双功能肽、所述双功能肽与核酸分子形成的复合物以及治疗肿瘤的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种双功能肽，所述的双功能肽包含癌细胞凋亡肽和穿膜肽。本发明还涉及一种由所述双功能肽与核酸分子形成的复合物及其在治疗肿瘤中的用途。本发明还涉及一种用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物，包含所述的双功能肽、肿瘤治疗基因和化学治疗药物，以及其在治疗肿瘤中的用途。本发明所涉及的双功能肽能够诱导癌细胞凋亡和促进肽及其复合物跨越细胞膜。而且本发明所述的药物组合物将双功能肽、肿瘤治疗基因和化疗治疗药物结合起来，不但可以降低化疗药物的给药量从而明显减少其对生物体的毒副作用，同时可以更好地对肿瘤细胞的生长进行抑制，有效对抗肿瘤的多药耐药现象。
【专利说明】双功能肽、所述双功能肽与核酸分子形成的复合物以及治疗肿瘤的药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，更具体而言，本发明涉及一种双功能肽，所述双功能肽能够诱导癌细胞凋亡和促进肽及其复合物跨越细胞膜。同时，本发明还涉及一种由所述双功能肽与核酸分子形成的复合物、包含所述复合物和抗癌的化学治疗药物的组合物，以及他们的用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤一直以来都威胁着人类的生命。据世界卫生组织报道，癌症的发病率逐年升高，并且呈现年轻化趋势。但是，在临床肿瘤化疗过程中，尽管新的化疗药物不断出现，化疗方案不断改进，仍有超过90%的癌症患者死于不同程度的肿瘤耐药；另一方面，临床上在对恶性肿瘤病人进行化学治疗时，给予的药物剂量一般为“可耐受的最大剂量”，而绝大部分抗肿瘤药物缺乏对肿瘤细胞的选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也产生严重的全身不良反应。因此，如何在保证化疗药物有效杀灭肿瘤细胞的同时，通过各种方式，减少化疗药物的用量，减少毒副反应，以保护机体的正常细胞、组织和器官免于细胞毒药物的损害，是目前医学科研工作者们研究的重要课题之一。
[0003]同时，肿瘤组织十分复杂，包含有各群、各期和各型的肿瘤细胞。例如，肿瘤由增殖细胞群(干细胞)，非增殖细胞群(G0期细胞)，无增殖能力细胞群组成；此外还有化疗后产生的耐药细胞群。其中，增殖细胞群(干细胞)又 由Gl期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(细胞分裂前期)和M期(细胞分裂期)构成。而肿瘤化疗药物的作用机制大多是单一的，所以很难用一种药物来抑制和杀灭肿瘤。
[0004]美国国立癌症研究所已经提出，癌症的治疗可以借鉴艾滋病，单独使用一种药物效果很差，而联合使用时作用极有可能得到增强，因此对于癌症的治疗，也可采取“鸡尾酒”疗法。在已公开的文献中，Thierry Conroy等研究了 342位胰脏癌初级阶段的患者并发现，用奥沙利钼(Oxaliplatin)、伊立替康(Irinotecan)、亚叶酸|丐(Leucovorin)以及氟尿嘧唳(fluorouracil)四种化疗药物联合用药与单一使用吉西他滨(Gemcitabine)相t匕，可以提高胰脏癌患者平均存活率高达6成(参见文献Conroy T, Desseigne F，YchouMjet al.F0LFIRIN0X versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.The NewEngland Journal of Medicine 2011，364:1817-1825) ;Massague 等人研究发现同时抑制了四个导致乳腺癌癌细胞转移至肺部的基因与一次只抑制一个基因相比可以更有效地阻止癌症转移(参见文献 Gupta GP, Nguyen DXj Chiang AC，Bos PD，Kim JT，Nadal C，GomisRRj Manova-Todorova K，MassagueJ.Mediators of vascular remodelling co-opted forsequential steps in lung metastasis.Nature 2007，446:765-770) ;van Vlerken 等将可以诱导凋亡的神经酰胺与化疗药紫杉醇联用(参见文献van Vlerken LEj Duan Z，LittleSR，Seiden M，Amiji MM.Augmentation of therapeutic efficacy in drug-resistanttumor models using ceramide coadministration in temporal—controlledpolymer-blend nanoparticle delivery systems.The AAPS journal 2010,12:171-180)；Lee等将中药成分丹参酮引入阿霉素多药耐药细胞，可以增强耐药细胞对阿霉素的吞噬(参见文献 Lee WYff, Cheung CCM, Liu KffK, Fung KP, Wong J, Lai PBS, Yeung JHK.Cytotoxiceffects of tanshinones from salvia miltiorrhiza on doxorubicin-resistant humanliver cancer cells.Journal ofnatural products 2010，73:854-859)。这些“鸡尾酒，，疗法，联合两种及以上的药物治疗恶性肿瘤，凭借药物间的药效作用互为补充并增强，己在临床上体现出明显的效果。
[0005]但是，也有研究报道，全部由化学治疗药构成的“鸡尾酒”体系有增加副作用的危险，接受这种疗法的患者产生了更多样的副作用，包括:疼痛、末稍神经无知觉、没有食欲、腹泻与体重减轻等，这预示着今后癌症治疗的发展方向将从通过化学治疗药直接杀伤癌细胞到将化学药物、基因药物、分子生物学靶向药物、天然植物提取物等联合起来进行“鸡尾酒”疗法，来控制癌细胞的增殖和肿瘤的发展，甚至预防肿瘤的发生。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终得到本发明。
