专利名称：α干扰素融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种干扰素融合蛋白。
背景技术：
干扰素(IFN)是一类非常重要的细胞因子，它可以抵抗病毒感染，抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为三型1型包括IFN-a，-0，-e，-gj，-k等亚型；II型干扰素由单基因家族IFN-Y构成，又称为免疫干扰素；111型是一种新发现的细胞因子，称为IFN-X。其中IFN-a的 抗病毒活性最强，a干扰素(IFN-a )分子的不同亚型由165 172个氨基酸组成，分子量约在19kDa左右。随着基因工程技术的发展，IFN-a在上个世纪80年代就成为第一个用于临床的基因重组细胞因子，被美国FDA批准广泛应用于病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等多种疾病的临床治疗。但是干扰素由于其相对分子质量较小，在患者体内不稳定，易被肾小球过滤，易被血清蛋白酶降解，药物半衰期较短而治疗周期较长，因此需要频繁注射给药。目前人们对重组IFN-a的长效型改造主要集中在以下几个方面。首先最为常用的就是聚乙二醇修饰，FDA目前批准的PEG化干扰素为PEG-Intron和Pegasys，分别是PEG修饰的IFN- a 2b和IFN- a 2a，用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治疗。这两种药物的给药间隔为每周一次，半衰期也延长到50个小时左右，因而目前广泛的应用于临床治疗中。其次，就是融合表达重组IFN-a，人类基因科学公司和诺华公司将IFN-a与人血清白蛋白融合表达，合作开发出长效IFN- a 2b药物——ZALBIN,动物实验及临床实验表明，ZALBIN的半衰期比IFN-a 2b提高了 18倍左右，给药间隔也可以提高到2_4周一次。再次，对IFN-a进行定点突变，Nautilus公司的产品Belerofon就是将天然干扰素IFN-a的一个氨基酸突变，降低了其对血液和组织中蛋白酶的敏感性，进而延长了药物在体内的半衰期。同时，人们也开发出了一些缓释给药系统，Biolex公司和OctoPlus公司
合作开发一种产品-Locteron,用可生物降解得聚醚酯为载体制成的由水生植物表达
系统表达的重组IFN-a 2b的新型缓控释微球，在临床I期实验中检测到半衰期明显增长，几乎是 PEG-Intron 的两倍，(Bioconjugate Chem, 2008, 19(1) :299-305, BioconjugateChem,2007,18(1):61-76, JH epatol,2006,44(4) :671-678, Acta Pharm acolSin,2008，29(11):1370-1375，J Interferon Cytokine Res, 2008, 28(2):113-122, DrugTarget, 2008, 16(3):243-249, Adv Drug Deliv Rev,2002, 54(4):459-476, Biotechnol,2007，131 (3) :245-252，Pharm Res,2005，22(8):1374-1386)。虽然目前对干扰素的长效型改造方法挺多，也取得了不错的效果，但是也有一些弊端和限制。PEG修饰会产生产品不均一性，生物活性大幅下降，同时质量控制较难；人血清白蛋白由于分子量较大，直接连接导致生物活性下降，而且，安全性没有得到证实；缓释给药系统也存在包封率低，突释和释放不完全以及在制备过程强烈的物理、化学变化导致的IFN变性失活等问题。
利用融合蛋白基因工程重组来延长蛋白质药物的体内半衰期是目前常用的技术之一，其中以人IgG抗体的Fe片段融合蛋白技术最为成功，已经有数种Fe融合蛋白得到临床应用。人IgG抗体是由两条轻链和两条重链通过二硫键结合而形成的四聚体，IgG抗体经木瓜蛋白酶裂解后，形成两个Fab片段和一个Fe片段。Fe片段由相同的两条多肽链通过二硫键结合而成，每条多肽链的结构 分别由铰链区、CH2和CH3功能区组成。IgG抗体是血液中最为丰富的蛋白之一，占血清中免疫球蛋白的70-75%。IgG抗体在五种免疫球蛋白中体内半衰期最长，可达到21天。因此，Fe融合蛋白可以显著地延长体内半衰期，达到临床使用中长效化的目的。但Fe融合蛋白技术也存在着缺陷，一是Fe片段分子较大，常使其融合分子的生物学活性减低；二是Fe为糖基化分子，其重组表达需要在哺乳动物细胞中实现，从而导致其工艺复杂、生产成本过高、生产周期过长等弊端。噬菌体肽库技术发现一种十三个氨基酸的抗体结合肽(ABP，antibody-binding-peptide),该ABP肽在体内可以与抗体Fe片段特异性结合。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种a干扰素融合蛋白。本发明的第二个目的是提供一种a干扰素融合蛋白基因。本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体。本发明的第四个目的是提供一种含有重组表达载体的工程菌株。本发明的第五个目的是提供a干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物的应用。