专利名称：一种金针菇不皂化提取物甾醇的三元纳米胶束及其制备方法
技术领域：
本发明涉及金针菇留醇提取物及其三元纳米胶束。
背景技术：
金针燕(Flammulina velutipes (ff. Curt. :Fr.) Singer)，又名金钱菌、朴蕈、冬燕、毛柄金钱菌，属真菌门(Eumycota),担子菌亚门(Basidiowyeotina),层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales), 口蘑科(Tricholomataceae),小火焰菌属 (Flammulina)、或金钱菌属(Collybia),是古今中外著名的食用菌之一(郭美英主编，《中国金针菇生产》，北京中国农业出版社，2000.)。
金针菇富含糖类、蛋白质、膳食纤维和矿物质等营养物质。近些年来，学者们已从金针菇中分离得到许多种蛋白质和多糖类活性物质，这些物质具有抗肿瘤，抗病毒，抗虫，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒(HIV)，降低血清胆固醇，降低血压，提高机体免疫力，以及保护肝脏等广泛药理活性。已经报道的蛋白质类成分主要包括真菌免疫调节蛋白，金针燕毒素，火 素，火燕蛋白原，酶，凝集素，以及Flammulin、Velutin、Flammin和Velin等四种核糖体失活蛋白等。多糖类成分包括PA3DE、PA5DE, EA3> EA5, EA6和EA7, SFAl, FVP2，胞外多糖，卢-葡聚糖，木甘露聚糖以及甘露岩藻半乳聚糖等(Yaqi Wang, Li Bao, XiaoliYang, etc. Bioactive sesquiterpenoids from the solid culture of the ediblemushroom flammulina velutipes growing on cooked rice[J]. Food Chemistry,2012, 132(3): 1346-1353. Hui-Hsin Chang, Kuang-Yang Hsieh, Chen-Hao Yeh, etc.Oral administration of an enoki mushroom protein fve activates innate andadaptive immunity and induces anti-tumor activity against murine hepatocellularcarcinoma [J]. International Immunopharmacology, 2010, 10: 239-246·)。
除此之外，留醇、脂肪酸、黄酮、萜类以及核苷等小分子物质也被从中发现。目前关于这些小分子物质的生物活性报道主要集中在抗菌、抗氧化方面(方玉梅，张春生，谭萍，etc.金针菇黄酮类化合物的抗氧化性作用[J].食品研究与开发，2012，33(3):15-18. V. M. Tereshina, A. S. Memorskaya. Adaptation of flammulina velutipes tohypothermia in natural environments the role of lipids and carbohydrates[J].Microbiology, 2005, 74(3) : 279-283·)。
留醇(Sterol)是一类重要的三職类化合物(Triterpenes),它们广泛存在于植物，动物和真菌当中。根据来源不同，留醇可分为动物留醇和植物留醇(Plantsterols, PS)。胆固醇是动物体内的主要甾醇，其中游离胆固醇有稳定细胞膜的作用。植物甾醇是植物细胞膜的重要组成部分，与胆固醇类似，自由植物留醇有助于稳定植物细胞膜中的磷脂双层，它们结构与胆固醇相似，但在C-24位有一个甲基或乙基基团。
在高等植物中，最常见的PS是豆甾醇(Stigmasterol)、卢-谷甾醇{β -sitosterol)和菜油甾醇(Campesterol),它们有一个共同特点是在甾核的C_5, 6位有一个双键，这种植物留醇称为Phytosterols。在十字花科植物中主要存在另外一种甾醇-菜籽甾醇(Brassicasterol)。饱和PS,也称为植物甾烧醇(Phytostanols),是在甾
核中没有双键的。