[0007]本发明的一个目的是提供一种双功能肽，所述双功能肽是含有癌细胞凋亡肽和穿膜肽的重组多肽，其能够诱导癌细胞凋亡和促进肽及其复合物跨越细胞膜，其中，带正电荷的穿膜肽部分不仅可以作为非病毒基因载体包裹治疗基因，而且还可以结合生物膜磷酸盐端基上的负电荷从而推动整个多肽及其复合物进入细胞质。在本发明的双功能肽中，所述癌细胞凋亡肽位于所述双功能肽的N端，所述穿膜肽位于所述双功能肽的C端。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述双功能肽作为非病毒基因载体的用途。
[0009]本发明的另一个目的是提供由所述双功能肽与核酸分子形成的复合物。
[0010]本发明的又一个目的是提供所述双功能肽与核酸分子形成的复合物的用途。
`[0011]本发明的还一个目的是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物不但可以降低化疗药物的给药剂量从而明显减少其对生物体的毒副作用，同时可以更好地对肿瘤细胞的生长进行抑制，而且根据“耐药即凋亡抑制”的理论，还更为有效地对抗肿瘤的多药耐药。
[0012]在对肿瘤发生机制的研究中，发现了一些在细胞凋亡的途径中有着极其重要作用的蛋白。Verhagen AM 和 Du C 等发现了 Smac 蛋白(second mitochondrial derivedactivator of caspase)。当机体接受凋亡刺激后，Smac蛋白从线粒体膜间腔释放进入细胞质，通过与多种IAP (凋亡抑制蛋白)相互作用，去除凋亡抑制蛋白IAP介导的对caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)启动酶和效应酶的抑制。成熟Smac蛋白只在凋亡受到异常阻滞的肿瘤细胞内行使其促凋亡作用而并不引起健康细胞的凋亡。同时，Smac氨基末端的四肽(Ala-Val-Pro-1Ie，AVPI)能发挥大部分结合并且抑制IAPs的功能活性。可以设想，运用从Smac蛋白衍生的、含AVPI的多肽分子可以中和减弱IAPs对于caspases的抑制作用，达到与Smac相似的效果，使肿瘤细胞对于凋亡变得敏感而更加容易被杀死。
[0013]随着肿瘤分子生物学和免疫学理论及技术的发展和完善，人们认识到癌症是一种内在多种前癌基因激活和抑癌基因失活的基因病。因此，基因治疗对于彻底根治肿瘤具有重要意义。Journal of Gene Medicine对2011年在临床基因治疗中所用载体的类型和各期基因临床试验的情况进行了调查，在所有应用的基因中，用于肿瘤治疗的基因占了很大的比例，如自杀基因(suicide gene)、肿瘤抑制基因(tumor supressor gene)等。据文献报道，p53 基因(人 p53 编码框为:catggaggag ccgcagtcag atcctagcgt cgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatgg aaactacttc ctgaaaacaa cgttctgtcc cccttgccgtcccaagcaat ggatgatttg atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag acccaggtccagatgaagct cccagaatgccagaggctgc tccccgcgtg gcccctgcac cagcagctcc tacaccggcggcccctgcac cagccccctcctggcccctg tcatcttctg tcccttccca gaaaacctac cagggcagctacggtttccg tctgggcttcttgcattctg ggacagccaa gtctgtgact tgcacgtact cccctgccctcaacaagatg ttttgccaactggccaagac ctgccctgtg cagctgtggg ttgattccac acccccgcccggcacccgcg tccgcgccatggccatctac aagcagtcac agcacatgac ggaggttgtg aggcgctgcccccaccatga gcgctgctcagatagcgatg gtctggcccc tcctcagcat cttatccgag tggaaggaaatttgcgtgtg gagtatttggatgacagaaa cacttttcga catagtgtgg tggtgcccta tgagccgcctgaggttggct ctgactgtaccaccatccac tacaactaca tgtgtaacag ttcctgcatg ggcggcatgaaccggaggcc catcctcaccatcatcacac tggaagactc cagtggtaat ctactgggac ggaacagctttgaggtgcgt gtttgtgcctgtcctgggag agaccggcgc acagaggaag agaatctccg caagaaaggggagcctcacc acgagctgcccccagggagc actaagcgag cactgcccaa caacaccagc tcctctccccagccaaagaa gaaaccactggatggagaat atttcaccct tcagatccgt gggcgtgagc gcttcgagatgttccgagag ctgaatgaggccttggaact caaggatgcc caggctggga aggagccagg ggggagcagggctcactcca gccacctgaagtccaaaaag ggtcagtcta cctcccgcca taaaaaactc atgttcaagacagaagggcc tgactcagactga)在结肠癌、乳腺癌和肝癌等人源肿瘤中的突变率很高(>50%)。用正常的P53基因替代突变的p53基因，能够恢复肿瘤细胞的DNA修复或修复失败启动凋亡的能力，当前，在结肠癌、乳腺癌、肝癌等人源肿瘤的治疗中，P53都取得了较好的效果。
