一种广谱抗菌肽的制备方法

专利名称：一种广谱抗菌肽的制备方法
技术领域：
本发明为一种桥石短芽孢杆菌X23外泌新型非核糖体抗菌肽Tyrocidine T及其发酵制备，属于微生物发酵和生物分离领域，本发明涉及新型非核糖体抗菌肽TyrocidineT的微生物发酵、分离鉴定及其在农业生产中的应用。
背景技术：
桥石短芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，菌体呈短杆状，细胞壁厚，广泛分布于自然界。公开号为CN 的中国专利公开了一种桥石短芽孢杆菌X23及其应用，该菌对茄科作物青枯病菌的抑制能力强。除此之外，还对多种病原真菌和病原细菌具有拮抗作用。本发明通过大量的实验证明桥石短芽孢杆菌X23菌株能够有效地抑制茄科作物青枯病菌的生长；此外，对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌也具有明显的拮抗作用。该菌在生长过程中可以向外界分泌种类丰富、数量可观的蛋白质和NRPs等次 生代谢产物。NRPs 由非核糖体妝合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)催化合成。NRPSs是由多个酶按模块化(module)组成的大的复合体，每个酶含一个或多个模块，每个模块激活一个特定的氨基酸并将其整合到新生的肽链中。典型的模块由腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)等三个核心结构域组成，模块的数量、排列顺序和方向与其产物的氨基酸数量、排列顺序和方向之间存在严格的共线性关系，如短杆菌酪肽(tyrocidine)等。此后还发现了另外2种合成NRPs的方式iterative NRPSs 和 nonlinear NRPSs0 Iterative NRPSs 是指同一个模块或结构域在妝链合成过程中不止一次地往新生肽链上重复激活和添加某个氨基酸，导致肽链由多个小的重复序列组成；Nonlinear NRPSs方式合成的肽链顺序与其合成酶的模块之间并不存在严格的共线性关系。在NRPSs的最后一个模块的C-末端通常有起终止延伸和释放产物功能的硫酯(thioesterase, TE)结构域。除了上述核心结构域，在同一个模块内可能还存在一些附加的结构域，如差向异构结构域(E结构域)和甲基化结构域(M结构域)等，它们在肽链合成过程中对氨基酸底物进行修饰；乙酰化、糖基化和脂质化等结构域则对肽链骨架进行修饰。如果不具有这些结构域，修饰作用则由独立于NRPSs的酶催化完成。NRPs在医药、农业和生物学等领域具有极大的研究价值和应用潜力，除了可以杀死或抑制病原菌，NRPs还被广泛用于抗肿瘤和抑制免疫反应等。目前临床应用最多的10种抗生素类产品中有8种为NRPs，在抗感染和抗肿瘤等领域的市场份额分别达到了 68. 3%和79.8%。NRPs也可以抑制或杀死作物病原微生物，在农业领域也具有良好的应用潜力。因此，新的NRPs的分离与鉴定是当前天然产物研究的热点领域之一。

发明内容
本发明涉及非核糖体抗菌肽tyrocidine T的分离纯化和鉴定的方法及其用途。本发明采用的微生物菌种，桥石短芽孢杆菌X23 (Brevibacillus choshinensisX23)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为=CGMCC NO 45340桥石短芽孢杆菌X23是一种能分泌对多种病原微生物具有抑制杀伤作用的非核糖体抗菌肽的根际微生物。这些非核糖体抗菌肽具有热稳定性高、耐受蛋白酶水解的能力强和不易诱导靶标微生物产生选择性抗性等特点。由于此类抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于其发酵液中，并且有环状结构和非编码氨基酸，可以耐受高温、蛋白酶和有机溶剂处理等严苛条件而不影响其结构稳定性及生物学活性。根据上述特点，优选本发明的分离、纯化及鉴定方法为(I)桥石短芽孢杆菌X23菌株的发酵培养将_80°C保存的桥石短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，28 200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液，将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，280C >200 rpm培养32h，得到X23的发酵液。 (2)无菌发酵液的制备X23发酵液经7，600 rpm离心，取上清液经孔径为O. 22 μ m的过滤器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)过滤，得到无菌发酵液。(3) X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液的制备取步骤(2)制备的无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩50倍后用氯仿抽提，11000 rpm离心10 min后收集上层水相，经80°C水浴IOmin后IlOOOrpm离心IOmin,水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液。氯仿和高温处理的目的是为了简化样品组成。(4)固相萃取分离为了进一步简化样品组成，并富集非核糖体抗菌肽，将经第(3)步处理的粗制备液经固相萃取处理。具体步骤为固相萃取法(SPE)富集非核糖体抗菌肽tyrocidine T选用华谱新创科技有限公司EMERALD产品，柱活化(见说明书)后将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，依次采用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脱，去除非活性组分，富集非核糖体抗菌肽。至此，样品被大大简化。(5)色谱分离利用亲水色谱法(HILIC,Bio-Amide, 150X4. 6 mm, i. d. 5 μ m)对非核糖抗菌肽粗提液制备分离，流动相为AO. 1%TFA乙腈，BO. 1%TFA溶液，梯度洗脱(0_60 min, 5-50%
