专利名称：壳聚糖作为免疫佐剂在制备小鼠过敏性哮喘模型中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及过敏性哮喘模型，尤其涉及壳聚糖作为免疫佐剂在制备小鼠过敏性哮喘模型中的用途。
背景技术：
支气管哮喘(哮喘)是临床常见病和多发病，近年来发病率呈上升趋势。哮喘是一种由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞參与的慢性气道变应性炎症性疾病，其主要表现是气道高反应性、可逆性气流受限及粘液高分泌，晚期还可出现气道重塑。其发病机制尚未完全阐明。目前认为，Th2细胞的过度活化导致了 Th2反应为主的免疫反应，Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多，最终导致嗜酸性粒细胞等炎症细胞在气道聚集，引起气道炎症。鉴于人体试验的局限性，目前对哮喘病因、发病机制及治疗等方面的研究很大程度上需要通过动物模型来进行，建立良好的支气管哮喘动物模型具有重要意义。哮喘小鼠模型的主要特征是气道反应性增高，气道以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润，气道粘性分泌物明显增多，血清IgE水平增高，支气管肺泡灌洗液中Th2细胞因子水平增高等。现有的较为成熟的哮喘小鼠模型有如下特点抗原系统致敏和局部激发相结合，致敏时需合用免疫佐剂，多采用腹腔注射、皮下注射或者两者结合，以单独腹腔注射最常见，激发采用雾化吸入、滴鼻甚至气管内滴注等方式，以雾化吸入最常用。国内外最常用的哮喘模型为以液态氢氧化铝凝胶为佐剂的鸡卵白蛋白(OVA)进行致敏构建小鼠哮喘模型，多采用腹腔注射致敏，能建立显著的嗜酸性气道炎症。氢氧化铝作为免疫佐剂辅助OVA抗原进行致敏的机制尚未完全阐明。目前认为，氢氧化铝佐剂主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用，将蛋白质和氢氧化铝混合注射，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。氢氧化铝凝胶对蛋白质分子具有很好的吸附作用，对促进抗原的吸收具有重要作用。大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对Th2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用，而对Thl介导的细胞免疫反应的作用较弱。因此，氢氧化铝凝胶作为常用的免疫佐剂用于哮喘模型的制备。但是该方法存在两个问题(I)进ロ的液态氢氧化铝凝胶价格昂贵，采用普通的氢氧化铝溶液作为佐剂效果差，气道嗜酸性炎症不明显；(2)以氢氧化铝凝胶为佐剂的OVA诱导的哮喘小鼠模型的气道反应性、气道炎性细胞因子增高不显著，且不稳定，时常会出现与正常小鼠无显著差异或者差异不显著，导致模型构建失败，影响治疗药物疗效评价。气道高反应性、气道炎性细胞因子增高是小鼠哮喘模型的重要特征，也是评价哮喘药物是否有效的关键性指标。因此，建立气道高反应性更显著更稳定、气道炎症更显著的哮喘小鼠模型对哮喘疾病的研究以及治疗哮喘药物的筛选均具有重要意义。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种壳聚糖作为免疫佐剂在制备、小鼠过敏性哮喘模型中的用途。本发明的目的是提供一种壳聚糖的用途，用于制备过敏性哮喘动物模型的免疫佐齐 。壳聚糖是ー种从甲壳类动物提取制备的生物可降解性多糖，是自然界唯一的带正电荷的碱性氨基阳离子多糖，无毒，无致突性，毒副作用小。壳聚糖具有以下三个优点。第一、壳聚糖促进机体对抗原的吸收、摄取和利用率。壳聚糖溶于弱酸水溶液后具有高粘性且带正电，可与带负电荷的大分子物质如抗原等蛋白质药物相互作用形成纳米微粒，可与细胞膜表面负电荷相互作用粘附在细胞表面，有利于抗原更有效地被细胞内吞，而且能保护抗原以及药物不被体内的酸、碱和蛋白酶所破坏，提高机体对抗原的摄取率和利用率。壳聚糖可以粘附至粘膜表面，有利于粘膜对抗原的吸收和摄取。第二、壳聚糖具有缓释抗原的作用。许多研究均发现壳聚糖包载蛋白药物体外可持续释放7天以上。我们的研究也发现壳聚糖纳米微粒包裹的OVA体外释放可持续6天以上。第三、壳聚糖具有很强的免疫刺激作用。国外有研究显示，壳聚糖刺激机体免疫的作用，如激活抗原呈递细胞，增强迟发性变态反应和细胞毒性T细胞反应。