[0014]本发明通过研究在化疗药物单一体系中引入癌细胞凋亡肽AVPI和治疗基因p53，得到一种对普通细胞 毒性较小，而对肿瘤和多药耐药性肿瘤细胞具有高效细胞毒作用的治疗体系。本发明人发现，单一的AVPI肽片段不易穿透细胞膜，很难到达细胞内发挥作用。因此，增强耐药细胞对AVPI的吞噬能力是将凋亡肽引入肿瘤治疗体系的关键。
[0015]因此，根据一个方面，本发明提供了一种双功能肽，所述双功能肽包含癌细胞凋亡肽和穿膜肽。
[0016]由于具有生物活性的穿膜肽都具有能够促进肽链穿过细胞膜的作用，因此本申请中所述的穿膜肽包括但不限于，富含阳离子的八聚精氨酸，这是因为具有生物活性的穿膜肽可以包括富含碱性氨基酸的穿膜肽和具有两亲性的穿膜肽，二者都可以促进细胞对凋亡肽的吞噬。但是为了使这段肽链同时具有包裹、压缩、转运外源DNA的作用，可以选取富含碱性氨基酸的穿膜肽序列。
[0017]本发明中，优选地，所述癌细胞凋亡肽可为smac蛋白的N端序列AVPI ;所述穿膜肽可为聚精氨酸1--(11=5-12)。
[0018]本发明中，更优选地，所述双功能肽的氨基酸序列可为AVPIRRRRRRRR。
[0019]本发明中，上述双功能肽可以通过本领域的常规技术(例如，固相合成法)制备。具体可以为:将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸用无水DMF溶解，加入催化剂，与树脂相互作用使其充分固定在树脂上。封闭活性氯、脱去Fmoc保护基。取一定量的Fmoc保护的氨基酸、2- (7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和适量的N，N- 二异丙基乙胺(DIEA)进行缩合。检验氨基酸反应完全后，脱去Fmoc保护基。重复步骤，依次完成所需氨基酸的缩合。合成完毕后，洗涤树脂，真空干燥。用切肽试剂将肽切落，收集滤液，旋蒸浓缩，沉淀，抽滤，洗涤，干燥，得产品。
[0020]因此，本发明在不破坏凋亡肽的生物活性的情况下，提供一种用穿膜肽进行修饰的修饰方法。富含碱性氨基酸残基的穿膜肽片段容易与细胞膜作用并帮助整个肽链进入细胞，由此能够提高细胞对肿瘤凋亡肽的摄取量。
[0021]因此，本发明的双功能肽的多肽序列，能够同时作为基因载体和凋亡肽的修饰成分，使得治疗基因和凋亡肽能同时进入同一个细胞，协同发挥作用。
[0022]根据另一个方面，本发明提供了所述双功能肽作为非病毒基因载体的用途。
[0023]根据再一个方面，本发明提供了由上述双功能肽与核酸分子形成的复合物。所述核酸分子包括DNA、反义寡核苷酸、RNA等。例如，报告基因、肿瘤治疗基因(例如，p53基因、肿瘤自杀基因、肿瘤抑制因子基因、血管生成抑制因子基因等)、小分子干扰RNA等。
[0024]上述复合物的制备方法包括以下步骤:将上述双功能肽和核酸分子分别溶解，然后混合、静置，制得由双功能肽与核酸分子形成的复合物。
[0025]具体地，首先将核酸分子用40mM的Tris-HCl缓冲液稀释，将双功能肽溶解于NaCl溶液(150mM，pH 7.4)中，过滤灭菌。然后将该溶液与核酸溶液按照需要的重量比(w/w)直接混合，用NaCl溶液稀释，涡旋震荡5s混合均匀，制备成所需的复合物溶液，将该复合物溶液在37°C环境下静置半小时，得到双功能肽与核酸分子形成的复合物。本发明中，所述双功能肽与核酸分子的质量比优选为10:1-50:1，更优选为30:1。
`[0026]此外，本发明还提供了一种带有长烷基链的双功能肽，其可作为两亲性胶束来负载抗癌的化学治疗药物和/或核酸分子。
[0027]本发明中，所述带有长烷基链的双功能肽可为在上述双功能肽的肽链的C端上增加C12~C18的直链烷基链(优选为十二烷基)的双功能肽。
[0028]本发明中，所述带有长烷基链的双功能肽在水溶液中能够自发地形成胶束，其中，脂肪链组成胶束的疏水核，可以用于包载抗癌的化学治疗药物。
[0029]本发明中，所述抗癌的化学治疗药物包括但不限于，阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶
坐寸ο
[0030]本发明中，所述带有长烷基链的双功能肽的制备方法可以参照标准的“多肽固相合成法”手动合成(参考文献:Fields, G.B.，and Noble, R.L.(1990) Solid phasepeptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids.1nt.J.Pept.Res.35, 161-214)。具体可以是，多妝链段是在2-氯-二苯甲基氯树脂上，从羧基端向氨基端延长。通过加入溶解有Fmoc-ADDA-OH的DMF溶液进行缩合反应，并加入DIEA用于催化反应，将肽链的第一个氨基酸12-氨基十二酸固定于树脂上。此后在连接氨基酸残基延长肽链时，均采用Fmoc保护的氨基酸。
[0031]因此，本发明提供了一种能够包载抗癌的化学治疗药物的双功能肽胶束，其包含上述带有长烷基链的双功能肽和抗癌的化学治疗药物。
[0032]本发明中，所述能够包载抗癌的化学治疗药物的双功能肽胶束的制备方法可以为:将上述带有长烷基链的双功能肽与抗癌的化学治疗药物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，通过透析制得。
[0033]因此，本发明提供了一种由上述能够包载抗癌的化学治疗药物的双功能肽胶束与核酸分子形成的复合物。
[0034]因此，本发明的双功能肽是一种序列来自于自然界、生物相容性好的肽类，作为新型非病毒基因载体，能够包裹、压缩和转运肿瘤治疗基因。
[0035]根据又一个方面，本发明提供了上述双功能肽与核酸分子和抗癌的化学治疗药物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。 [0036]本发明中，所述肿瘤包括所有实体瘤，优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌等等，但不限于上述肿瘤。