A)，检测波长为254 nm。共获得16个分离组分(图I)，分别收集每个组分，冷冻真空干燥后与青枯病菌进行平板对峙试验，结果表明，第7、第8和第9三个样品组分在与青枯病菌的平皿对峙实验时表现出明显的抑菌圈(图2)，其中8号组分的抑菌圈大且明显，说明该组分抑制青枯病菌的效果最好；而第7号和第9号组分的抑菌圈小，且随着时间的延长，抑菌圈逐渐变小，直至模糊消失，说明第7号和第9号组分对青枯病菌的抑制效果弱于第8号样品O收集第7、第8两个分离组分，进一步优化分离条件，利用亲水色谱(HILIC，Bio-Amide, 150X10 mm, i. d. 5 μ m)进行非核糖体抗菌肽的制备分离(Bio-Amide,150X10 mm)，流动相为 A O. 1%TFA 乙腈，B O. 1%TFA 溶液，梯度洗脱(0-60 min, 5-50% A)，检测波长为254 nm。结果表明，7号和9号样品组成成份复杂，而8号峰为单一物质。(6)非核糖体抗菌肽tyrocidine T的鉴定收集8号样品,冷冻真空干燥后进行MALDI-T0F-T0F 和 MS/MS 串联质谱鉴定。MALDI-T0F-T0F 结果表明，tyrocidine T 的分子量为1270. 73(图3) ；MS/MS鉴定结果表明，非核糖体抗菌肽的一级结构为DPhe-PiO-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu (D型苯丙氨酸一脯氨酸一酪氨酸一D型苯丙氨酸一天冬酰胺一谷氨酰胺一酪氨酸一缬氨酸一鸟氨酸一亮氨酸，见图3)，生物信息学预测的分子结构如图4所示。在一个具体实施方案中，X23非核糖体抗菌肽在作物生产中用于抑制青枯病菌等多种病菌的用途。在一个具体实施方案中，其中步骤(4)中不同溶液进行洗脱是指先用3柱体积5%甲醇水溶液冲洗、2柱体积再用100%甲醇溶液冲洗、最后用4柱体积1%甲酸-99%甲醇溶液进行洗脱，其中1%甲酸-99%甲醇溶液中比例是指体积体积比。 四

图1-2为X23非核糖体抗菌肽的分离及活性检测图I :X23外泌抗菌肽粗制备液的亲水色谱分析，其中7-12为亲水色谱法制备分离的第7至第12号样品组分。图2:亲水色谱法制备的样品组分与青枯病菌GMI1000的平板对峙培养，其中PCK为X23的无菌发酵液。图3 X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T的质谱鉴定图4 X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T的分子结构
五具体实施例方式(一 )本发明新型非核糖体抗菌肽的微生物发酵和分离鉴定方法如下I.桥石短芽孢杆菌X23的发酵培养将_80°C保存的桥石短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，280C >200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液。将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，28°C、200rpm培养32h，得到X23的发酵液。X23发酵液经7，600 rpm离心，取上清液经孔径为O. 22 μ m的过滤器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)过滤，即为无菌发酵液。2.桥石短芽孢杆菌X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T的分离取上述无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩50倍后用等体积氯仿抽提，11，000 rpm离心10 min后收集上层水相，经80°C水浴IOmin后再11，OOOrpm离心lOmin，上层水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液。选用固相萃取法(SPE)富集非核糖体抗菌肽，柱活化(华谱新创科技有限公司EMERALD产品，操作参照厂家使用说明)后将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，依次采用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脱，去除非活性组分，富集非核糖体抗菌肽。收集固相萃取富集的1%甲酸-甲醇洗脱液，经冷冻真空干燥后用ddH20溶解，反相色谱分析发现活性组分具有较强的极性，在反相色谱柱(Bio-C18，150X4.6 mm)上保留较弱；基于此，随后采用亲水色谱法(HILIC)对该组分分别进行分析(Bio-Amide，150X4.6 mm)和制备(Bio-Amide, 150X10 mm),平板对峙实验发现第7、第8和第9号样品均表现出明显的抑菌活性(图2)，其中第8号组分的抑菌圈大且明显，说明该组分抑制青枯病菌的效果最好；而第7号和第9号样品组分的抑菌圈小，且随着时间的延长，抑菌圈逐渐变小，直至模糊消失，说明第7号和第9号组分对青枯病菌的抑制效果弱于第8号样品。3.桥石短芽孢杆菌X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T的分子量及结构鉴定收集8号样品，冷冻真空干燥后进行MALDI-T0F-T0F和MS/MS串联质谱鉴定。MALDI-T0F-T0F结果表明，tyrocidine T的分子量为1270.73 ;MS/MS鉴定结果表明，非核糖体抗菌肽的一级结构为DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn_Leu。数据库比对结果说明，该抗菌肽是已知tyrocidine类非核糖体抗菌肽的同系物,但第三个氨基酸残基为tyr,与其它tyrocidine均不相同，因此将其命名为tyrocidine T。