抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法
【专利摘要】本发明涉及抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。具体地，miR-155表达的显著升高与动脉粥样硬化的严重程度呈现正向相关联，miR-155在动脉粥硬化小鼠（ApoE-/-/C57BL/6J）的腹腔巨噬细胞和血清中表达显著升高，oxLDL能特异性诱导小鼠的腹腔巨噬细胞表达和分泌miR-155；在oxLDL诱导的巨噬细胞中，miR-155表达量提高能促进脂质吞噬和活性氧生成；miR-155抑制剂可以显著抑制小鼠腹主动脉的斑块形成；miR-155是动脉粥样硬化疾病治疗一个重要靶点，miR-155抑制剂可以用于预防和治疗动脉粥样硬化。
【专利说明】抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及抑制miCr0-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。
【背景技术】
[0002]心血管疾病目前已经逐渐成为危害人类生命的头号杀手，对心血管疾病的机制的研究一直是生命科学研究的热点问题。动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是心脑血管系统的常见疾病，是由脂质沉积、平滑肌细胞增殖和钙化而引起的一种以动脉损伤为特征的疾病；其表现为脂质和坏死组织的聚集，因此往往认为动脉粥样硬化是退行性病变。现在认为，动脉粥样硬化病变是多因素协同作用的结果，首先，巨噬细胞被招募，并附着于在主动脉内壁并转化为泡沫细胞；进一步地，胶原、弹性纤维及蛋白质多糖等结缔组织基质和平滑肌细胞增生；最后，脂质(主要含胆固醇结晶及游离胆固醇)和结缔组织在动脉壁大量积累形成质核。
[0003]目前的研究表明，巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中发挥了重要的作用。在动脉粥样硬化形成早期，低密度脂蛋白被氧化成氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)，oxLDL通过扩散的方式进入血管内壁，并招募血液中循环的单核细胞。循环的单核细胞被这些oxLDL活化并形成巨噬细胞，这些巨噬细胞吞噬大量的oxLDL，分化成泡沫化的细胞，泡沫化细胞将释放大量的炎症因子(如:TNF-a，MIF, IL-6等炎症因子)。这些炎症因子进一步招募更多的单核细胞分化成泡沫化细胞堆积在血管内层形成动脉粥样硬化斑，然而，巨噬细胞转化为泡沫细胞的分子机制尚未被完全的理解。
`[0004]microRNAs(miRNAs)是一类长度在19~25bp大小的非编码RNA，它们的主要功能是在转录后水平调控基因的表达。最近的研究表明大量的miRNAs存在于各种生物体液中，例如血液中。已经发现几个mRNAs在固有免疫系统有着重要的功能，例如miR-125b，miR-146。
[0005]目前尚不清楚microRNA在动脉粥样硬化中扮演什么样的作用，因此本领域迫切需要研究MicroRNA在预防和治疗动脉粥样硬化中的作用及其应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种抑制micr0-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。
[0007]在本发明的第一方面，提供了一种micro_RNA155抑制剂的用途，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物。
[0008]在另一优选例中，所述的micro-RNA155具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0009]在另一优选例中，所述micro_RNA155抑制剂选自下组:micro_RNA155抗体、micro_RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155措抗齐[1、AntagomiR-155、micro_RNA155 海绵、或其组合。
[0010]在另一优选例中，所述的AntagomiR-155为具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其衍生物或修饰物。
[0011]在另一优选例中，所述的修饰包括(但不限于):甲基化修饰、甲氧基乙基修饰、烃基修饰、胆固醇修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰(如氟代修饰等)、核酸修饰(如“TT”修饰等)、硫代磷酸化修饰、锁核苷酸修饰等。
[0012]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的一个或多个碱基进行甲基化修饰。
[0013]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5'端和/或3'端进行胆固醇修饰。
[0014]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所不的核苷酸序列的5'端和/或3'端的一个或多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰。
[0015]在本发明的第二方面，提供了一种可用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，所述的药物组合物包括:药学上可接受的载体；和有效量活性成分，所述的活性成分为micro-RNA155 抑制剂。
[0016]在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组:水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
[0017]在另一优选例中，所述micro_RNA155抑制剂选自下组:micro_RNA155抗体、micro_RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155措抗齐[1、AntagomiR-155、micro_RNA155 海绵、或其组合。
[0018]在另一优选例中，所述的AntagomiR-155为具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其衍生物或修饰物。
[0019]在另一优选例中，所述的修饰包括(但不限于):甲基化修饰、甲氧基乙基修饰、烃基修饰、胆固醇修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰(如氟代修饰等)、核酸修饰(如“TT”修饰等)、硫代磷酸化修饰、锁核苷酸修饰等。
[0020]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的一个或多个碱基进行甲基化修饰。
[0021]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5'端和/或3'端进行胆固醇修饰。
[0022]在另一优选例中，对SEQ ID NO:2所不的核苷酸序列的5'端和/或3'端的一个或多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰。