[0037]本发明中，所述抗癌的化学治疗药物包括但不限于，阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶
坐寸o
[0038]根据再一个方面，本发明提供了一种用于对抗肿瘤和/或肿瘤多药耐药现象的药物组合物，所述药物组合物包括:上述双功能肽、肿瘤治疗基因和抗癌的化学治疗药物。其中，优选地，在药物组合物中，所述双功能肽所占的质量百分比可为20%-85%。
[0039]本发明中，所述双功能肽可以达到将肿瘤凋亡肽和肿瘤治疗基因同时有效运输到细胞中的目的；与化疗药物联用，达到增加疗效，同时减少化疗药用量减少毒副作用的效果。
[0040]同时，本发明提供了一种制备上述用于对抗肿瘤和/或肿瘤多药耐药现象的药物组合物的方法，包括以下步骤:
[0041](a)合成所述的双功能肽；
[0042](b)任选地，在步骤(a)获得的双功能肽的C端引入靶向肽；
[0043](C)将所得的双功能肽作为载体，与核酸分子形成复合物，其中，双功能肽与核酸分子的质量比为50:1-10:1，优选30:1 ；
[0044](d )在步骤(c )获得的复合物中弓丨入抗癌的化学治疗药物，化学治疗药物占所述药物组合物的重量百分比为20%_80%。
[0045]本发明中，优选地，步骤(b)中所述靶向肽的序列结构包括RGD，CREKA, SMSIARL
坐寸o
[0046]本发明中，优选地，化学治疗药物可以是在肿瘤临床治疗中应用广泛，但毒副作用很强，且已有众多癌细胞对其产生耐药性的阿霉素，但并不局限于阿霉素。
[0047]此外，本发明还提供了一种用于对抗肿瘤和/或肿瘤多药耐药现象的药物组合物，所述药物组合物包括:上述带有长烷基链的双功能肽、肿瘤治疗基因和抗癌的化学治疗药物。
[0048]同时，本发明提供了一种制备上述用于对抗肿瘤和/或肿瘤多药耐药现象的药物组合物的方法，包括以下步骤:
[0049](a)制备上述带有长烷基链的双功能肽，形成双功能肽胶束；
[0050](b)通过空白胶束载药法或透析法将步骤(a)获得的双功能肽胶束制备成载抗癌的化学治疗药物的载药多肽胶束；
[0051](C)将步骤(b)获得的载药多肽胶束与肿瘤治疗基因复合得到所述药物组合物。[0052]优选的，步骤(a)得到的双功能肽胶束的序列为Avpirrrrrrrrc12。
[0053]本发明的用于对抗肿瘤和/或肿瘤多药耐药现象的药物组合物，具有以下优点:一方面，新型无毒的双功能肽类载体，能够同时将凋亡肽和治疗基因转运到肿瘤细胞中?’另一方面，凋亡肽和治疗基因引入后，启动肿瘤凋亡程序，并增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，此时联合低剂量的化疗药物，完全可能达到增效减毒的效果。
[0054](I)阻断核酸合成的化学治疗药阿霉素与诱导癌细胞凋亡的凋亡肽联合应用，通过凋亡肽可使细胞对化学治疗药物更为敏感，能起到协同抗肿瘤效果。从预实验可知，这种协同作用尤其表现在高度耐阿霉素的耐药细胞中。
[0055](2)利用修饰凋亡肽的阳离子氨基酸序列静电结合治疗基因进入细胞后，通过修正突变基因，诱导癌细胞凋亡，可达到药物和基因协同抑制肿瘤增长的效果。基因的治疗终将可能成为根治恶性肿瘤的方法之一。
[0056](3)双功能肽中的碱性氨基酸序列(R8)在这个体系中发挥三重作用:①作为穿膜肽，携带凋亡肽序列进入细胞；②作为阳离子肽，复合带负电荷的治疗基因p53 作为穿膜肽，其进入细胞膜的可能机制之一是多肽与膜双分子层之间的电荷作用引起双分子层的破坏，阿霉素有可能通过暂时的孔洞进入细胞中，抵消耐药细胞的P-gp蛋白泵对阿霉素的栗出。
[0057](4)在整个药物组合物中，凋亡肽和治疗基因都对普通细胞无毒性，同时由于这两者与阿霉素联用的协同作用，阿霉素可在较小的剂量下达到更好的效果，从而减少了化疗药物的毒副作用和细胞产生多药耐药的可能。
[0058](5)阿霉素通过物理共混的方式进入这个体系时，更容易控制体系中三种成分的比例以及加入的先后顺序和间隔时间。
[0059](6)阿霉素通过载药胶束`进入这个体系时，可以保证化疗药物，治疗基因，凋亡肽同时进入同一个细胞，且可以更好地对抗肿瘤耐药现象。
[0060]本发明还提供了用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物在用于制备治疗肿瘤的药物中的用途。
[0061 ] 其中，所述肿瘤包括正常肿瘤和耐药肿瘤。
[0062]其中，所述肿瘤包括所有实体瘤，优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌等等，但不限于上述肿瘤。
[0063]同时，我们的研究表明，针对近年来流行的“耐药即凋亡抑制”的理论来对抗肿瘤的耐药性，通过多肽作为载体，转运凋亡肽和治疗基因，调控癌细胞自身的凋亡机制，不但有效，更重要是不会引起新的毒副反应，还有一定的预防肿瘤多药耐药的可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0064]图1为根据本发明制备实施例1中的AVPIRRRRRRRR的结构图。
[0065]图2为根据本发明制备实施例2中的Fmoc保护的12-氨基十二酸的制备图。
[0066]图3为使用根据本发明的药物组合物对抗肿瘤及肿瘤多药耐药的机理图。
[0067]图4为根据本发明实验实施例1中的AVPIRRRRRRRR/p53的粒径图。
[0068]图5为根据本发明实验实施例1中的AVPIRRRRRRRR/p53的电位图。
[0069]图6为根据本发明实验实施例1中的AVPIRRRRRRRR/pGL-3的基因转染结果图。[0070]图7为根据本发明实验实施例2中的双功能肽AVPIRRRRRRRR对普通细胞293T，癌细胞HeLa、MCF-7和耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖的抑制效果。
[0071]图8为根据本发明实验实施例2中的AVPI与化疗药物DOX联用时对耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖的抑制效果。
[0072]图9为根据本发明实验实施例2中的双功能肽AVPIRRRRRRRR与化疗药物对耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖的抑制效果。