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本发明的进ー步目的是提供应用壳聚糖为免疫佐剂制备的小鼠过敏性哮喘模型。本发明所述的小鼠过敏性哮喘模型按以下方法建立，所述方法包括以下步骤I)制备壳聚糖醋酸溶液；2)制备壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液；3)用壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液致敏小鼠；4)对小鼠进行一次或多次呼吸道蛋白溶液雾化吸入激发，得到过敏性哮喘模型。本发明实验中，所述的小鼠为BALB/c小鼠。本发明实验中，所述的壳聚糖醋酸溶液制备方法如下将壳聚糖溶于1%醋酸水溶液制备成浓度为I. 5mg/ml壳聚糖醋酸溶液，并用NaOH调节pH至5. 5-5. 7,0. 22 μ m膜过滤。本发明实验中，所述壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液通过以下步骤制备在旋涡振荡条件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中缓慢加入200 μ g/ml OVA水溶液，并继续缓慢加入2. Omg/ml三聚磷酸钠溶液,使壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比达到10 I。本发明实验中，所述OVA水溶液和所述三聚磷酸钠溶液均通过O. 22 μ m膜过滤。本发明实验中，所述致敏小鼠的方法为腹腔注射。本发明实验中，对小鼠进行三次呼吸道蛋白溶液空气压缩雾化吸入。本发明实验中，对小鼠进行呼吸道蛋白溶液雾化吸入毎次35分钟。本发明的优点在于(I)以壳聚糖为免疫佐剂制备小鼠哮喘模型在气道嗜酸性炎症、气道反应性和气道炎性细胞因子等各个方面均显著优于已有常用佐剂制备的哮喘模型。(2)壳聚糖价格低廉，来源丰富。因此，壳聚糖作为免疫佐剂用于哮喘模型的制备显著优于传统佐剂，能克服传统佐剂制备模型的气道反应性、气道炎性细胞因子不增高或者增高不显著的缺点，具有方法简单，成本低廉、重现性好等优点，适用于哮喘的发病机制、治疗药物筛选及作用机制等多方面的研究。
图I冗ι聚糖包裹OVA微权的权ィ5检测结果图2壳聚糖包裹OVA微粒的透射电镜3氢氧化铝凝胶包裹OVA微粒的粒径检测结果图4氢氧化铝凝胶包裹OVA微粒的透射电镜5不同免疫小鼠哮喘模型的肺组织病理
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。一、材料与方法I、建立由壳聚糖佐剂和鸡卵白蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型I)壳聚糖来自青岛海汇公司，分子量为10万道尔顿，脱こ酰度95%。将壳聚糖溶解于I %醋酸水溶液配制为浓度I. 5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用NaOH调节pH值为5. 5-5. 7，无菌O. 22 μ m膜过滤。在旋涡振荡条件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的壳聚糖溶液中缓慢加入200 μ g/ml OVA水溶液(无菌O. 22 μ m膜过滤)，静置约10分钟后，在旋涡振荡条件下继续缓慢加入2. Omg/ml三聚磷酸钠溶液(无菌O. 22 μ m膜过滤)使壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比达到10 1，維持振荡10-20分钟，静置I小时后可用于腹腔注射小鼠致敏。纳米粒度仪检测壳聚糖包裹的OVA的纳米粒径和Zeta电位，透射电镜观察壳聚糖包裹的OVA的形态。SPF级BALB/c雄性小鼠，5_6周，在第0、7、14天腹腔注射壳聚糖包裹的OVA溶液，剂量为200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空气压缩雾化器雾化吸入IOmg/ml OVA溶液(OVA溶于生理盐水)激发小鼠，每天35分钟。采用同样的处理方法，以不含 OVA的同样体积的壳聚糖纳米溶液腹腔注射致敏小鼠，以生理盐水雾化吸入激发小鼠，作为阴性对照。2、建立由氢氧化铝凝胶佐剂和鸡卵白蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型2)液态氢氧化铝凝胶来自美国Sigma公司。