在过去的15年里，植物留醇(PS)已经被证明具有降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇浓度的功效，被纳入功能性食品的范畴。许多临床研究显示，Γ3克/天PS的剂量能够显著降低血浆LDL胆固醇的浓度。植物留醇还可用于辅助治疗，与他汀类药物联合使用的效果超过他汀类药物加倍剂量的效果。现在已经有40多个关于PS产品的专利，超过 15 个 PS 产品行销全世界(G. Garcia-Llatas, Μ. T. Rodriguez-Estrada.Current and new insights on phytosterol oxides in plant sterol-enrichedfood[J]. Chem Phys Lipids, 2011，164(6) : 607-624·)。关于植物甾醇降低胆固醇作用的确切机制尚不清楚，目前认为存在以下几种可能(1)由于植物留醇比胆固醇具有更强的疏水性，因此植物留醇可以取代胆固醇进入混合微粒(Mixed micelles)中。这种取代作用使微粒中的胆固醇含量下降,从而减少胆固醇的吸收。(2)植物留醇可以减缓胆固醇在肠上皮细胞中的酯化速度。由于酯化后的固醇易于进入乳糜微粒中，而未酯化的固醇则较难进入乳糜微粒，因此植物留醇可以减少乳糜微粒中胆固醇的总量。(3)植物甾醇可能通过ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运体家族影响胆固醇的吸收。ABCG作为ABC的一个亚族，其中两个基因ABCG5和ABCG8与人体对留醇的选择性吸收有关，也与胆汁中固醇的分泌有关(周晓星，苏宜香.植物甾醇降胆固醇作用的研究现状[J].国外医学卫生学分册，2007，34(2): 101-105.)。目前已经从金针菇的子实体以及菌丝体中得到17种包括麦角留类和豆留类的甾醇化合物(2览，24/P) -ergosta-7, 22-diene_3卢，5 σ，6 σ，9 σ -tetrol (I)，(22Ε, 24/P)-ergosta-7, 22-diene_3β ,5 a ,ββ -triol (2), (245) -ergosta-7-ene-3β ,5a ,ββ -triol (3), 5 σ , 8 σ -epidioxy- (22/ , 2AR) -ergosta-6, 22-diene_3/ _ol (4) , 5 σ , 8 σ -epidioxy- (2451) -ergost-6-ene~3β _ol (5), (22/ , 24/P) -ergosta-5, 7, 9(11), 22-tetraene-3/ -oI (6), (2451) -ergosta-7-ene-3β ~o\ (7), ergosta-5, 8, 22-triene-3/ -ol (8)，ergosterol (9), ergosta-5, 7-diene-3/ -oI (10), ergosta-7, 22-diene-3/ -ol (11)，ergosta-30 -D-glucopyranoside (12), ergosta-7, 22-diene_5，6-epoxy-3_ol (13),5 a -stigmastan-3, 6-dione (14)，(24/P) -stigmast-4-ene-3_one (15)，ergosta-4, 6, 8 (I4), 22-tetraene-3-one (16), ergosta-8(14)-ene~3β -ol (17)。上述的化合物9 (ergosterol,麦角甾醇)是金针燕所含甾醇类物质的主要成分之一，在植物界也广泛存在，其抗肿瘤活性已经得到了多次实验的证实，作用机制亦部分被揭示。Takaku等从姬松鸾中分离出ergosterol,400和800 mg *kg_1的剂量连续20 d 口服给予肉瘤180小鼠，可以显著抑制肿瘤的生长，而且还没有化疗药物通常所引起的如体重、附睾脂肪组织、胸腺、脾脏重量和白细胞数降低等副作用。进一步研究表明，ergosterol能够直接抑制基底膜诱导的新生血管形成，因此它是通过直接抑制实体瘤诱导的血管生成来发挥抑瘤活性的(Takeshi Takaku, Yoshiyuki Kimura, Hiromichi Okuda. Isolation of anantitumor compound from agaricus blazei murill and its mechanism of action[J].Biochemical and Molecular Action of Nutrients, 2001, 131(5): 1409-1413·)。