专利名称：一种高分子量灵芝多糖及其检测方法
技术领域：
本发明涉及药用真菌领域，具体地说涉及一种高分子量灵芝多糖及其检测方法。
背景技术：
灵芝多糖是药用真菌灵芝中的主要药效成分之一，具有免疫调节和抗肿瘤、抗衰老、抗高血压等多种生物活性。灵芝中含有一种高分子量的灵芝多糖成份，分子量为IOOOkDa以上，该多糖可选择性地刺激B细胞和巨噬细胞，显著增强免疫球蛋白的产生，并
增强巨噬细胞的吞噬功能和刺激巨噬细胞产生细胞因子IL-I P和TNF-a的生成。这种多糖虽然在实验室可以通过复杂的分离纯化手段获得，但大规模的制备方法却没有报道。同时灵芝多糖的含量测定基本运用苯酚硫酸法，可以测定出总多糖的含量，并不能反映出其中活性多糖的含量，因此建立准确测定灵芝中具有生物活性的多糖对于灵芝质量评价的十分重要。
发明内容
本发明首先提供了一种高分子量灵芝多糖，该高分子量灵芝多糖是通过如下步骤制备得到的①水提醇沉；②纯化；③冷冻干燥；其中纯化包括超滤和阴离子树脂纯化；其中超滤为将水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50万的超滤膜进行超滤，得到分子量大于50万的灵芝多糖；其中阴离子树脂纯化为将分子量大于50万的灵芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose阴离子树脂,去除水洗脱部分，收集0_0. 5NaCL洗脱部分,用I万的超滤膜超滤脱盐。其中水提醇沉为将灵芝子实体中加水，在80-120°C下热提，水提液浓缩后再加乙醇沉淀；其中冷冻干燥为将纯化后的灵芝多糖先放置于-20°C冷冻2-4小时，然后置于-80°C冷冻5-7小时，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到灵芝高分子量多糖(GLIS)。本发明还提供了一种制备上述高分子灵芝多糖的方法，该方法包括如下步骤①水提醇沉；②纯化；③冷冻干燥；其中纯化包括50万超滤膜的超滤和DEAE-S印harose阴离子树脂柱的分离纯化。本发明还提供了一种检测上述高分子量多糖的方法，能够测定灵芝中活性多糖的含量，用于灵芝质量的评价，该方法包括如下步骤①标准品的制备权利要求I所述的高分子量灵芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl 500凝胶层析柱,收集第一个峰,浓缩干燥得到；②将待测样品进行HPLC测定；其中HPLC 的检测条件为，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流动相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱温35°C ;示差检测器。本发明使用的灵芝子实体为市售产品。本发明使用的超滤膜为高分子聚合卷式超滤膜，滤芯材质为聚砜PS、聚醚砜PES、聚偏氟乙烯PVDF，具体是购自上海弗立特实业有限公司的UF-3530超滤膜。 本发明使用的DEAE-Sepharose阴离子树脂购自GE公司。本发明提供的高分子量灵芝多糖，制备方法简便、适用于大规模生产，且多糖含量达到65%以上，并且该灵芝多糖的免疫活性显著提高，可刺激巨噬细胞生成一氧化氮(NO)。制备的标准品多糖含量大于90%，本发明运用高效液相法建立了高分子量灵芝多糖的含量测定方法，该检测方法准确，重现性好，为灵芝中活性多糖的含量提供了一种新的检测方法。
图I高分子量灵芝多糖标准品的HPLC图谱。图2实施例I制备得到的高分子量灵芝多糖的HPLC图谱。