本发明的技术方案概述如下一种a干扰素融合蛋白，所述融合蛋白包括a干扰素和ABP，所述ABP为能与人IgG抗体Fe片段结合的小肽，所述a干扰素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. I所示或序列表SEQ ID NO. 2所示；所述ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. 3所示，所述a干扰素的的肽链C末端与ABP的N末端直接连接，或a干扰素的肽链C末端与ABP的肽链N末端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接,所述n为1-100。一种a干扰素融合蛋白的编码基因，由序列表SEQ ID NO. 4、序列表SEQ ID NO. 5、序列表SEQ ID NO. 6、序列表SEQ ID NO. 7、序列表SEQ ID NO. 8、序列表SEQ ID NO. 9、序列表SEQ ID NO. 10或序列表SEQ ID NO. 11所示。一种重组表达载体，是大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 4所不的a干扰素融合蛋白基因，用pYW-1表不；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ IDN0. 5所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_2表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 6所不的a干扰素融合蛋白基因,用pYW_3表不；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 7所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_4表示；或大肠杆菌表达载体PBV中包含了由序列表SEQ ID N0.8所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW-5表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 9所示的a干扰素融合蛋白基因，用PYW-6表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 10所示的a干扰素融合蛋白基因，用PYW-7表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 11所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_8表示。一种含有重组表达载体的工程菌株，将pYW-1、pYff-2、pYff-3、pYff-4、pYff-5、pYff-6、pYW-7或pYW-8分别转入大肠杆菌DH5 a中。一种a干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物的应用。本发明利用ABP肽和IFN融合表达，不影响IFN的活性，同时又延长IFN在人体内的半衰期，实验证明，可以作为一种新型的长效干扰素而用于一些肿瘤类疾病以及病毒性疾病的治疗。
图I为序列表SEQ ID NO. 8所示a干扰素融合蛋白基因的重组PCR产物电泳检测结果。M为Marker，I泳道为所述融合蛋白基因的PCR产物电泳结果，空为空白泳道，负为 阴性对照。图2为含SEQ ID NO. 8所示a干扰素融合蛋白基因的pYW_5载体的转化子菌液PCR产物的琼脂糖电泳检测结果。M为Marker，I泳道为阴性对照，2_6泳道为阳性转化子的菌液PCR结果。图3为转入pYW-5载体的大肠杆菌工程菌YW-IFNa2-ABP_E001的诱导表达的SDS-PAGE检测结果。M为Marker，I泳道为诱导表达前全菌，2泳道为诱导表达后全菌。图4为由SEQ ID NO. 8所表达的a干扰素融合蛋白——IFNa2_ABP蛋白变性复性及纯化后的SDS-PAGE检测结果。M为Marker，I泳道为诱导表达前全菌，2泳道为诱导表达后全菌，3泳道为融合蛋白变性复性后上清，4泳道为纯化后的融合蛋白——IFNa2-ABP。图5为由SEQ ID NO. 8所表达的a干扰素融合蛋白——IFNa2_ABP蛋白的WesternBlot分析结果。M为Marker, I为融合蛋白的Western Blot结果,2为负对照。图6为由SEQ ID NO. 4所表达的a干扰素融合蛋白的Western Blot分析结果。M为Marker, 1、2为融合蛋白的Western Blot结果。图7为含SEQ ID NO. 10所示a干扰素融合蛋白基因的pYW_7载体的转化子菌液PCR结果。M为Marker，I为融合蛋白的菌液PCR结果。
具体实施例方式实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。序列表SEQ ID NO. 4是指IFNa2b及ABP基因直接融合。序列表SEQ ID NO. 5是指IFNa2a及ABP基因直接融合。序列表SEQ ID NO. 6是指IFNa2b与ABP基因之间通过表达Gly-Gly-Gly-Ser的