[0073]图10为根据本发明实验实施例2中的双功能肽和治疗基因的复合物，即AVPIRRRRRRRR/p53对普通癌细胞和耐药癌细胞增殖的抑制效果。
[0074]图11为根据本发明实验实施例2中的药物组合物的体外效果。即包含凋亡肽AVPIRRRRRRRR、治疗基因和化疗药物的药物组合物对普通细胞293T细胞增殖的抑制效果。
[0075]图12为根据本发明实验实施例2中的药物组合物的体外效果。即包含双功能肽AVPIRRRRRRRR、治疗基因和化疗药物的药物组合物对癌细胞HeLa细胞增殖的抑制效果。
[0076]图13为根据本发明实验实施例2中的Avpirrrrrrrrc12的临界胶束浓度的结果图。
[0077]图14为根据本发明实验实施例2中的药物组合物的体外效果。即包含含有C12长直链烷基链的双功能肽Avpirrrrrrrrc12、治疗基因和化疗药物的药物组合物对癌细胞HeLa细胞增殖的抑制效果。
[0078]图15为根据本发明实验实施例3中的包含双功能肽AVPIRRRRRRRR、治疗基因和化疗药物的药物组合物(其中，阿霉素的给药量为0.5mg/kg，给药方式为每两天瘤内注射一次)对荷B16实体瘤C57小鼠的肿瘤抑制情况。
[0079]图16为根据本发明实验实施例3中的药物组合物，即包含含有C12长直链烷基链的双功能肽Avpirrrrrrrrc12、治疗基因和化疗药物(其中，阿霉素的给药量为0.5mg/kg，给药方式为每两天瘤内注射一次)对荷B16实体瘤C57小鼠的肿瘤体积的抑制情况。
[0080]图17为根据本发明实验实施例3中的药物组合物各组的肿瘤照片。
【具体实施方式】
[0081]下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
[0082]试剂和药品
[0083]氨基被9-芴甲氧羰基 保护的各种氨基酸、苯并三氮唑-N，N，N’ N’ -四甲基脲六氟憐酸盐(JffiTU)以及 2-氯-三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin, 100~200目，取代度0.4mmol/g, 1%DVB)购于上海吉尔生化有限公司，直接使用。哌唳(Piperidine)、三氟乙酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、苯酚、硬脂酸均购自国药集团(上海)化学试剂公司，直接使用。苯甲硫醚(Thioanisole)于Acros购得。二异丙基乙胺(DIEA)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)购自上海化学试剂公司，加无水硫酸镁干燥，重蒸后使用。阿霉素(Doxorubicin，D0X)购于浙江海正药业公司。人源宫颈癌细胞(HeLa)，人类胚胎肾细胞(293T)，小鼠黑色素瘤细胞(B16)购于中国典型培养物保藏中心(武汉)。DMEM细胞培养基干粉，噻唑蓝(3-(4，5-Dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)，胰蛋白酶(Trypsin),胎牛血清(FBS),双抗(penicillin-streptomycin)分别从Gibco 和 Invitrogen 购得。
[0084]制备实施例1
[0085]双功能肽AVPIRRRRRRRR的合成
[0086]a:取Ig的二氯三苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl chloride resin)至多肽合成装置(Aldrich fritted filter funnel),加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)浸泡树脂半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂DMF。
[0087]b:称取两当量的Fmoc-Arg(pbf)-OH用DMF溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂二异丙基乙胺(DIEA(M=129.25), >6eq.)，室温下让Fmoc-Arg(pbf)-0H与树脂相互作用1.5小时,使其充分固定在树脂上。
[0088]c:用DMF洗涤树脂。
[0089]d:甲醇封闭活性氯:甲醇/DMF (体积比1:4)与6当量的DIEA反应30_40min。DMF洗树脂。
[0090]e:加入20mL的20%哌啶/DMF (V/V)溶液到上一步的树脂中，反应30min，脱去Fmoc保护基。
[0091]f:用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验氨基是否裸露出来。
[0092]g:称取2当量的Fmoc-Arg(pbf)-0H，苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，1-羟基苯并三唑(HOBt)于称量瓶中，用DMF溶解，将该溶液转入到上步处理后的多肽合成装置中，再加入适量的DIEA (>4eq.)，缩合反应1.5小时。
[0093]h:用DMF洗涤树脂。用茚三酮检验氨基是否反应完全，若显无色则表明缩合完全可进行下一部操作；若显蓝色，则再缩合至检验为无色方可进行下一部操作。
[0094]1:加入20ml的20%哌啶/DMF (V/V=l/4)溶液到上一步的树脂中，反应30min，脱去Fmoc保护基。
[0095]j:用DMF洗涤树脂，用茚三酮检色。
[0096]k:重复 e, f, g, h 操作依次完成 Fmoc-Arg(pbf)_0H, Fmoc-Arg(pbf)_0H,Fmoc-Arg (pbf)-OH, Fmoc-Arg (pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg (pbf)-OH,Fmoc-1le-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH 的缩合。
