专利名称：一种防龋dna疫苗及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于口腔预防医学技术领域，具体涉及一种防龋DNA疫苗及其制备方法与应用。
背景技术：
龋病的发病率仅次于流感，严重影响人类健康和生存质量。由于我国人口众多、医疗资源有限，龋病的发病率远远高于发达国家，研制易于普及的龋病疫苗以防治龋病、降低龋病发病率对于保障国民健康显得尤为重要。变形链球菌(Streptococcus mutans下称变链菌)能够与牙面紧密粘附并定植于牙面，产生酸性代谢产物，引起牙齿脱矿最终导致龋齿，是人类主要的致龋菌。葡糖基转移酶(glucosyltranferaes GTFs)和表面蛋白(surface protein antigen PAc),葡聚糖结合蛋白(glucan-bind proteins, GBPs)及变形链球菌壁相关蛋白A (wall-associated protein A gene, wapA)是变形链球菌的重要抗原物质。这些抗原成分参与介导细菌的粘附，在免疫学方面有重要意义。现在所研究变链菌的防龋疫苗多利用这几种抗原物质，将这几种基因编码的DNA疫苗载入体内，可诱导血液、唾液中相应IgG、slgA抗体的产生，有效控制频病的发生和发展。有Hong Qian和My Lien Dao的研究表明wapA与细菌聚集相关(HongQian and My Lien Dao.1nactivation of the Streptococcus mutans Wall-AssociatedProtein A Gene(wapA)Results in a Decrease in Sucrose Dependent Adherence andAggregation.1nfect Immun，1993. 61 (12) : 5021-5028)。Lin Zhu 和 Jens Kreth 等通过实验证明wapA在细菌非蔗糖依赖性的聚集中扮演了重要角色，Real-time RT-PCR显示蔗糖对wapA的基因有抑制作用，鹿糖浓度降低后，wapA开始大量表达(Zhu Lj Kreth Jj CrossSE，et al. Functional characterization of cell-wall-associated protein WapA inStreptococcus mutans. Microbiology, 2006, 152 (8) :23952404)。Thomas K. Han 等经过一系列的体外实验认为WapA起了双重粘附作用，介导了葡聚糖和细胞外基质蛋白(尤其是I 型胶原)的粘附(Han TKj Zhang C，Dao ML.1dentification and characterization ofcollagen-binding activity in Streptococcus mutans wall-associated protein:Apossible implication in dental root caries and endocarditis. Biochem Biophys ResCommun. 2006，343(3) : 787-792)。目前尚无文献报道将wapA用于制备DNA疫苗，并应用于防龋的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防龋DNA疫苗，本发明的另一目的是提供该防龋DNA疫苗的其制备方法与应用。本发明提供了一种防龋DNA疫苗，是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体PVAXl质粒构成，由于单纯的DNA疫苗进入人体后很快会被核酸酶降解，很难进入细胞，为了进一步提高DNA疫苗的免疫能力，本发明将该DNA疫苗以壳聚糖作为载体制备成壳聚糖纳米复合物，以期刺激机体免疫应答，产生抗wapA抗体,阻断变形链球菌的粘附和菌斑形成，从而应用于抗龋齿。本发明提供了一种防龋DNA疫苗，该疫苗中的DNA是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体PVAXl质粒构成。所述的一种防龋DNA疫苗，该疫苗中的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的另一方面，提供了上述的防龋DNA疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤(I) wapA蛋白全长表达基因的克隆；
以UA159基因组为模板扩增获得wapA蛋白全长基因后，根据wapA蛋白全长表达序列(GENBANK号NC_004350. 2)及pVAXl/lac z质粒序列设计并合成如下引物