基因融合。序列表SEQ ID NO. 7是指IFNa2a与ABP基因之间通过表达Gly-Gly-Gly-Ser的
基因融合。序列表SEQ ID NO. 8是指IFNa2b与ABP基因之间通过表达(Gly-Gly-Gly-Ser) 3的基因融合。序列表SEQ ID NO. 9是指IFNa2a与ABP基因之间通过表达(Gly-Gly-Gly-Ser) 3的基因融合。序列表SEQ ID NO. 10是指IFNa2b与A BP基因之间通过表达(Gly-Gly-Gly-Ser)
100的基因融合。序列表SEQ ID NO. 11是指IFNa2a与A BP基因之间通过表达(Gly-Gly-Gly-Ser)100的基因融合。实施例I
一种融合基因IFN2b_ABP(SEQ ID NO. 8)的构建。包括如下步骤(I)以pBV-IFN (此质粒含有IFNa2b编码基因序列)为模板，通过PCR (用高保真Taq酶)，获得IFN2b_ABP基因的前一部分片段。实验所用的PCR引物是根据IFNa2b及ABP的序列设计的Pl:5' -ATGGGATCCATGTGTGATCTGCCGCAAAC~3/ (SEQ ID NO. 12)下划线部分为BamH I酶切位点。P2:5' -ACCGGAGCCACCGCCAGAACCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3' (SEQ ID NO. 13)(2)采用重组PCR的方法，获得IFN2b_ABP基因片段(图I)。所需要的引物序列如下P3:5' -GTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTGACTGCGCGTGGCACCTGGGTGA-3' (SEQ ID NO. 14)P4:5' -GCTCTGCAGTTAGGTGCACCAAACCAGTTCACCCAGGTGCCACGCGCA-3' (SEQ ID NO. 15)下划线部分为Pst I酶切位点。将步骤(I)中得到的IFN2b_ABP基因的前一部分片段做为模板，用P1、P3、P4三条引物进行重组PCR,反应过程中使用高保真Taq酶。体系为50yL。体系液中包含2 ii L步骤(I)中的IFN2b-ABP基因的前端片段，PU P3和P4引物各I u L, 5 u LlOXbuffer, I U LTaq 酶，I u L10mmol/L dNTP，38 u L ddH20。PCR 反应条件为94°C 预变性 5 分钟；94°C 30秒，61°C 30秒，72°C I分钟，循环30次；72°C延伸10分钟，4°C保温。获得少量融合基因IFN2b-ABP。用上述融合基因IFN2b-ABP继续进行2次PCR反应。此PCR反应过程中使用Pl和P4引物。反应体系为50ii L。混合液中包含上一步骤中获得的融合基因IFN2b-ABP2u L,5u L 10Xbuffer, I u L Taq 酶，I y L IOmmoI/L dNTP, I u L Pl 弓丨物，Iii L P4 引物，39 u L ddH20。PCR反应条件为94°C预变性5分钟；94°C 30秒，60°C 30秒，72°C I分钟，循环30次；72°C延伸10分钟，4°C保温。获得融合基因IFN2b-ABP(SEQ ID NO. 8)(图I)。实施例2一种含有IFN2b_ABP融合基因的大肠杆菌表达载体pYW_5的构建。用BamH I和Pst I消化IFN2b_ABP基因片段。质粒pBV亦用BamH I和Pst I双酶切得到载体大片段。将酶切后的载体大片段和基因片段进行连接。挑取阳性转化子即为本发明中所用的表达载体——含有IFN2b-ABP(SEQ ID NO. 8)融合基因的大肠杆菌表达载体pYW-5 (图2)。实施例3大肠杆菌工程菌YW-IFN2b-ABP-E001的诱导表达及IFN2b_ABP的纯化。将实施例2获得的含有IFN2b_ABP(SEQ ID NO. 8)融合基因的大肠杆菌表达载体pYW-5转化入大肠杆菌DH5 a中，得到YW-IFN2b-ABP_E001菌株，30°C、200rpm摇瓶培养到006(|(|为0. 6时瞬间升温至42°C，然后200rpm诱导表达4小时。离心取菌体，SDS-PAGE电泳检测证明成功表达IFN2b-ABP (图3)。菌体进行超声破碎，得到沉淀进行包涵体变性复性处理，复性后的上清液进行疏水层析和离子交换层析纯化处理，获得高纯度的IFN2b-ABP(图4)。Western blot结果(图5)表明，构建的大肠杆菌已成功表达IFN2b_ABP。实施例4Western Blot 实验。本实验的目的是证实本发明的a干扰素融合蛋白能和人IgG抗体的Fe片段结将经过疏水层析和离子交换层析纯化得到的高纯度IFN2b_ABP进行WesternBlot实验。15%SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜(200mA，40min)，脱脂奶粉封闭I小时，加入人免疫球蛋白IgG作为一抗4°C孵育过夜。一抗处理结束后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗室温处理I. 5小时，DAB显色液进行显色反应。结果(图5)显示，膜上的IFN2b-ABP融合蛋白处有明显的颜色反应，即该蛋白与人免疫球蛋白IgG的Fe片段产生特异性结合反应。实施例5抗肿瘤细胞增殖实验。将DAUDI细胞以适当浓度接种于含有10%灭活小牛血清的细胞培养液中(180iiL)，在37°C，5%C02，饱和湿度下培养一天，第二天在细胞培养液中加入纯化后的INF2b-ABP蛋白及对照样品(从原液开始用PBS缓冲液以10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍稀释)，37 °C，5%C02，饱和湿度下培养六天，然后加入20 y L浓度为5mg/mL的MTT，37°C孵育4小时，继而加入三联液，37°C过夜，用酶标仪测A570nm吸光值来表示细胞增殖水平。结果证明INF2b-ABP蛋白可以有效抑制肿瘤细胞的增值，见表I。表I