[0023]在本发明的第三方面，提供了一种筛选用于预防或治疗动脉粥样硬化潜在物质的方法，包括步骤:
[0024](I)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物；和
[0025](2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中miR-155的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的miR-155的表达水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。
[0026]在另一优选例中，所述的检测体系是细胞体系。
[0027]在另一优选例中，所述的检测体为巨噬细胞体系。[0028]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:
[0029](3):分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。
[0030]在另一优选例中，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低幅度> 5%，较佳地> 10%，较佳地^ 20%，较佳地> 50%，更佳地> 80%，最佳地> 100%，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。
[0031]在本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗动脉粥样硬化的方法，给需要的对象施用第二方面所述的药物组合物。 [0032]在另一优选例中，所述的药物组合物包括活性成分:AntagomiR-155。
[0033]在本发明的第五方面，提供了一种诊断/检测动脉粥样硬化的方法，包括步骤:分别检测待测样本和阴性对照样本miR-155的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-155的表达水平提高，则是潜在的动脉粥样硬化疾病患病样本。
[0034]在另一优选例中，所述的待测样本为血液样本。
[0035]在另一优选例中，所述的提高是指:与阴性对照样本相比，相应miRNA-155的表达水平的提高幅度> 5%，较佳地> 10%，较佳地> 20%，较佳地> 50%，更佳地> 80%，最佳地≥100%。
[0036]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0038]图1显示:miR-155在动脉粥样硬化小鼠的血清中升高；图1A:实时定量PCR检测正常饮食的野生型小鼠(Wide-Type ND)和ApoE+小鼠(ApoE+ND)，高脂饮食的野生型小鼠(Wide-Type HFD)和ApoE+小鼠(ApoE+HFD)血清中miRNAs表达；图1B:实时定量PCR检测正常饮食ApoE+小鼠和高脂饮食ApoE+小鼠腹腔巨噬细胞miR-155的表达；图1C，图1D:实时定量PCR分析巨噬细胞和它的培养基上清中miRNAs的表达；图1E、图1F ^foxLDL在不同的时间和剂量加入到Raw264.7细胞中，实时定量PCR检测miR-155的表达；图1G:oxLDL在不同时间刺激Raw264.7细胞，实时定量PCR分析BIC (pr1-mir-155)和miR-155的表达动力学。
[0039]图2显示:oxLDL诱导的小鼠巨噬细胞中miR-155调控脂质吸收和活性氧释放；图2A:不同剂量的miR-Ctrl、miR-155、ant1-Ctrl或ant1-miR-155寡核苷酸分别转染Raw264.7细胞，48小时后加入D1-oxLDL孵育6小时，使用激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞对脂质的吸收，；图2B和图2C:使用流式细胞仪分析巨噬细胞对脂质吞噬结果；图2D:将miR-ctrl、miR-155、ant1-ctrl 和 ant1-mir-155 分别转染 Raw264.7 细胞，之后加入 oxLDL刺激6小时，最后加入DCFH-DA (IOyM)孵育20分钟，使用荧光检测仪检测细胞内活性氧释放。
[0040]图3:oxLDL诱导的人巨噬细胞中miR-155调控脂质吸收和活性氧释放；图3A:将miR-Ctr、miR-155、ant1-Ctrl 或 ant1-mir-155 分别转染 THPl 细胞，48 小时后实施定量PCR，检测 miR-155 的表达；图 3B:将 miR-Ctrl、miR-155、ant1-Ctrl 或 ant1-mir-155 分别转染THPl细胞，48小时后加入PMA (100nM/mL)孵育16小时，之后加入Dil-oxLDL刺激6小时，激光共聚焦显微镜检测细胞的脂质吞噬；图3C:将miR-Ctrl、miR-155、ant1-Ctrl或ant1-mir-155分别转染THPl细胞，检测细胞内活性氧的浓度。
[0041]图4:antagomiR-155抑制小鼠的动脉粥样硬化形成；图4A:在antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE+小鼠腹腔中分离巨噬细胞，实时定量PCR检测miR-155的表达；图4B:从antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE+小鼠腹腔中分离巨噬细胞，使用oil red O染色的方法检测巨噬细胞的脂质吞噬；图4C:从antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE+小鼠腹腔中分离血液上清，检测血清中的TNF- α和IL-6 ；图4D:分离antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE+小鼠的胸腹主动脉做油红染色，并对油红染色面积进行统计(image-pro plus 6.0);图4Ε:对antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE+小鼠弓主动脉冰冻切片染色，并对切片油红染色并统计染色面积(image-proplus 6.0)。
[0042]图5:在冠心病病人的⑶14+单核细胞中检测miR-155和炎症因子的表达模式:图5A:分离病人和正常人的⑶14+单核细胞，使用实时定量PCR检测miR-155的表达；图58_0:使用实时定量PCR的方法检测病人和正常人的单核细胞中的HBPUTNF-α和IL_6mRNA14表达；图5E-图5F，使用实时定量PCR检测所有人的⑶14+单核细胞中TNF- α和IL_6mRNA的表达，并将TNF- α，IL-6表达水平与miR-155的表达做关联分析。
【具体实施方式】
[0043]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并提出micr0-RNA155在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。具体地，miR-155在动脉粥样硬化小鼠的血清中升高，oxLDL在巨噬细胞中显著活化可miR-155的表达；miR-155在oxLDL诱导的巨噬细胞中增强脂质吞噬和活性氧生成；降低miR-155的水平可以抑制小鼠动脉粥样硬化的形成。miR-155还可以作为筛选预防和治疗动脉粥样硬化的靶点。在此基础上完成了本发明。