[0097]1:用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验氨基是否反应完全，若显无色则表明缩合完全可进行下一部操作；若显蓝色，则再缩合至检验为无色方可进行下一部操作。
[0098]m:先用甲醇(MeOH)洗涤树脂，再用二氯甲烷(DCM)洗涤，充分洗干，于真空干燥箱中干燥24小时。
[0099]η:切肽:将含有三氟乙酸(TFA) (83%)、苯酚(6.3%)、苯甲硫醚(4.3%),H2O (4.3%)及EDT (2.1%)的混合溶液加入柱子中，反应20min，收集滤液，用少量DCM洗树脂，收集洗液，合并滤液和洗液，重复切落10次以上。
[0100]O:将所有滤液旋蒸浓缩，用适量的无水乙醚进行沉淀，静置。沉淀充分后，抽滤，洗涤，干燥，得AVPIRRRRRRRR产品。结构式如图1所示。
[0101]制备实施例2
[0102]avpirrrrrrrrc12/dox 载药胶束的制备[0103]Avpirrrrrrrrc12 的制备:
[0104]参照多肽固相合成法手动合成。多肽链段均是在2-氯-三苯甲基氯树脂上，从羧基端向氨基端延长，具体如下所述。首先称取一定量的2-氯-三苯甲基氯树脂，用DMF充分浸泡溶胀后，移去DMF。按照图2所示的合成方法，将肽链的第一个氨基酸12-氨基十二酸固定于树脂上，通过加入溶解有4当量Fmoc-ADDA-OH的DMF溶液进行缩合反应，并加入6当量DIEA用于催化反应，吸收盐酸，反应2h后，用DMF洗涤数次，然后用甲醇封闭未反应的活性氯基团，再用DMF洗涤数次。脱除肽链末端氨基上的Fmoc保护基团均使用20%哌啶/DMF (v/v)溶液，15minX2次，然后用DMF洗涤数次。此后在连接氨基酸残基延长肽链时，均采用4当量Fmoc保护的氨基酸，并用4当量HBTU及6当量DIEA溶解于DMF中活化羧基，然后加入到上述连接有肽链并已脱除Fmoc保护的树脂中，进行缩合反应，反应4h。反应完毕，用茚三酮的甲醇溶液(10mg/ml)验证氨基是否缩合完全，若溶液发蓝或发红表示缩合不完全，重复缩合步骤，若溶液为明亮黄色或未变色，表示此步缩合反应完成，继续脱除Fmoc保护基，按氨基酸序列延长肽链。待肽链合成结束，依次用DMF、DCM洗涤树脂数次。切落剂将多肽从树脂上切落，收集滤液，旋转蒸发浓缩，然后用冰乙醚沉淀，反复洗涤几次，过滤收集，真空干燥。
[0105]AVPIRRRRRRRRC12/DOX 载药胶束的制备:
[0106]直接将多肽Avpirrrrrrrrc12溶解于水中，在5.2mg/L时即可自组装形成胶束结构，胶束的形成通过荧光光谱，以疏水性的芘为探针得以证实。从图13中可以看到，如(a)图所示，荧光激发光谱的峰强度随多肽浓度的增加而增加，并且出现了明显的红移，最高峰从338nm (Il)移至342nm (13)，这说明胶束结构已经形成，并且芘从外层亲水环境进入了胶束疏水性内核。如(b)图所示，定义曲线水平方向切线和突变后与拐点相交的切线的在低浓度的交点为多肽的临界胶束浓度(CMC)，而测定的多肽胶束的CMC为5.2mg/L。由于CMC值较低，因而有望将这种多肽在如人体体液之类较稀释的环境中用于药物包载传递。
`[0107]载药胶束的制备方法主要如下所述:将多肽(IOmg)与DOX (2mg)溶解于5ml 二甲基亚砜(DMSO)中，之后将溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，将其放入装有2000ml二次蒸馏水(pH 7.0)的烧杯中对水透析约24h，每隔4h换水一次以除去DMSO及未被胶束包载的药物。
[0108]制备实施例3
[0109]AVPIRRRRRRRR/p53/D0X构成的药物组合物的制备
[0110]量取5 Ii L p53的TE溶液(200ng/ii L)加入1.5mL的无菌离心管中，按照不同的w/w比，加入相应的AVPIRRRRRRRR溶液与DNA混合，最后补加NaCl溶液(150mM)至100 y L，混合震荡5s后在37°C下孵育30min，得到AVPIRRRRRRRR/p53复合物。再将此复合物与一定量的化疗药物DOX的NaCl溶液共混。
[0111]制备实施例4
[0112]AVPIRRRRRRRRC12/DOX/p53构成的药物组合物的制备
[0113]将包载有药物的多肽胶束冷冻干燥，并将一定量的载药胶束溶于NaCl溶液中，同制备实施例3的方法，与p53形成药物组合物，即包含双功能肽、治疗基因、化疗药的药物组合物。
[0114]实验实施例1[0115]AVPIRRRRRRRR的体外转染实验
[0116](I)质粒提取
[0117]pGL-3质粒是编码荧光素酶的基因，本实施例中使用它作为报告基因。p53为本实施例中采用的治疗基因。PC53-SN3 (addgene.0rg)是p53基因的质粒载体。pGL_3和PC53-SN3在JM109大肠杆菌中转化，在LB培养基中以37°C，250rpm的培养箱中过夜培养来扩增。质粒的提取和纯化是使用Qiagen endotoxin-free plasmid Gigaprep试剂盒,通过去内毒素质粒纯化过程完成的。纯化后的质粒DNA在TE缓冲溶液脱柱并稀释至0.2mg/ml,保存于_20°C。质粒通过琼脂糖凝胶电泳和紫外260nm，280nm的吸收比值来验证纯度和产量。
[0118](2)双功能肽载体/DNA复合物的制备
[0119]量取5yL DNA的TE溶液(200ng/y L)加入1.5mL的无菌离心管中，按照不同的w/w比，加入相应的多肽溶液与DNA混合，最后补加NaCl溶液(150mM)至100 μ L，混合震荡5s后在37°C下孵育30min，得到多肽/DNA复合物。
[0120](3)双功能肽/DNA复合物粒径和ζ电位的测定
[0121]复合物的粒径和ζ电位由纳米粒度分析仪Nano-ZS ΖΕΝ3600 (MalvernInstruments公司生产)测定。每个复合物样品补加900 μ LNaCl溶液(150mM)使总体积至lmL，混合均匀后加到样品池中进行粒径测试。结果如图4所示。同时，另取每个复合物样品补加900 μ L去离子水使总体积至lmL，混合均匀后加到样品池中进行ζ电位测定。结果如图5所示。