Yazawa等从Polyporus醇提物中分离出ergosterol,它对5%糖精钠(SodiumSaccharin)、O. 01%N- 丁基-N- (4-羟基丁基)亚硝胺(BHBN)、3%DL-色氨酸(Trp)、2%丁基化羟基苯甲醚(BHA)等诱导的Wistar大鼠膀胱癌，有很好的治疗作用(YasuharuYazawa, Masami Yokota, Kiyoshi Sugiyama. Antitumor promoting effect of an activecomponent of polyporus, ergosterol and related compounds on rat urinary bladdercarcinogenesis in a short-term test with concanavalin A[J]. Biol. Pharm. Bull.,2000，23(11) : 1298-1302.)。P21是细胞周期素依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI )的一种，属于细胞周期负性调节因子，它可通过抑制细胞周期素依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK) CDK2、CDK4的活性，使细胞不能跨越G期检查点，从而阻滞细胞周期的进行，抑制细胞增殖，是肿瘤预防和治疗一个靶点。张娴等发现ergosterol在5(Γ200 μ gmr1可以抑制!fepG2细胞增殖，机制可能与增高Ρ21 mRNA和蛋白表达相关。在 ergosterol 作用 48 h 和 72 h 后，100、200 μ g *mL 1 组 P21 mRNA 的表达明显增高。24h后P21蛋白已经有升高趋势,48 h、72 h后明显升高,提示P21可能是ergosterol的作用靶点。(张娴，黄羽，曾星.麦角甾醇对肝癌细胞ifepG2增殖及P21表达的影响[J].中药药理与临床，2011，27(5) : 26-29.)· 高虹等人采用小鼠S180移植瘤实验研究了巴西燕子实体中ergosterol的体内抗肿瘤活性。结果表明，巴西燕子实体中提取的ergosterol在剂量10、50和100 mg · kg—1 · cf1时的瘤重抑制率分别为62. 75%,76. 61%和79. 18%，说明ergosterol有较强的抑瘤活性，并且认为其抑瘤活性不是通过细胞毒作用发挥，而是通过抑制肿瘤血管增生来扼杀肿瘤(高虹，史德芳，杨德，etc.巴西菇麦角留醇抗肿瘤活性及作用机理初探[J].中国食用菌，2011，30(6): 35-39·)。
然而，室温条件下游离的植物留醇在水和油中的溶解度均很小，在人体内的吸收率亦很低，约为 2% 5% (I. Rudkowska. Plant sterols and stanols for healthyageing [J], Maturitas, 2010，66(2) : 158-62.)。为了扩宽植物甾醇的应用范围，提高其溶解度是当务之急。目前主要有两种方法，其一是利用留核上重要的活性基团——C-3位羟基，可与脂肪酸反应形成留醇酯，植物留醇酯比游离植物留醇在油中的溶解度增加约10倍；其二是利用乳化剂的乳化增溶作用和高压均质技术，使植物留醇在水相中分散成纳米级的分散体，增加它的溶解度。
纳米胶束(Nanomicelles)是近年来出现的一种纳米级新型药物载体,利用胶束增溶作用可以提高难溶性药物的溶解度及口服生物利用度。依据构成载体材料相对分子质量的不同，纳米胶束可分为低分子胶束和聚合物胶束。胆盐/卵磷脂混合胶束主要由胆盐、卵磷脂、药物三部分组成，是一种已经得到了系统而广泛研究的低分子胶束。利用它形成的制剂不仅可显著提高难溶性药物的溶解度，还能提高药物的疗效，增加药物稳定性，是具有良好生物相容性的药物传递载体(林东海，李苹，李新欣，etc.胆盐/磷脂混合胶束对疏水性天然药物增溶性能的研究[J].亚太传统医药，2009，5(8) : 27-30.)。由于低分子胶束采用小分子的表面活性基团作载体材料，遇水自组装形成的疏水性“核”较小，其增溶量、载药量及促进药物被机体利用的程度均有限，因而限制了其在难溶性药物增溶方面的广泛应用(用作难溶性药物载体的聚维酮-磷脂-胆酸盐三元组合物[P]，申请专利号:200510037848. 2)。聚合物胶束是由含有亲水性和疏水性长链的两亲性嵌段共聚物在水中浓度超过临界胶束浓度(Critical micelle concentration, CMC)后自发形成的。20世纪90年代初由日本Kataoka教授等人最初提出作为抗癌药物的载体。