pVAXl-wapA-F CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT(如SEQ ID NO:2 所示)；pVAXl-wapA-R CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA(如SEQ ID NO:3 所示)；(2) pVAXl-wapA重组质粒的构建；将(I)中获得的rapA基因片段插入到pVAXl (pVAXl/lac z)质粒中，构建pVAXl-wapA重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH_5 α，重组质粒酶切鉴定正确后送测序，序列如SEQ ID NO:1所示(3) DNA疫苗壳聚糖纳米复合物的制备；壳聚糖(CS)溶解在NaAc缓冲液(ΡΗ=6. O)，与含有Na2SO4的pVAXl-wapA质粒溶液分别预先加热到50 55 , IOmin,等体积迅速混合，润旋Imin,室温放置30min,即得DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。所述的壳聚糖纳米复合物DNA疫苗的配方具体如下质粒pVAXl-wapA 364 μ I (含有质粒 100 μ g)壳聚糖O. 5mg/ml, 364 μ INa2SO415mmol/L。本发明的第三方面，提供了上述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用。所述的防龋是指防止非蔗糖依赖型龋齿的形成。本发明将防龋靶标wapA应用于防龋DNA疫苗的制备之中，利用wapA蛋白在非蔗糖依赖型龋齿形成中的重要作用，扩大了 DNA疫苗在防龋免疫中的应用范围。同时，本发明将利用壳聚糖纳米粒无毒、安全、有效的穿细胞能力，制备DNA疫苗壳聚糖纳米复合物，从而提高DNA疫苗的免疫效率。本发明安全性高，能表达天然抗原，免疫应答持久，有效防龋。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。
图1是以变形链球菌UA159菌株基因组为模板克隆wapA全长基因电泳鉴定图；I PCR扩增产物，在1400bp有wapA条带2 marker2000o图2是pVAXl-wapA和pVAXl限制性内切酶酶切电泳鉴定I pVAXl-wapA经kpn I酶单酶切得到4. 3Kb片段2 PVAXI经kpn I和EcoR I双酶切得到3.1Kb片段3 pVAXl-wapA经kpn I和EcoR I双酶切得到3. OKb和1. 4Kb两个片段4 IOK marker ο图3是重组质粒pVAXl-wapA结构示意图；图4是凝胶阻滞实验电泳鉴定图；其中I为pVAXl-wapA，2为marker，3，4为DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。图5是壳聚糖纳米复合物在人胚肾293A细胞转染能力实验电泳鉴定图； 1-7:使用弓I物 pVAXl-wapA-F 如 SEQ ID NO: 2 所示；pVAXl-wapA-R 如 SEQ ID NO: 3 所示；9-10 :使用引物 wapRTf 如 SEQ ID NO:4 所示wapRTr 如 SEQ ID NO:5 所不1:去离子水2 :转染 Blank3:转染 pVAXl/lipo4 :转染 pVAXl-wapa5 :转染 pVAXl-wapa/cs6 :转染 pcdna-wapa/lipo7 pVAXl-wapa8 marker20009 :去离子水10 pVAXl-wapa11 marker2000o图6是小鼠血清IgG抗体浓度(血清样品1:600，000稀释)检测结果示意图；A 组 pVAXl-wapA/CS 纳米复合物B组pVAXl对照组C组CS溶液对照组。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pVAXl/lac z(购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录)；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为DH5a (购自GIBCO公司)；插入的外源基因为UA159变形链球菌的WapA基因。实施例1 :防龋DNA疫苗——pVAXl-wapA的构建一、变形链球菌的培养将冻存的变形链球菌UA159菌株(上海交通大学医学院附属第九人民医院赠送，参见文献黄正蔚、刘正、马瑞、唐子圣、朱彩莲，变形链球菌电击转化条件的优化研究，《中国微生态学杂志2007年第5期2页404-405页)划线培养与BHI平板培养基(商品化平板培养基，购自上海恒远生物科技有限公司)上，培养条件为37°C厌氧培养(80%N2 10%C0210%H2)o挑取平板上长出的单克隆接种至TY培养基(1% tryptone O. 8% yeast extractpH5. O)中，密闭条件下于37°C振荡培养。收集菌液用于后续试验。二、变形链球菌UA159菌株基因组的获得使用细菌基因组提取试剂盒(BacterialDNA Extraction Kit (Solution type),bioteke corporation)提取UA159基因组。步骤简述如下1、取2ml菌液，IOOOO rpm,离心30秒。弃上清,收集菌体,尽可能的吸净上清。2、加入200 μ I缓冲液RB重悬洗涤细胞，IOOOOrpm,离心30秒，弃上清后再次将菌体重悬于200 μ I缓冲液RB中。3、加入 50 100μ1 IysozymeC 10mg/ml inlOmM Tris-HCl, ρΗ8· 0),颠倒混勻，37°C温育30-60min。IOOOOrpm离心2min,弃上清后将菌体再次重悬于200 μ I缓冲液RB中。4、加入200 μ I结合液CB，立刻剧烈颠倒充分混匀，再加入20 μ I蛋白酶K (20mg/ml)，溶液，充分混匀，70°C放置lOmin。5、冷却后加入100 μ I异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。6、将上一步溶液及可能出现的絮状沉淀移至吸附柱AC中，(吸附柱套入收集管中)IOOOOrpm离心30s,弃废液。