[0122](4)复合物的体外转染实验
[0123]本实验主要采取293Τ细胞和HeLa细胞两种细胞系为实验对象，使用外源质粒DNApGL-3转染，研究了 AVPIRRRRRRRR/DNA复合物在体外的转染效率，jetPEI?(线性PEI25kDa，PolyPlus-transfection公司)为对照。复合物体外转染方法如下:将两种细胞系分别以6X IO4个/孔的密度接种到24孔板中，在培养箱(371:、5%0)2)中培养24h。按照实验实施例I中(2)的方法制备复合物，最后补900 μ L的无血清DMEM培养基或含10%血清的DMEM培养基至总体积lmL。转染实验前将孔内的旧培养基吸弃，加入上述几种复合物与无血清或有血清培养基的混合液，与细胞共同培养4h。然后将含复合物的培养基吸出，重新加入ImL新鲜的含10%FBS的DMEM培养基继续培养48h。实验结束后，移弃培养基，然后用PBS(0.1M, pH 7.4)轻轻润洗细胞。每孔加入200 μ L裂解液(Promega)反复冻融三次，并充分吹打以裂解细胞。吹打后的细胞裂解液以I X 105rpm离心，取20 μ L上清与荧光素酶底物(Promega) 100 μ L混匀震荡30s，在化学发光仪(LumatLB9507，Berthold)上测定荧光素酶的活性。细胞裂解液中的蛋白浓度，通过将上清加入96孔板，用蛋白测定试剂(Pierce)检测，OD值在酶标仪(Thermo，USA) 570nm下读取。每个样品做3个平行样测量取平均值，表示为平均值土标准偏差(SD)。细胞中表达的荧光素酶活性用RLU/mg蛋白表示。结果见图6所示。最佳转染效率出现在AVPIRRRRRRRR:pGL-3为30:1的时候。
[0124]实验实施例2
[0125]MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴蓝，商品名:噻唑蓝)法分别测定双功能肽(AVPIRRRRRRRR)，双功能肽和治疗基因复合物(AVPIRRRRRRRR/p53)，双功能肽和化疗药联合应用(AVPIRRRRRRRR+D0X)，以及包含双功能肽、治疗基因、化疗药的药物组合物(AVPIRRRRRRRR/p53+D0X)的体外抗肿瘤效应以及AVPIRRRRRRRRC12与化疗药形成胶束后与治疗基因构成的药物组合物(AVPIRRRRRRRRC12/D0X/p53)的体外抗肿瘤效应
[0126]将对数生长期的293T、Hela, MCF_7、MCF-7/ADR细胞分别消化后稀释成密度为
1.5 X IO4个细胞/ mL的细胞悬液，转移到Corning的96细胞培养孔板中，每孔加入200 μ L细胞悬液，用含10%小牛血清的1640完全培养基培养24h (37°C，5%C02)。
[0127]通过预实验确定最佳药物浓度范围，加入不同浓度的溶液，每个浓度做6个复孔。培养48小时，加入MTT (5mg/mL，购自美国Amresco公司)20μ L，培养4h，加DMSO 200 μ L,震荡使结晶物充分溶解混匀。用酶标仪(型号:51119300FI，Fisher)测定各组OD值，主波长为570nm，参考波长为490nm。计算各组的细胞增殖抑制率:增殖抑制率(％)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值X 100%。
[0128]结果如下:
[0129](I)双功能肽AVPIRRRRRRRR对普通细胞293T，癌细胞HeLa、MCF-7，耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖率的影响:如图7所示，在浓度0.2mg/mL到lmg/mL之间，对普通细胞几乎无毒性；对癌细胞HeLa、MCF-7均有比较明显的毒性，在浓度0.8mg/mL时，癌细胞HeLa、MCF-7存活率不足50% ;对耐药癌细胞也有一定的毒性。
[0130](2)单一的AVPI和化疗药DOX (阿霉素)联合应用对耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖率的影响:如图8所示，在整个实验过程中，在很高的AVPI浓度下(lmg/mL)，配合阿霉素(2-20mg/L),对耐药肿瘤细胞也无明显的杀伤能力。这应当是由于单一的AVPI不易穿透细胞膜，很难到达细胞内发挥作用。
[0131](3)按照制备实施·例1得到的双功能肽AVPIRRRRRRRR对耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖率的影响:如图9所示，其中，AVPIRRRRRRRR浓度为lmg/mL，阿霉素的浓度依次为
2-20mg/L，在每个阿霉素浓度下，AVPIRRRRRRRR的引入都有明显增强DOX对耐药细胞杀伤能力的效果。这说明了穿膜肽能够携带凋亡肽穿透细胞膜，发挥其促凋亡作用，增加其对化疗药的敏感性。
[0132](4)双功能肽和治疗基因复合物AVPIRRRRRRRR/p53对普通癌细胞HeLa和耐药癌细胞MCF-7/ADR增殖率的影响:如图10所示，在这种情况下，固定p53的浓度为5 μ g/孔，AVPIRRRRRRRR浓度大于等于0.8mg/mL时，两种细胞的存活率均不足50%。
[0133](5)按照制备实施例3得到的药物组合物(双功能肽和治疗基因复合物AVPIRRRRRRRR/p53,与DOX构成的药物组合物)对普通细胞293T和癌细胞Hela的影响:如图11和图12所示，药物组合物对于普通细胞没有明显的毒性，等同于单独使用其中的化疗药时造成的毒性；而对于癌细胞则有明显的协同增强杀伤力的效果。
[0134](6)按照制备实施例4得到的药物组合物(含长烷基链的双功能肽Avpirrrrrrrrc12与化疗药物形成的胶束和治疗基因avpirrrrrrrr构成的药物组合物)对癌细胞Hela的影响:如图14结果显示，多肽包裹药物形成胶束后对肿瘤细胞HeLa有较强的杀伤能力，且包裹治疗基因P53后形成的药物组合物杀伤力增强。
[0135]实验实施例3
[0136]包含双功能肽、治疗基因、化疗药组合的药物组合物的体内抗肿瘤实验
[0137](1)B16鼠源黑色素荷瘤裸鼠模型的建立