将OVA溶于生理盐水中，配制浓度为400 μ g/ml的溶液。将400 μ g/ml OVA溶液与氢氧化铝凝胶以I : 3比例混合，混匀后静置I小时后可用于腹腔注射小鼠致敏。纳米粒度仪检测吸附OVA氢氧化铝凝胶的粒径和Zeta电位，透射电镜观察氢氧化铝凝胶包裹的OVA的形态。SPF级BALB/c雄性小鼠，5_6周，在第0，7，14天腹腔注射与氢氧化铝凝胶混合的0VA，剂量为200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空气压缩雾化器雾化吸入
IOmg/ml OVA溶液(OVA溶于生理盐水)激发小鼠，每天35分钟。采用同样的处理方法，以不含OVA的同样体积的氢氧化铝凝胶溶液腹腔注射致敏小鼠，以生理盐水雾化吸入激发小鼠，作为阴性对照。3、建立由鸡卵白蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型(模型3)将OVA溶于生理盐水中，配制浓度为100 μ g/ml的溶液。混匀后静置I小时后可用于腹腔注射小鼠致敏。
SPF级BALB/c雄性小鼠，5-6周，在第O，7，14天腹腔注射OVA溶液，剂量为200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空气压缩雾化器雾化吸入10mg/ml OVA溶液(OVA溶于生理盐水)激发小鼠，每天35分钟。
以上三种模型均于最后一次激发48小时后，进行模型测试。ニ、指标测定I、气道反应性评价气道反应性包括以下两个方面I)与哮喘组相比可以显著降低气道反应性(P < O. 05)的激发浓度；2)气道反应性升高为基值2倍时的Mch激发浓度即PClOO，PClOO值越小，气道敏感性越高。最后一次激发后48小时，无创肺功能仪检测小鼠气道反应性。用Buxco小鼠无创肺功能仪检测气道阻力，结果以增强的呼吸间歇(Enhanced Pause,Penh)表示，通过こ酰甲胆碱(Methacholine, Mch)激发测定各浓度时的Penh值。Mch激发梯度浓度分别为3. 12、6. 25、12. 5、25、50、100mg/ml。以未吸入药物时所测Penh值为基值，将各个浓度Penh的百分比(Penh/baseline% ),作为气道反应性统计指标。2、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞所占比例腹腔注射麻醉小鼠后，切开气管，插管，PBS O. 8ml/次，灌洗3次，灌洗液回收率>80%。回收BALF，1500r/min离心lOmin，细胞沉淀用Iml PBS重悬，取少许滴于血细胞计数板，行细胞总数计数，算出姆毫升的细胞数。剩余细胞溶液，1500r/min离心IOmin,弃上清，用50μ1 PBS重悬细胞沉淀后涂片，晾干后行HE染色。油镜下进行细胞分类计数，计数600个细胞，计算嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞各占的百分比。3、肺组织病理检查取小鼠肺组织放入4%甲醛固定液中固定过夜。常规取材后，进行梯度酒精脱水，组织透明处理，浸蜡，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察肺组织炎性细胞浸润，水肿和气道上皮损伤情况。4、炎性指标:炎性指标为BALF上清细胞因子水平。取BALF上清液，采用ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平，ELISA试剂盒分别购自eBioscience公司和上海依科赛公司，按说明书操作。三、结果I、壳聚糖包裹0VA、氢氧化铝包裹OVA的粒径和Zeta电位检测、透射电镜观察如附图I和3所示，经纳米粒度仪检测，壳聚糖包裹OVA粒径大小为249. 9nm,多分散度为0. 175, Zeta电位为+22. lmV。氢氧化铝包裹OVA的粒径大小为4366nm，多分散度0. 091，Zeta电位为-13. 6mV。由以上结果可知，壳聚糖包裹OVA的粒径显著小于氢氧化铝包裹0VA。而且壳聚糖包裹OVA纳米粒带正电荷，可与细胞膜表面负电荷通过静电相互作用，有利于OVA被机体摄取和吸收。图2和图4所示透射电镜图可见壳聚糖包裹OVA粒径大小较均一、分布均匀，无明显凝聚现象，而且包裹OVA的壳聚糖微粒的中心染色更深，表明OVA被包裹在壳聚糖内部，而未包裹OVA的壳聚糖微粒粒径更小，微粒颜色均匀，无深染区。