基于铁氧化物纳米颗粒的用于淋巴系统造影术的mri对比剂和使用所述mri对比剂用于使 ...的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于淋巴结对比成像的对比剂、使用前述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用前述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。使用这样的贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物的表面并使其在水中很好地分散以制备胶体溶液，其进而形成包含所述胶体溶液的对比剂。本发明的对比剂没有毒性并且容易被摄取到淋巴结，从而表现出优良的对比成像效应。本发明的对比剂可用于诊断转移癌。
【专利说明】基于铁氧化物纳米颗粒的用于淋巴系统造影术的MRI对比剂和使用所述MRI对比剂用于使淋巴结成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于对比增强淋巴系统造影术(contrast enhanced lymphography)的对比剂(contrast agent)以及使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物(mussel adhesive protein-mimeticcopolymer)在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。更特别地，所述贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)(PE1-接枝-(PEG; HXffA))。接枝聚合物由两部分构成，一部分包含接枝有对水性介质具有亲和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺(有时缩写为“聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”)，并且另一部分是对纳米颗粒表面具有亲和力的聚3，4-二羟基苯丙氨酸(PDOPA)。本发明涉及用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂，其包含通过以下方法制备的胶体溶液:使用前述的贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物颗粒的表面，然后将所述颗粒分散在水中。本发明涉及使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法。
【背景技术】
[0002]纳米颗粒有着广泛的应用，例如纳米电子会聚技术(nano-electronicconvergence technology)、体内成像技术、医学应用等。具体地，超顺磁性铁氧化物纳米颗粒广泛用于多种生物医学应用，包括例如磁共振成像(“MRI”)对比剂、细胞疗法、体温过高、药物递送、细胞分离、核酸制备等。
[0003]在生物医学应用中对于应用来说的最重要的要求主要是确保高品质纳米颗粒，并且还允许纳米颗粒在水性介质中具有优良的分散性和稳定性。本文中，高品质纳米颗粒可意指具有以下特征的纳米颗粒:(i)粒径均一性，(ii)粒径容易控制，(iii)颗粒结晶度，(iv)控制颗粒形态的可能性等。
[0004]但是，在本领域中商业可得的纳米颗粒大多数在水性体系中合成或者可通过在气相中合成得到。由前述方法产生的纳米颗粒难以制备形状均一的颗粒并且一般显示出低的结晶度。另外，难以制造大小均一的纳米颗粒并且难以控制粒径。
[0005]最近，已进行了许多研究来开发用于在有机体系中制备金属氧化物纳米颗粒的新方法，所述金属氧化物纳米颗粒与根据相关领域在水性体系中合成的纳米颗粒相比具有相对闻的品质(即均一的大小和有利的结晶度)。
[0006]同样地，在纳米颗粒于有机溶剂中合成的情况下，纳米颗粒的均一性和大小控制有时可通过在合成期间使用有机添加剂使所述纳米颗粒稳定来实现。在这一点上，因为纳米颗粒的表面状况受疏水有机添加剂影响，所以金属氧化物纳米颗粒可容易地分散在疏水有机溶剂中。但是，当将它们与水混合时，它们没有足够的稳定性。
[0007]对于在有机溶剂中制备的这样的纳米颗粒，纳米颗粒表面的疏水性质可阻碍纳米颗粒在水中的稳定分散，从而引起用于生物医学应用中的问题。因此，为了将纳米颗粒用于前述应用，需要开发生物相容性分散稳定剂，其改良(或修饰)纳米颗粒表面以具有亲水性质并且确保合适条件使其在水性介质中均匀分散。此外，还需要开发使用前述生物相容性分散稳定剂制备的纳米颗粒胶体溶液，其中所述分散状态在水性体系中稳定维持。
[0008]在根据相关领域的技术将纳米颗粒分散在水性体系中的方法中，目前在Journalof American Chemical Society, 2005，127，4990中公开了使用二氧化娃薄层。根据前述文章，将聚氧乙烯壬基苯基醚引入环己烷溶液中并与所述环己烷溶液混合以形成微胶束乳滴(micro-micelle emulsion drop)。接着,诱导四乙基原娃酸盐(TEOS)的溶胶-凝胶反应(sol-gel reaction),用二氧化娃层包被纳米颗粒后分散在水中。以上文件描述了用亲水二氧化硅层包被纳米颗粒外侧以使纳米颗粒分散在水中的方法，其中所述纳米颗粒在有机溶剂中制备。在这种情况下，使用微乳剂的二氧化硅包被方法引起了这样的问题:因为仅一次的待包被纳米颗粒的量非常少，所以在单次过程中制造的水性体系中纳米颗粒分散体的量也大大降低。而且，微乳剂的条件根据在单次过程中制造的纳米颗粒胶体的量或聚氧乙烯壬基苯基醚的量而改变。因此，难以精细地调节二氧化硅层的期望厚度，难以实现包被颗粒的均一性，这是因为二氧化硅层中所含纳米颗粒的数目被改变。在纳米颗粒由二氧化硅层稳定的情况下，相关领域中的前述技术引起了这样的问题:二氧化硅表面上的硅烷官能团不足够稳定而是彼此反应，因此，包被有二氧化硅并且分散在水中的纳米颗粒发生组合并随时间凝聚。结果，难以确保分散体经长时间的储存稳定性。