权利要求
1.一种a干扰素融合蛋白，其特征是所述融合蛋白包括a干扰素和ABP，所述ABP为能与人IgG抗体Fe片段结合的小肽，所述a干扰素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. I所示或序列表SEQ ID NO. 2所示；所述ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID N0.3所示，所述a干扰素的肽链C端与ABP的肽链N端直接连接，或a干扰素的肽链C端与ABP的肽链N端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接,所述n为1-100。
2.—种a干扰素融合蛋白的编码基因，其特征是由序列表SEQ ID NO. 4、序列表SEQID NO. 5、序列表 SEQ ID NO. 6、序列表 SEQ ID NO. 7、序列表 SEQ ID NO. 8、序列表 SEQ IDNO. 9、序列表SEQ ID NO. 10或序列表SEQ ID NO. 11所示。
3.—种重组表达载体,其特征是大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序 列 表SEQ ID NO. 4所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_l表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 5所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_2表示；或大肠杆菌表达载体PBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 6所示的a干扰素融合蛋白基因，用PYW-3表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 7所不的a干扰素融合蛋白基因,用pYW_4表不；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID N0.8所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYff-5表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 9所不的a干扰素融合蛋白基因，用pYW-6表不；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 10所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW_7表示；或大肠杆菌表达载体pBV中包含了权利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 11所示的a干扰素融合蛋白基因，用pYW-8表示。
4.一种含有重组表达载体的工程菌株，其特征是将权利要求3所述的pYW-1、pYW-2、pYW-3、pYW-4、pYW-5、pYW_6、pYff-7 或 pYW_8 分别转入大肠杆菌 DH5 a 中。
5.权利要求I的一种a干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种α干扰素融合蛋白，融合蛋白包括α干扰素和ABP，ABP为能与人IgG抗体Fc片段结合的小肽，α干扰素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO.1所示或序列表SEQ ID NO.2所示；ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO.3所示，α干扰素的肽链C端与ABP的肽链N端直接连接，或α干扰素的肽链C端与ABP的肽链N端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接，n为1-100。本发明利用ABP肽和IFN融合表达，不影响IFN的活性，同时又延长IFN在人体内的半衰期，实验证明，本发明的α干扰素融合蛋白可以作为一种新型的长效干扰素而用于一些肿瘤类疾病以及病毒性疾病的治疗。
文档编号A61K38/21GK102775502SQ20121029276
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者刘汝萃, 刘锡潜, 卫一鸣, 张建全, 杜勇, 范书琴, 逄键涛 申请人:天津禹王生物医药科技有限公司, 山东禹王制药有限公司