而氢氧化铝包裹OVA明显凝聚成团，导致粒径増大。2、气道反应性结果如表I所示，在所有こ酰甲胆碱(Mch)激发浓度下，以壳聚糖为佐剂的哮喘组气道反应性与两个对照组均有显著差异，而且增高倍数达到2-4倍，呈显著增高，而且在各个浓度亦显著高于以氢氧化铝为佐剂的哮喘组。而以氢氧化铝为佐剂的哮喘组仅在Mch浓度为6. 25和12. 5mg/ml时气道反应性显著高于自身相应对照组，而且增高倍数均小于2。如表2所示，PC100结果表明，以壳聚糖为佐剂的哮喘组在Mch吸入浓度为5. 14mg/ml时，气道反应性增高为基值的2倍，显著低于以氢氧化铝为佐剂和无佐剂的哮喘组，表明以壳聚糖为佐剂的哮喘组的气道敏感性显著高于另外两个哮喘组。而无佐剂哮喘组的气道反应性与对照组无差异。综合以上結果，以壳聚糖为佐剂的哮喘模型的气道反应性增高显著优于以氢氧化铝为佐剂和无佐剂的哮喘模型。表I各组在各浓度Mch (mg/ml)激发下的Penh/baseline (% )·
权利要求
1.壳聚糖作为免疫佐剂在制备小鼠过敏性哮喘模型中的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其中所述的过敏性哮喘模型按以下方法建立，所述方法包括以下步骤 1)制备壳聚糖醋酸溶液； 2)制备壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液； 3)用壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液致敏小鼠； 4)对小鼠进行一次或多次呼吸道蛋白溶液雾化吸入激发，制备过敏性哮喘模型。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的小鼠为BALB/c小鼠。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的壳聚糖醋酸溶液的浓度为I.5mg/ml，并用 NaOH 调节 pH 至 5. 5-5. 7。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖佐剂包裹的蛋白溶液通过以下步骤制备在旋润振荡条件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中缓慢加入200 u g/ml OVA水溶液，并继续缓慢加入2. Omg/ml三聚磷酸钠溶液，使壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比达到10 : I。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖醋酸溶液、OVA水溶液和所述三聚磷酸钠溶液均通过无菌0. 22 y m膜过滤。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述致敏小鼠的方法为腹腔注射。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，对小鼠进行三次呼吸道蛋白溶液空气压缩雾化吸入以激发小鼠。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，对小鼠进行呼吸道蛋白溶液雾化吸入每次35分钟。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及过敏性哮喘模型，尤其涉及壳聚糖作为免疫佐剂在制备小鼠过敏性哮喘模型中的用途。本发明对应用壳聚糖为免疫佐剂制备的小鼠过敏性哮喘模型进行了气道反应性、肺组织病理检查和炎症指标检验，结果显示，以壳聚糖为免疫佐剂制备小鼠过敏性哮喘模型在气道嗜酸性炎症、气道反应性和气道炎性细胞因子等各个方面均显著优于已有免疫佐剂制备的哮喘模型。且壳聚糖价格低廉，来源丰富，壳聚糖作为免疫佐剂的小鼠哮喘模型显著优于传统佐剂，具有方法简单，成本低廉、重现性好等优点。
文档编号A61K39/39GK102727887SQ20121024125
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者卓文磊, 张巧, 林科雄, 毕玉田, 王彦, 王长征 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院