7、加入500 μ I抑制物去除液IR, 12000rpm离心30min,弃废液。8、加入700 μ I漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。9、加入500 μ I漂洗液WB, 12000rpm离心30s,弃废液。10、吸附柱AC放回收集管中，13000rpm离心2min。11、取出吸附柱AC，放入一干净离心管中，在吸附膜中部加100 μ I洗脱缓冲液EB(洗脱液65-70°C预热)，室温放置3-5min，12000离心lmin。三、wapA蛋白全长基因的克隆及载体构建为了获得wapA蛋白全长表达基因，以上述基因组为模板，设计合成引物如下pVAXl-wapA-F CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT(如SEQ ID NO:2 所示)；pVAXl-wapA-R CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA(如SEQ ID NO:3 所示)；并按下述PCR体系及扩增条件克隆wapA基因。PCR反应体系及扩增条件如表I和表2所示表1:PCR反应体系
权利要求
1.一种防龋DNA疫苗，其特征在于，该疫苗中的DNA是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体PVAXl质粒构成。
2.根据权利要求1所述一种防龋DNA疫苗，其特征在于，其中的DNA序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求2所述的一种防龋DNA疫苗，其特征在于，将该DNA疫苗以壳聚糖作为载体制备成壳聚糖纳米复合物。
4.一种如权利要求3所述的防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (A)wapA蛋白全长基因克隆； (B)pVAXl-wapA重组质粒的构建； (C)载pVAXl-wapA的壳聚糖纳米复合物DNA疫苗的构建。
5.根据权利要求4所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中的步骤(A)具体为 (a)变形链球菌的培养将变形链球菌UA159菌株的划线培养于BHI平板培养基上，以期获得单克隆菌株，培养条件为80%氮气、10% 二氧化碳、10%氢气、370C厌氧培养；挑取单克隆接种至TY培养基中，TY培养基为1%蛋白胨、0. 8%酵母浸粉、pH5. 0，37°C密闭振荡培养； (b)提取基因组以菌基因组提取试剂盒，提取UA159基因组； (c)wapA蛋白全长基因克隆 设计并合成如下引物，以变形链球菌UA159基因组为模板扩增获得wapA蛋白全长基因pVAXl-wapA-F 如 SEQ ID NO:2 所示；pVAXl-wapA-R 如 SEQ ID NO: 3 所示。
6.根据权利要求4所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中的步骤(B)具体为 将步骤(A)获得的wapA基因片段插入到pVAXl质粒中，构建pVAXl-wapA重组质粒,将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5 a，提取纯化的重组质粒pVAXl-wapA作为DNA疫苗。
7.根据权利要求4所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中的步骤(C)具体为 壳聚糖溶解在NaAc缓冲液，PH=6. 0，与含有Na2S04的pVAXl-wapA溶液分别预先加热到50 55°C, IOmin,等体积迅速混合,润旋Imin,室温放置30min,即得DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。
8.根据权利要求7所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述的DNA疫苗壳聚糖纳米复合物，组成和配比如下 质粒pVAXl-wapA 364 iil，其中含有质粒100 y g， 壳聚糖0. 5mg/ml, 364 ii I Na2SO415mmol/L。
9.一种如权利要求1、2或3所述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用。
10.根据权利要求8所述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用，其特征在于，所述的防龋是指防止非蔗糖依赖型龋齿的形成。
全文摘要
本发明属于口腔预防医学技术领域，本发明提供了一种防龋DNA疫苗，从变形链球菌UA159基因组中提取壁连相关蛋白A(wapA)蛋白全长基因并克隆至真核表达载体pVAX1中。为了提高其免疫能力，本发明还将该疫苗以壳聚糖为载体制备成壳聚糖纳米复合物。本发明还提供了该防龋DNA疫苗的制备方法以及应用。本发明的防龋DNA疫苗安全性高，能表达天然抗原，免疫应答持久，有效防龋。
文档编号A61P1/02GK103007262SQ20121059260
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者李洪娇, 陆一鸣, 向婧洁, 王少海, 鲁莹, 汪大林 申请人:中国人民解放军第二军医大学