具体实施例方式实施例I高分子量灵芝多糖的制备I.水提醇沉灵芝子实体5Kg加入10倍的水50L100。C加热I小时，过滤，残渣加入10倍水再100° C加热I小时，过滤，合并滤液160L，旋转蒸发仪浓缩至5L，加无水乙醇5L至50%的浓度，静置过夜，沉淀离心后去除上清。2.灵芝多糖的纯化沉淀加水溶解后，上截留值为50万的超滤膜进行超滤，获得大于50万的高分子量的灵芝多糖36g。3.进一步纯化和浓缩大于50万的灵芝多糖0. 5g加入装填50_X300_的装有的DEAE-Sepharose阴离子树脂柱(GE公司)中进行进一步分离纯化，收集0-0. 5NaCl洗脱部分，并进行超滤浓缩脱盐。4.冷冻干燥将超滤浓缩后多糖先放置于_20°C冷冻3小时，然后置于-80摄氏度冷冻6小时，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到高分子量灵芝多糖0. 253g。实施例2生物活性检测，所用的高分子量灵芝多糖为实施例I中制备得到的。I小鼠H22移植瘤模型的建立生长良好的H22腹水瘤小鼠(购自南京中医药大学)，无菌条件下抽取腹水，并用生理盐水稀释调整瘤细胞数为3 XlOVml的细胞悬液，用75%乙醇消毒实验BALB/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)右腋下皮肤，每只小鼠右腋皮下注射0.2ml H22腹水瘤细胞悬液(含瘤细胞6 X IO6)。2分组和给药30只BALB/c小鼠接种24小时后，随机分成3组给药模型组给予等量生理盐水、5-FU组20mg/kg、高分子量灵芝多糖25mg/kg+5-FU20mg/kg,每组10只。5-FU及灵芝高分子量多糖25mg/kg剂量均每日一次。各组均腹腔注射给药，持续8天。3指标测定给药期间，测定小鼠体重和摄食量，末次给药后24小时分离瘤块，称重，计算肿瘤生长抑制率，肿瘤抑制率(％ ) = (I-药物组平均瘤重/模型平均瘤重)X 100%。4统计方法所有实验数据均以I ±SD表示，采用单因素方差分析和t检验进行统计分析，P
<0. 05认为有统计学差异。5实验结果如表I所示，与模型组相比,5-FU组、5-FU+高分子量灵芝多糖组的肿瘤重量均极显著减轻(P<0.01)。与5-FU组相比，5-FU+高分子量灵芝多糖组的肿瘤重量显著减轻(P
<0. 05)。5-FU与高分子量灵芝多糖合用，肿瘤抑制率明显高于单用5-FU时，对化疗药物5-FU有明显的增效作用。表I高分子量灵芝多糖组对H22移植瘤小鼠瘤重的影响
权利要求
1.一种高分子量灵芝多糖，其特征在于该高分子量灵芝多糖是通过如下步骤制备得到的 ①水提醇沉； ②纯化； ③冷冻干燥； 其中纯化包括超滤和阴离子树脂纯化； 其中超滤为将水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50万的超滤膜进行超滤，得到分子量大于50万的灵芝多糖； 其中阴离子树脂纯化为将分子量大于50万的灵芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose阴离子树脂，去除水洗脱部分，收集0-0. 5NaCL洗脱部分，I万的超滤膜超滤脱盐。
2.本发明还提供了一种检测权利要求I所述高分子量多糖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤 ①标准品的制备权利要求I所述的高分子量灵芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl500凝胶层析柱，收集第一个峰，浓缩干燥得到； ②将待测样品进行HPLC测定； 其中 HPLC 的检测条件为，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流动相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱温35°C ;示差检测器。
全文摘要
本发明提供了一种高分子量灵芝多糖及其检测方法，该高分子量灵芝多糖是通过水提醇沉、纯化、冷冻干燥得到的。本发明的高分子量灵芝多糖，制备方法简便、适用于大规模生产，且多糖含量达到65%以上，可刺激巨噬细胞生成一氧化氮(NO)。
文档编号A61P35/00GK102718880SQ20121020970
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月23日 优先权日2012年6月23日
发明者刘艳芳, 周帅, 唐传红, 唐庆九, 张劲松, 张圣龙, 杨焱, 王晨光 申请人:上海市农业科学院, 上海百信生物科技有限公司