迄今为止，已有Genexol 、NK105、NC-6004、NC-4016、NK012、NK911、SP1049C等七个抗肿瘤药物的聚合物胶束配方正在进行临床试验(J. Gong, M. Chen, Y. Zheng, etc. Polymeric micelles drug deliverysystem in oncology[J]. J Control Release, 2012·)。两亲性二嵌段(AB)或三嵌段(BAB)共聚物最常用于制备自聚集聚合物胶束用于药物的传输。因为接枝共聚物多数在水中形成的疏水核芯无法紧密结合，有疏水链外露，从而引起胶束之间的疏水链靠近而聚集，不太适用于作药物载体。亲水段的材料一般用聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)或聚维酮(PVP)，近年亦有用壳聚糖，疏水段材料主要有聚氧丙烯(PPO)、聚氨酯类、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸、聚乳酸(PLA)、精胺或短链磷脂等(陆彬.作为载药系统的聚合物胶束和泡囊的研究[J].河南大学学报(医学版)，2008, 27(1): 1-7.)。大多数两亲性嵌段共聚物聚集形成核壳结构的圆形胶束，聚合物的疏水部分缠绕成疏水性内核，通过化学的、物理的或者静电作用与药物相结合，包载难溶性药物；亲水部分分布在疏水内核外周，与周围的水分子形成氢键而向水中伸展，形成水化 层，防止胶束聚集，如图 I 所不(Shawn C. Owen, Dianna P. Y. Chan, Molly S. Shoichet.Polymeric micelle stability[J]. Nano Today, 2012, 7(1): 53-65·)。除了增溶作用，聚合物胶束还可以通过被动或主动的方式到达特定的组织内部。延长循环时间和较高的载药能力是靶向药物成功的先决条件。聚合物胶束亲水性外壳的空间位阻和纳米尺寸(1(T100 nm)可以在血液中停留足够长的时间。一方面是因为聚合物胶束能够有效避免肾脏排泄(> 50 kDa)，另一方面是因为粒径很小(〈200 nm)，可以不被脾脏内皮细胞狭缝所截留。同时，与低分子表面活性剂相比，两亲性聚合物官能团种类更多、结构更加复杂，可以对现有的官能团进行结构修饰或者连接上其他官能团，增强胶束核心与药物的亲和力，因而聚合物胶束的载药量及稳定性明显提高。胶束具有良好的组织透过性，尤其可在具有渗漏性血管的组织(如肿瘤或梗塞区域)聚集，即所谓的EPR效应，这使得胶束具有天然的被动靶向作用。通过介导叶酸、PH敏感或热敏感等手段靶向定位，聚合物胶束还能够逆转肿瘤细胞多药耐受(MDR) (U. Kedar, P. Phutane, S. Shidhaye,etc. Advances in polymeric micelles for drug delivery and tumor targeting[J].Nanomedicine, 2010, 6(6): 714-729·)。金针菇留醇提取物是将金针菇子实体粉碎后用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、皂化反应、结晶等步骤得到的不皂化物。研究证明，该提取物具有体外抑制人肝癌细胞(HepG2)、人胃腺癌细胞(SGC)、人胶质瘤细胞(U251)和人肺腺癌细胞(A549)等肿瘤细胞生长的活性，可用于制备抗肿瘤药物(参见金针菇中具有抗肿瘤作用的不皂化提取物及其制法和用途[P],申请专利号201110364098. 5)。它主要包含ergosterol，22, 23-dihydroergosterol, ergosta-5, 8, 22-triene~3-ol 和 ergost-8 (14) -ene-3β -οI等四种成分。它易溶于乙醚、氯仿以及热乙醇等有机溶剂，室温下极难溶于水和油，具备植物甾醇的一般性质。目前尚未有以金针菇留醇提取物为原料药，制备成三元纳米胶束制剂，以达到提高该提取物溶解度和生物利用度的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金针菇不皂化提取物留醇的三元纳米胶束，将难溶于水的金针菇留醇提取物制备成三元纳米胶束，以提高它的溶解度，改善它在体内生物利用度极低的缺点。本发明的另一目的是提供这种金针菇不皂化提取物留醇的三元纳米胶束的制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，它是以金针菇不皂化提取物留醇作为原料药，主要由以下质量组分组成金针菇不皂化提取物留醇I份；磷脂1(Γ20份；聚维酮2 16份；胆酸盐3 18份。