(二)桥石短芽孢杆菌X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T的抑菌试验I.抑菌试验指示菌1.1细菌指示菌抑菌实验采用的指示细菌为农业生产中重要的病原菌和人类 及动物的机会主义致病菌。烟草青枯病菌(Ralstonia Solanacearum GMI1000)、大肠杆菌(Escherichia coli DH5 α )、大白菜软腐病菌(Erwinia carotovora)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ASl. 2465)。1.2真菌指示菌抑菌实验所采用的指示菌为农业生产中3种重要的病原菌，马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、烟草黑胚病菌(P. parasitica var.nicotianae)和水稻稻痕病菌(Magnaporthe grisea)。2.抗菌肽的抑菌试验2.1细菌抑菌试验方法将培养到对数生长期的各细菌用无菌LB培养基稀释至IO6 cfu/ml，取60 μ I加入20 ml冷却到50°C的固体LB培养基，充分振荡混匀后倒入培养皿。培养基完全冷却凝固后用打孔器打孔，每孔加入50 μ I浓度为10 μ g/ml的抗菌肽tyrocidine T，37°C培养20 h后记录抑菌圈大小。抑菌实验重复三次，抑菌圈直径取平均值(表I)。2. 2真菌抑菌试验方法将各真菌从斜面接种至新鲜的平皿，待菌丝进入旺盛生长期时切取O. 7 cmX0.7 cm的菌丝块，置于另一新鲜制备的平皿中央。于菌丝块两侧等距的地方用打孔器打孔，每孔加入50 μ I浓度为30 μ g/ml抗菌肽tyrocidine T。48 h后记录抑菌圈直径大小，实验重复三次，抑菌圈直径取平均值(表I)。马铃薯晚疫病菌和烟草黑胫病菌用黑麦培养基培养，培养温度分别为18°C和28°C ;水稻稻瘟病菌用PDA培养基培养，培养温度为28 °C。研究结果表明，抗菌肽对上述5种细菌和3种真菌均具有显著的抑菌作用。由于桥石短芽孢杆菌抗菌肽tyrocidine T对多种植物甚至动物的病原菌都具有明显的抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的杀菌制剂，用于植物和动物病原菌的控制，对于减少因病原菌危害造成的经济和生态损失具有重要的意义。表I桥石短芽孢杆菌X23非核糖体抗菌肽tyrocidine T对病原细菌和真菌的抑菌效果
权利要求
1.一种广谱抗菌肽的制备方法，其具体步骤包括 (1)桥石短芽孢杆菌X23菌株的发酵培养将-80°c保存的桥石短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，280C >200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液，将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，28°C,200 rpm培养32h，得到X23的发酵菌液； (2)无菌发酵液的制备X23发酵菌液经7，600rpm离心，取上清液经孔径为O. 22 μπι的过滤器(Mi IIipore公司，Cat. No. GPWP04700)过滤，得到无菌发酵液； (3)X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液的制备取步骤(2)制备的无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩50倍后用氯仿抽提，11000 rpm离心10 min后收集上层水相，经80°C水浴IOmin后IlOOOrpm离心lOmin，水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液； (4)固相萃取分离固相萃取法(SPE)富集非核糖体抗菌肽tyiOcidineT选用华谱新创科技有限公司EMERALD产品，柱活化后将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，依次采用不同溶液进行洗脱，去除非活性组分，富集非核糖体抗菌肽； (5)色谱分离X23外泌非核糖体抗菌肽tyiOcidineT的高效液相色谱分析(HPLC)洗脱液经冷冻真空干燥后用ddH20溶解，反相色谱分析发现活性组分具有较强的极性，在反相色谱柱(Bio_C18，150X4.6 mm，i. d. 5 μ m)上保留较弱；基于此，随后采用亲水色谱法(HILIC)对该组分分别进行分析(Bio-Amide, 150X4.6 mm, i. d. 5 μπι)和制备(Bio-Amide, 150 X 10 mm, i. d. 5 μ m)，流动相为 AO. 1%TFA 乙腈，BO. 1%TFA 溶液，梯度洗脱(0-60 min, 5-50% A)，检测波长为 254 nm ； (6)非核糖体抗菌肽tyrocidine T的鉴定选取有明显的抑菌活性的样品组分进行MALDI-TOF-TOF和MS/MS串联质谱鉴定，结果显示，tyrocidine T的分子量为1270. 73，其一级结构为 DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Ty:r-Val-0;rn-Leu。
2.根据权利要求I的方法，其中步骤(4)中依次采用不同溶液进行洗脱是指先用3柱体积5%甲醇水溶液冲洗、2柱体积再用100%甲醇溶液冲洗、最后用4柱体积1%甲酸-99%甲醇溶液进行洗脱。
全文摘要
本发明涉及一种广谱抗菌肽的制备方法，采用桥石短芽孢杆菌进行发酵，得到发酵液后离心，取上清液过滤，得到无菌发酵液，再经过固相萃取，亲水色谱分离，X23非核糖体抗菌肽经质谱鉴定。该方法操作简单，分离效率高，分离X23非核糖体抗菌肽的活性高。
文档编号A61P31/04GK102911988SQ20121029288
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者陈武, 周清明, 王运生, 肖启明, 黎定军, 曾静 申请人:湖南农业大学