR的重链可变区和(ii)含有如SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的轻链可变区。根据优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含(i)如SEQ IDNO:6中所述的重链可变区和(ii)如SEQ ID NO:9中所述的轻链可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含⑴可变区，包含如始于SEQ ID NO:2第45位置并终于第54位置的序列中所述的CDR，始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列中所述的CDR，和始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列中所述的⑶R ；和⑴可变区，包含在始于SEQ ID N0:4第44位置并终于第56位置的序列中所述的⑶R，
在始于SEQ ID N0:4第66位置并终于第76位置的序列中所述的⑶R，和在始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列中所述的⑶R。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含⑴包含如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个CDR的可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个CDR的可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含
⑴包含如SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个CDR的可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 20、21和22中所述3个CDR的可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含⑴包含如SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个CDR的可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的可变区。根据更优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含(i)如SEQ ID NO:6中所述的可变区和(ii)如SEQ ID NO:9中所述的可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含(i)重链可变区，包含在始于SEQ ID NO:2第45位置并终于第54位置的序列中所述的CDR，在始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列中所述的CDR，和在始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列中所述的⑶R和(ii)轻链可变区，包含在始于SEQ ID N0:4第44位置并终于第56位置的序列中所述的CDR，在始于SEQ ID N0:4第66位置并终于第76位置的序列中所述的⑶R，和在始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列中所述的⑶R。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含(i)包含如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个⑶R的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个CDR的轻链可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含⑴包含如SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个⑶R的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 20、21和22中所述3个CDR的轻链可变区。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含
(i)包含如SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个CDR的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的轻链可变区。根据更优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且是scFv，其中所述scFv包含⑴如SEQ ID NO:6中所述的重链可变区和(ii)如SEQ ID NO:9中所述的轻链可变区。在甚至更优选的实施方案中，提供了 scFv，其中在如SEQ ID N0:6和9中所述的氨 基酸序列范围内(根据复I和复2)替换至少一个氨基酸。在明确优选的实施方案中，提供人抗体，其中在如SEQ ID N0:6和9中所述的氨基酸序列范围内(根据复I和复2)替换表I和复2中所述的全部氨基酸。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且包含如SEQID NO:2中所述的重链。根据另一个优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并且包含如SEQID NO:4中所述的轻链。根据更优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含如SEQ IDNO:2中所述的重链和如SEQ ID NO:4中所述的轻链。根据甚至更优选的实施方案，本发明的抗体与CSF-IR特异性结合并包含如SEQ IDNO:2中所述的两条重链和如SEQ ID N0:4中所述的两条轻链。这种具体抗体将在本申请通篇范围内命名为CXIIG6。根据另一个优选的实施方案，本发明涉及与CSF-IR特异性结合的人抗体，其包含⑴重链可变区，包含如始于SEQ ID NO:2第45位置并终于第54位置的序列中所述的CDR，如始于SEQ ID NO:2第66位置并终于第87位置的序列中所述的CDR，和如始于SEQ ID NO:2第117位置并终于第126位置的序列中所述的⑶R ；和(ii)轻链可变区，包含如始于SEQ ID N0:4第44位置并终于第56位置的序列中所述的CDR，如始于SEQ ID N0:4第66位置并终于第76位置的序列中所述的CDR，和如始于SEQ ID N0:4第109位置并终于第117位置的序列中所述的⑶R。根据另一个实施方案，本发明涉及与CSF-IR特异性结合的人抗体，其包含⑴包含如SEQ ID NOs: 11、12和13中所述3个⑶R的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 14、15和16中所述3个CDR的轻链可变区。根据另一个实施方案，本发明涉及与CSF-IR特异性结合的人抗体，其包含⑴包含如SEQ ID NOs: 17、18和19中所述3个⑶R的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 20、21和22中所述3个CDR的轻链可变区。根据另一个实施方案，本发明涉及与CSF-IR特异性结合的人抗体，其包含⑴包含如SEQ ID NOs: 23、24和25中所述3个⑶R的重链可变区，和(ii)包含如SEQ ID NOs: 26、27和28中所述3个CDR的轻链可变区。
根据优选的实施方案，本发明涉及与CSF-IR特异性结合的人抗体，其包含⑴在SEQ ID N0:6中所述的重链可变区和(ii)在SEQ ID N0:9中所述的轻链可变区。在更优选的实施方案中，提供人抗体，其中在如SEQ ID NO:6和9中所述的氨基酸
序列范围内(根据复I和复2)替换至少一个氨基酸。在甚至更优选的实施方案中，提供人
抗体，其中在如SEQ ID N0:6和9中所述的氨基酸序列范围内(根据复I和复2)替换复I
和复2中所述的全部氨基酸。表I
SEQ ID N0:6, 位置优选的替换
~3Q
~5V
~18L
~19R
W33Y
~S40A
~42G
~43K
~49G
~50R
~51T
~59T
~61E
~64A
~S79N
~V81L
~89K
权利要求
1.与CSF-IR特异性结合并且与人CSF-IR特异性结合的抗体，其包含含有在SEQIDNOs: 11、12和13中所述三个⑶R的可变区和含有在SEQ ID NOs: 14、15和16中所述三个⑶R的可变区。
2.根据权利要求I的抗体，其中所述的抗体选自包含多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、Fab、F (ab' )2、Fv、scFv、抗体片段、双抗体和Fd的组。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求I的抗体，其中所述抗体具有至少IO9IT1的结合亲和力。
5.权利要求I至4的抗体，其中所述抗体与辐射敏化剂、受体和/或细胞毒性剂缀合。
6.核酸序列,其编码权利要求I的抗体。
7.载体,其包含权利要求6的核酸序列。
8.药物组合物,其包含权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列或权利要求7的载体和可药用载体。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述的组合物还包含目的化合物。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述的目的化合物是治疗性化合物并且优选地是癌症治疗剂或用于治疗骨量减少的化合物。
11.权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列、权利要求7的载体、权利要求8或9的药物组合物在制备治疗与提高的破骨细胞活性相关的疾病的药物中的用途。
12.权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列、权利要求7的载体、权利要求8或9的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
13.权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列、权利要求7的载体、权利要求8或9的药物组合物在制备在患有转移癌的患者中预防或治疗骨转移癌的药物中的用途。
14.权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列、权利要求7的载体、权利要求8或9的药物组合物在制造用于治疗患有炎性肠病的患者的药物中的用途。
15.权利要求I的抗体、权利要求6的核酸序列、权利要求7的载体、权利要求8或9的药物组合物在制造用于治疗患有类风湿性关节炎的患者的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供对CSF-1R特异的抗体、包含所述抗体的组合物和使用此类组合物的治疗方法。
文档编号A61P29/00GK102702358SQ20121019549
公开日2012年10月3日 申请日期2009年3月11日 优先权日2008年3月14日
发明者B·格雷利耶, C·蒂乌德雷, H·埃热尔, M·盖斯特 申请人:特朗斯吉有限公司