上述的金针菇不皂化提取物留醇是将金针菇子实体用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、阜化反应、结晶等步骤得到。它主要包括ergosterol, 22，23-dihydroergosterol,ergosta-5, 8, 22-triene~3β -οI 和 ergost-8 (14) -ene-3/ -ol 等四种成分，其中前面二种 成分含量较高(参见中国专利申请CN201110364098. 5)。上述的一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，所述的聚维酮是聚维酮-K30。上述的一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，所述的胆酸盐是胆酸钠。上述的一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束的制法是将金针菇留醇提取物与磷脂、聚维酮以及胆酸盐在无水乙醇中溶解后，蒸发除去无水乙醇，得到粘稠状金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束。上述的复合物用不同的加工方法，可将其加工成不同的药物剂型，如液体制剂、冻干粉、软胶囊、复合物粉末、硬胶囊、片剂等多种药物剂型。不同的药物剂型的加工方法分别为在复合物中加入蒸馏水或缓冲液可制成胶束溶液液体制剂；将复合物用常规方法制成软胶囊；在复合物中加入蒸馏水或缓冲液，冷冻干燥可制得冻干粉；将复合物真空干燥可制成复合物粉末；冻干粉或复合物粉末可与适宜辅料混合，进一步填入胶囊或制成片剂等药物制剂。有益效果
本发明具有以下的有益效果
1、本发明增溶效果显著，并且使得药物容易被人体吸收，提高了药物的生物利用度；
2、本发明采用的配方和方法简单可行，无需特殊设备，便于大规模工业化生产。
图I聚合物胶束形成示意图。在水相中两亲性共聚物自组装有一个疏水内核和亲水外壳的结构。图2为实施例I制备的金针菇甾醇提取物三元纳米胶束的透射电镜照片(X200k)。图3为实施例I制备的金针菇甾醇提取物三元纳米胶束的粒径分布图。图4为实施例5制备的金针菇甾醇提取物三元纳米胶束的平均血药浓度-时间曲线图(n=5)。
具体实施例方式 以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例I金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束
在圆底烧瓶中按照下表称取金针菇不皂化提取物留醇、磷脂、聚维酮-K30、胆酸钠，力口Λ50 mL无水乙醇，超声至溶液澄清，旋转蒸发，除去无水乙醇，加入蒸馏水，振摇后澄清，得液体制剂，体系最终体积为100 mL,药物浓度为2 mg · ml/1。
权利要求
1.一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，其特征是它是以金针菇不皂化提取物甾醇作为原料药，主要由以下质量组分组成金针菇不皂化提取物留醇I份；磷脂1(Γ20份；聚维酮2 16份；胆酸盐3 18份。
2.根据权利要求I所述的一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，其特征是所述的聚维酮是聚维酮-Κ30。
3.根据权利要求I所述的一种金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束，其特征是所述的胆酸盐是胆酸钠。
4.一种制备权利要求I所述的金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束的方法，其特征是将金针菇不皂化提取物留醇与磷脂、聚维酮以及胆酸盐在无水乙醇中溶解后，蒸发除去无水乙醇，得到粘稠状金针菇不皂化提取物留醇三元纳米胶束。
全文摘要
一种金针菇不皂化提取物甾醇三元纳米胶束，它是以金针菇不皂化提取物甾醇作为原料药，主要由以下质量组分组成金针菇不皂化提取物甾醇1份；磷脂10~20份；聚维酮2~16份；胆酸盐3~18份。该三元纳米胶束极大地提高了水难溶性药物金针菇甾醇提取物的溶解度，有利于改善其在体内生物利用度极低的缺点。它能够加工制成多种药物剂型，而且制备方法简单，易于工业化大生产。
文档编号A61K9/00GK102940654SQ201210385939
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者徐希明, 易承学, 余江南 申请人:江苏大学