专利名称：人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物制药领域，涉及人源曬菌体抗体库及I株抗Trop-2抗体IgG的重、轻链基因及其所编码的蛋白，以及所述蛋白及其衍生物在制备治疗胰腺癌等上皮起源肿瘤药物中的应用。
背景技术：
胰腺癌是一种极其凶险的恶性肿瘤，其发病率及死亡率在全世界范围内均呈明显的上升趋势，2008年胰腺癌分别占男性和女性癌症死因的第4、第5位，其发病率和死亡率几乎 相等。胰腺癌的诊治是世界级的医学难题，恶性程度高、进展快、侵袭性强、转移早、预后极差，症状隐匿，难以早期诊断，其容易发生浸润转移的生物学行为和胰腺的解剖学特点决定了外科手术难以达到根治性切除。随着手术方式的改进及放疗、化疗等综合措施的引进，并发症和死亡率有所降低，但五年生存率仍不到5%。胰腺癌作为一种对现有治疗手段无满意疗效的高度恶性肿瘤，寻找新的具有临床应用价值的胰腺癌治疗手段如靶向治疗是目前研究的热点。随着对肿瘤基因组学、蛋白组学及信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它们对肿瘤微环境的影响已经越来越清楚，这也使得针对肿瘤的特异性分子靶点设计抗肿瘤治疗新方案成为可能。肿瘤的分子靶向治疗是一种有异于传统手术、放疗、化疗的新的治疗模式，优越性在于药物通常仅与相应的靶位结合，通过直接影响其靶位分子的功能，或本身带有的物理或化学效应分子来达到杀伤或抑制目标细胞的作用。由于靶位明确，药物通常具有很高的选择性，既可有效杀伤或抑制靶细胞，又对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此，研制分子靶向药物成为肿瘤临床研究的热点。人滋养层细胞表面抗原2 (human trophoblast cell surface antigen 2，Trop-2)是由TACSTD2基因编码的细胞表面糖蛋白。Trop-2由323个氨基酸构成，其中信号肽26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞质区26个氨基酸。大量临床研究和文献报道表明，Trop-2在胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、子宫癌和胰腺癌等上皮癌中过表达，而在成年人正常组织中很少表达或不表达；Trop-2在肿瘤组织中的过表达与患者的预后不良和癌细胞的转移密切相关，同时影响患者的总生存率。因此，Τι·ορ-2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。
发明内容
解决的技术问题本发明旨在提供抗Trop-2抗体IgG的重、轻链基因及其编码的多肽，其重组表达的IgG能够与Trop-2分子具有特异性结合能力、对胰腺癌细胞增殖具有抑制作用。
发明内容
人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，所述抗体的Vl链的互补决定区⑶R具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；
SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；
SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ；
并且所述抗体的Vh链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；
SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ； SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。所述抗体的'链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。所述抗体的八链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。所述抗体的\链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh链的氨基酸序列如SEQ IDNO. 13所示。所述抗体的\链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh链的核苷酸序列如SEQ IDNO. 14所示。人源抗Trop-2基因工程抗体IgG在制备治疗胰腺癌药物中的应用。有益效果本发明人从60例胰腺癌患者的全血中分离的B淋巴细胞中，扩增所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建库容量为6. 3 X IO9的全人源Fab抗体库，用重组的Trop-2蛋白和过表达Trop-2的胰腺癌细胞BXPC3对噬菌体抗体库进行富集筛选，分离了 I株抗Trop-2的特异性人源Fab抗体。将Fab的可变区基因分别与人源抗体IgG的稳定区基因CH和CL融合，制备抗Trop-2抗体IgG分子的重链和轻链基因，克隆于真核表达载体，转染CHOdhfr-细胞中并进行表达，经Protein G柱亲和纯化后,用于抗体的功能分析。
流式细胞术检测结果显示，抗Trop-2抗体IgG能够与Trop-2阳性细胞BXPC3特异性结合，但不结合未表达Trop-2的NIH3T3细胞；荧光染色结果表明，抗Trop-2抗体IgG能够与阳性细胞BXPC3的结合，阳性信号主要显示在细胞膜上，表明抗Trop-2的IgG抗体能够特异性结合于BXPC3细胞表面的天然构象Trop-2蛋白；体外试验结果表明，抗Trop-2抗体IgG对胰腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，肿瘤细胞生长抑制率达84. 15% ;动物试验结果显示，抗Trop-2抗体IgG对胰腺癌生长具有的抑制作用，肿瘤生长抑制率达56. 85%。
图 I 纯化的抗 Trop-2 抗体Fab 的 SDS-PAGE 和 Western blot 检测；A Fab 的 SDS-PAGE检测；B Fab 的 Western blot 检测；
图2纯化抗体的SDS-PAGE检测，M :蛋白Marker ； I :纯化后的单抗；
图3抗Trop-2抗体IgG效价的检测；
图4 FACS检测抗Trop-2抗体IgG分别与NIH3T3细胞、BxPc3细胞的结合；A :抗Trop-2抗体IgG与NIH3T3细胞结合的检测；B :抗Trop-2抗体IgG与BxPc3细胞结合的检测图5抗Trop-2抗体对BXPC3细胞系增殖的影响。图6 抗Trop-2抗体对胰腺癌增殖的抑制作用；I :阴性对照；2: O. 4mg/kg组；3 2 mg/kg 组；4: 10 mg/kg 组。