[0044]miRNA-155 及其前体
[0045]本发明提供了涉及预防和治疗动脉粥样硬化相关的micro-RNA 155。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有I扩25个核苷酸(nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
[0046]人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0047]miRNA 可从前体 miRNA (Precursor miRNA, Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在5(Tl00bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
[0048]前体miRNA可被剪切生成成熟的miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%,99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
[0049]如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
[0050]本发明所述的 miRNA-155是指:miRNA_155或经修饰的miRNA-155衍生物、和与miRNA-155功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物。在本发明的一个优选例中，miRNA-155 的核苷酸序列如 SEQ ID N0.:1 (5' -UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3')所示。
[0051]在另一优选例中，所述的微小RNA (miRNA)来源于人或非人哺乳动物。
[0052]所述的“与miRNA-155功能相同或基本相同”是指保留了 miRNA-155的≥40%,≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的调节动脉粥样硬化的功能。
[0053]本发明还包括miRNA-155变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-155进行修饰，修饰方式包括(但不限于):甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
[0054]根据本发明所提供的miRNA-155序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。
[0055]由此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA-155，所述的前体miRNA-155可被人细胞剪切且表达成所述的 miRNA。
[0056]作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构:[0057]Seq 正向-X-Seq 反向
[0058]式II
[0059]式II 中，
[0060]Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-155的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq&@为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，seqi@为与seqi@基本上互补的核苷酸序列；X为位于seqi@和seq&@之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqil^和Seq&@不互补；
[0061]式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构:
[0062]
【权利要求】
1.一种micro-RNA155抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述micro-RNA155抑制剂选自下组:micro-RNA155 抗体、micro_RNA155 结合蛋白、micro_RNA155 小分子抑制剂、micro_RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro_RNA155 海绵、或其组合。
3.一种可用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括: 药学上可接受的载体；和 有效量活性成分，所述的活性成分为micro-RNA155抑制剂。
4.如权利要求3所述的药物组合物,其特征在于,所述micro-RNA155抑制剂选自下组:micro-RNA155 抗体、micro_RNA155 结合蛋白、micro_RNA155 小分子抑制剂、micro_RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro_RNA155 海绵、或其组合。
5.一种筛选用于预防或治疗动脉粥样硬化潜在物质的方法，其特征在于，包括步骤: (1)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物；和 (2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中miR-155的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的miR-155的表达水平降低，则 是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的检测体系是细胞体系；较佳地为巨噬细胞体系。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤: (3):分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。
8.一种预防或治疗动脉粥样硬化的方法，其特征在于，给需要的对象施用权利要求3所述的药物组合物。
9.一种诊断/检测动脉粥样硬化的方法，其特征在于，包括步骤: 分别检测待测样本和阴性对照样本miR-155的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-155的表达水平提高，则是潜在的动脉粥样硬化疾病患病样本。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的提高是指:与阴性对照样本相比，相应miRNA-155的表达水平的提高幅度> 5%，较佳地> 10%，较佳地> 20%，较佳地> 50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。
【文档编号】A61K39/395GK103768601SQ201210406314
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】荆清, 田福举, 李青, 王国坤, 邹俊 申请人:中国科学院上海生命科学研究院