[0138]将对数生长期的B16细胞经0.25%胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备5 X IO6个细胞/ ml的细胞悬液。取体质量为18-22g的C57小鼠(购自上海斯莱科实验动物有限公司)35只，在裸鼠背部皮下注射细胞悬液100 μ I/只。观察Β16细胞在C57小鼠体内的生长和成瘤情况。
[0139](2)荷瘤裸鼠AgNP抗肿瘤效应
[0140]当肿瘤体积为IOOmm3左右时将其随机分成7组:
[0141]DOX (0.5mg/kg.2d)组、DOX (0.5mg/kg.2d)+AVPIRRRRRRRR 组、D0X(0.5mg/kg.2d) +Avpirrrrrrrrc12 组、dox(0.5mg/kg.2cI)+avpirrrrrrrr/p53 组、dox(0.5mg/kg.2d)+AVPIRRRRRRRRC12/p53组，以生理盐水组为阴性对照组，以DOX (2.5mg/kg.d)为阳性对照组。各组均使用瘤周注射方式给药，每次给药量为200 μ L/只，每两天给药一次。给药期间每天测定瘤的长径(L)、短径(S)，计算肿瘤体积:V=LXS2/2。给药21天后，将裸鼠脱臼处死，取下肿瘤，小心去除瘤表明的血迹及包膜，称重，按照下述公式计算抑瘤率:
[0142]抑瘤率(%)= (I — T/C) X 100%
[0143]其中，T:治疗组平均瘤重；C:阴性对照组平均瘤重。
[0144]图15，16为给药过程中的肿瘤体积增长率图。从图中可以看出，相对于阿霉素(0.5mg/kg/2d)组，可以看到组合药物给药组的肿瘤有明显的减小。同时还可以发现，含有治疗基因P53的组别在抑制肿瘤生长时起效时间较晚，初期没有明显的优势，到后期时有相当明显的抑制效果。这应当是由于P53在动物肿瘤组织内的表达和发挥作用需要一个过程。图16与图15相比，可以看到含有长烷基链的AVPIR8C12在体内实验中相较于AVPIR8有更好的效果。图17则直观地显示了给药完成后各组的肿瘤照片。从图中可以看出，注射生理盐水组的小鼠肿瘤明显较大，而组合药物组有明显的减小。
[0145]在整个实验过程中可以观察到，本发明的组合药物给药体系的毒性较低，整个实验过程中没有动物死亡和动物体重明显下降的情况。
[0146]综上，本发明的双功能肽的穿膜肽可有效地介导凋亡肽穿透进入细胞内部，再与治疗基因复合，作为药物组合物中的两个重要组成部分，可以显著增强化疗药的抗肿瘤效果。对肿瘤细胞的体外体内的生长抑制作用都表现出了明显的作用。同时，本发明的药物组合物对耐药肿瘤细胞也具有显著的作用。
【权利要求】
1.一种双功能肽，其特征在于:所述的双功能肽包含癌细胞凋亡肽和穿膜肽。
2.根据权利要求1所述的双功能肽，其特征在于:所述癌细胞凋亡肽为smac蛋白的N端序列AVPI ;所述穿膜肽为聚精氨酸Rn，其中n=5-12。
3.根据权利要求1或2所述的双功能肽，其特征在于:所述双功能肽的氨基酸序列为AVPIRRRRRRRR。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双功能肽，其特征在于:所述双功能肽为带有长烷基链的双功能肽，其中，所述带有长烷基链的双功能肽为在所述双功能肽的肽链的C端上增加C12飞18的直链烷基链的双功能肽。
5.一种由根据权利要求1-4中任一项所述的双功能肽与核酸分子形成的复合物。
6.根据权利要求5所述的复合物，其特征在于:所述核酸分子包括DNA、反义寡核苷酸和RNA，优选地，所述核酸分子选自报告基因、肿瘤治疗基因和小分子干扰RNA，更优选地，所述核酸分子为选自P53基因、肿瘤自杀基因和血管生成抑制因子中的一种或多种。
7.权利要求5或6所述的复合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
8.一种用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物，其特征在于:包含权利要求1-3中任一项所述的双功能肽、肿瘤治疗基因和化学治疗药物。
9.根据权利要求8所述的用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物，其特征在于，由以下步骤制备得到:` (a)合成如权利要求1-3中任一项所述的双功能肽； (b)任选地，在步骤(a)获得的双功能肽的C端引入靶向肽； (C)将所获得的双功能肽作为载体，与核酸分子形成复合物，其中，所述双功能肽与所述核酸分子的质量比为50:1-10:1，优选为30:1 ； (d)在步骤(C)获得的复合物中引入抗癌的化学治疗药物，其中，化学治疗药物所占药物组合物的重量百分比为20-80%。
10.如权利要求9所述的用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物，其特征在于:步骤(b)中所述靶向肽的序列结构包括RGD、CREKA或SMSIARL。
11.一种用于对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物，其特征在于，由以下步骤制备得到: Ca)制备如权利要求4所述的双功能肽，形成双功能肽胶束； (b)通过空白胶束载药法或透析法将步骤(a)获得的双功能肽胶束制备成载抗癌的化学治疗药物的载药多肽胶束； (c)将步骤(b)获得的载药多肽胶束与肿瘤治疗基因复合得到所述药物组合物。
12.权利要求1-4中任一项所述的双功能肽、核酸分子和抗癌的化学治疗药物用于制备对抗肿瘤和肿瘤多药耐药现象的药物组合物的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于:所述肿瘤包括正常肿瘤和耐药肿瘤，优选地，所述肿瘤包括黑色素癌实体瘤和宫颈癌实体瘤，更优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌。
【文档编号】A61K48/00GK103788211SQ201210432105
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年11月1日
【发明者】黄永焯, 王慧媛 申请人:中国科学院上海药物研究所