具体实施方案
以下具体实施方式
不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。
实施例I
全人源Fab曬菌体抗体库的构建
采集胰腺癌患者全血60份,分离淋巴细胞,采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用0lig0(dT)2(l为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。经Overlap PCR合成Fab基因，与经相同酶切的表达载体pComb3XSS连接，构建Fab的原核重组表达载体；电转化感受态大肠杆菌XLl-Blue，构建了容量为6. 3 X IO9的全人源Fab抗体库。所述构建的Fab基因与pComb3xSS载体连接是指将纯化定量后的Fab基因分别以SfiI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pComb3xSS载体连接；所述的转化是指a) O. 2cm电转杯，25 μ F，2. 5 kV，200 Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌XLl-Blue ；b)转化产物加入LB培养基后37°C振荡培养2 h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30°C过夜培养；c)次日计算平板上的克隆数，估算库容为6. 3 X IO9 ；d)将电转化后菌液加入辅助噬菌体VCSM13超感染，离心沉淀菌体，用LB培养基重悬，37 °C振荡过夜,离心沉淀菌体,吸取上清即为Fab噬菌体抗体库。
抗Trop-2特异性抗体的筛选、表达及纯化
用纯化的重组人Trop-2蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔2 μ g，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体VCSM13超感染；重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；
将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于LBA培养板上培养过夜，挑取60个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μ L菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；iP/N值(Positive/Negative)大于4时,该菌株为阳性单克隆曬菌体菌株；共得到8个阳性克隆。阳性克隆经核酸序列分析后，8个克隆的基因序列相同，为同一个Fab。将阳性克隆噬菌体感染疋coli. ToplOF’，含有重组质粒pComb3x_Fab的菌株接种IOOOmL的LB液体培养基中(含有100ug/mL的氨苄青霉素)，37°C摇床培养至0D600nm至0. 9，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导4小时。用SDS-PAGE和ffestern-blot鉴定。结果显示，在预期大小处出现目的条带，分别为Fab的Fd链和L链(图I )。人源抗Trop-2抗体IgG的制备与特性分析
根据抗体的可变区基因序列，合成可变区基因的引物如下
Vh上游引物为
5’ -gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAG-3，
Vh下游引物为
5’ -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGG-3’ ；
'上游引物为
5’ -GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCCAGATGACCCAG-3，
'下游引物为 5’ -ACGCGTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3>。分别以Fab基因为模板，扩增抗体的可变区基因VH、Vl,同时扩增人IgG的恒定区基因Ch、(^经重叠延伸PCR构建IgG抗体的重链基因与轻链基因，克隆于真核表达载体中。从液氮罐取出CHOdhfr-细胞，用含有10% FBS的F-12培养基，空细胞培养需加HT，细胞长满后传代，铺到六孔板，待细胞长到70%时，转染IgG重组载体，转染步骤如下
(I)先把六孔板里的培养基换成不含血清的培养基(含HT)，每孔lmL。(2) ΙΟΟμ 无血清培养基里加入IPg质粒,轻轻混匀；
(3)以1:1的体积比例，加入转染试剂，轻轻混匀；
(4)DNA-转染试剂复合物室温放置15min ；
(5)把混合物逐滴加入到六孔板中，同时做空白对照；
(6 ) 4-6h后，换液(10%血清但不含HT )。24h后观察细胞状态，可对转染细胞逐渐加压(MTX 25nM，50nM，100 nM，200nM……)筛选。当有克隆形成时，吸取上清检测抗体的表达量，并进一步亚克隆，筛选稳定表达细胞株。表达于培养上清中的IgG分子,经Protein G柱亲和纯化后,用于抗体的功能分析。将ProteinL亲和层析柱安装至蛋白质纯化仪上,用10个柱床体积的结合缓冲液冲洗酒精。用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱床后，上样品，流速为ImL/分钟。用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5_10个柱床体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE鉴定。结果显示，纯化的蛋白分别为抗体IgG的重链和轻链(图2)。抗体的\链的互补决定区⑶R具有以下的⑶R氨基酸序列
SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；
SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；
SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ；
抗体的Vh链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；
SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ；
SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。所述抗体的'链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。所述抗体的'链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。所述抗体的\链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh链的氨基酸序列如SEQ IDNO. 13所示。所述抗体的\链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh链的核苷酸序列如SEQ IDNO. 14所示。
具有抗原识别特异性的全人源抗Trop-2抗体IgG的鉴定
用重组人Trop-2蛋白O. 2 μ g/ mL包被酶联板，4 °C过夜，次日封闭液37 °C封闭2 h 后洗板，加入梯度稀释的Fab抗体，37 °C孵育I h洗板，加入I 1000稀释HRP标记的羊抗人IgG，37 °C孵育I h后洗板，显色，酶标仪测A450吸光度值。ELISA检测分析表明，当IgG稀释滴度从100增加至Ij 6400倍时，A450 Corr值从I. 462降低到O. 328(Blank O. 132)(图3);用3%BSA封闭BXPC3细胞和NIH3T3细胞30min，洗涤后加入抗Trop-2的Fab，4 V孵育30min，加入FITC标记的羊抗人Fab 4 °C孵育30min。细胞经PBS洗涤两次后，用FACSCalibur cytometer 检测，CellQuest 分析软件分析(Becton Dickinson, Heidelberg,Germany)。FACS检测结果显示，IgG能够与Trop-2阳性细胞BXPC3特异性结合，但不结合未表达Trop-2的NIH3T3细胞(图4)。
抗Trop-2抗体IgG对胰腺癌细胞BXPC3增殖的影响
以 DMEM 培养液稀释抗 Trop-2 IgG 抗体，配制 10Pg/mL、20Pg/mL、40Pg/m、80Pg/mL 和16(^g/mL不同浓度的抗体，分别加入培养有BxPC3细胞和NIH3T3细胞的96孔培养板中，培养3天，MTS/PMS法检测细胞的增殖。MTS/PMS检测结果显示，抗Trop-2抗体IgG与BXPC3细胞共同培养，抗体对细胞生长具有一定的抑制作用。当培养液中的抗体剂量增加时，细胞生长抑制率也明显增高。当IgG为16(^g /mL时，细胞生长的抑制率达80%以上，而随着IgG抗体浓度的增加，抗体对未表达Trop-2的NIH3T3细胞增殖的抑制未见显著的变化(图5)。
抗Trop-2抗体IgG在动物模型中对胰腺癌细胞增殖的抑制
收集处于对数生长期的BxPC3细胞，用PBS洗2次，制成PBS制备成IX 107/mL细胞悬液，按O. ImL/只的量将细胞悬液接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至50-100mm3后将动物随机分组，每组8只。分别为空白对照组、阴性对照组(抗RV IgG)和实验组(10mg/kg、2mg/kg和O. 4mg/kg 3个药物梯度),每组8只。每2天尾静脉注射，共注射8次药物。给药结束后，剥离小鼠体内的肿瘤，按照公式V=l/2ab2计算肿瘤体积，分析抗体对裸鼠异种移植肿瘤生长的影响。如图6所示，静脉给药结束后，空白对照组和阴性对照组之间肿瘤大小无显著差异(P>0. 05)，而实验组中高浓度组(10mg/kg)的肿瘤的体积显著小于空白对照组和阴性对照组(P〈0. 01)，随着给药时间的延长，肿瘤生长的抑制作用显著增加，抑制率达56. 85%。
权利要求
1.人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的'链的互补决定区⑶R具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ； 并且所述抗体的Vh链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ； SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。
2.根据权利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的Vl链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
3.根据权利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的Vl链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。
4.根据权利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的Vl链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
5.根据权利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的Vl链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
6.权利要求I 5任一人源抗Trop-2基因工程抗体IgG在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
全文摘要
人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用，人源抗Trop-2基因工程抗体IgG，其特征在于，所述抗体的VL链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQIDNO.1所示的L-CDR1；SEQIDNO.2所示的L-CDR2；SEQIDNO.3所示的L-CDR3；并且所述抗体的VH链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。体外试验结果表明，抗Trop-2抗体IgG对胰腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。
文档编号A61K39/395GK102827282SQ20121032172
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者林红, 冯振卿, 朱进 申请人:林红