[0009]近些年中，已在Journal of America Chemical Society (2005，127，4556)中公开了使用由氧化膦和聚乙二醇构成的聚合物使纳米颗粒在水中分散的方法。更具体地，前述文章描述了纳米颗粒分散方法，其中，在聚乙二醇与1，2-双(二氯膦基)乙烷反应以合成含有键合在一起之聚乙二醇的聚合物之后，使聚合物与分散在疏水溶剂中的纳米颗粒经历配体交换反应，从而使纳米颗粒能够稳定分散并且使所述纳米颗粒在水中均一分散。所公开的方法使用简单的制备方法并且利用配体交换使纳米颗粒在水中分散。但是，由于磷原子(P)易于氧化并变为磷酰基，所以包被聚合物必须在使用氮气或氩气的惰性气氛下合成。另外，由于聚合物是交联状态，所以引入官能团结合体内的功能配体(例如DNA、RNA、单克隆抗体或其他功能蛋白)的问题仍然存在。
[0010]最近，研究者对将贻贝作为生物粘附剂的潜在来源进行了许多研究。贻贝产生并分泌功能分化的粘性物质，从而允许贻贝在海洋环境中静止或固定在水中，所述海洋环境的特征在于盐度、湿度、潮流、湍流、波动等。贻贝使用由其足部(leg)分泌的纤维束构成的丝(thread)强力地粘附于水中的物质表面。在每条纤维末端，存在包含防水粘附剂的板状物(plaque)以允许贻贝粘附于湿的固体表面。这样的丝状蛋白(thread protein)包含大量的3，4- 二羟基苯基-L-丙氨酸(D0PA)，它是通过使用多酚氧化酶使酪氨酸基团羟基化得到的氨基酸。DOPA侧枝(side branch)上的3，4-二羟基苯基(儿茶酹)可与亲水性表面产生非常强的氢键和/或与金属离子、金属氧化`物(Fe3+、Mn3+)、半金属(硅)等强力键合。
[0011]转移癌的发生明确影响癌症的预后和治疗。转移癌的发生可通过淋巴结转移的存在与否来确定并且转移性淋巴结癌的发生目前通过外科手术活检淋巴结来诊断。但是，这是一种有创性方法(invasive method),对于患者和医师二者都具有很大困难。另一方面，可采用无创性技术(例如使用CT、MR1、PET等)来检测转移癌的发生，但是导致的问题是癌一般在其尺寸为5mm或更大时才可被检测到。因此，仍然需要能够无创性诊断尺寸相对小的转移癌的方法。[0012]已介绍了通过将铁氧化物纳米颗粒注入体内并且使用磁共振成像示出淋巴结上的铁氧化物沉积物来检测转移癌的方法(MukeshG.Harisinghani, M.D., JelleBarentsz, M.D., Ph.D., PeterF.Hahn, M.D., Ph.D., WiIIemM.Deserno, M.D., ShahinTabatabaei, M.D., Christine HulsbergenvandeKaa, M.D., Ph.D., JeandelaRosette, M.D., Ph.D.和RalphffeissIeder, M.D., Ph.D., NewEnglandJournalofMedicine2003;348:2491-2499)。根据所公开的方法，在使用亲水性物质稳定水性体系中的铁氧化物纳米颗粒之后，将经处理的纳米颗粒引入体内，并且在预定时间后通过MRI观察带有癌的淋巴结组织以及正常的淋巴结组织。根据所观察结果之间的不同，可诊断癌症的发生。使用前述方法，AMAGC0.(美国)
开发了用于对比增强淋巴系统造影术的MRI对比剂，称为wCOiVIB丨DEX_e但是，上述对比剂在体内施用后经常引起不良作用和/或具有不良选择性，因此没有被广泛使用。因此，仍然需要开发用于对比增强淋巴系统造影术的改良的基于铁氧化物之对比剂，其具有优良选择性且不良作用降低。
【发明内容】
[0013]技术问题
[0014]因此，由于克服相关领域中的前述问题的深入且广泛的努力，本发明人完成了这样的生物相容性分散稳定剂，其可将纳米颗粒表面改良为亲水状态以使纳米颗粒在水性体系中分散；并且发现了使用所述生物相容性分散稳定剂(所述稳定剂)可使纳米颗粒能够在水性体系中分散并稳定(“分散稳定”)，从而有效用于生物医学应用。另外，还发现，由本发明生物相容性分散稳定剂分散并稳定的纳米颗粒可应用于纳米电子融合【技术领域】(例如量子点(Q点)发光装置)、生物成像领域(例如MRI对比剂)、组织工程领域(例如细胞疗法)、生物医学领域(例如体温过高、药物递送)等。
[0015]本发明的一个目的是提供用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂，其包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中分散和稳定的铁氧化物纳米颗粒，其中通过模拟贻贝蛋白的简单方法将多种纳米颗粒的表面改良为亲水状态，使得纳米颗粒在水性介质中稳定分散，同时使其能够用于生物医学领域中。
[0016]本发明的另一个目的是提供使用前述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法。
[0017]本发明的另一个目的是提供使用前述对比剂诊断淋巴结癌症的方法。
[0018]问题的解决方案
[0019]在一个总的方面中，本发明提供了用于对比增`强淋巴系统造影术的对比剂、使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用所述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白模拟共`聚物在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。更特别地，所述贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4- 二羟基苯丙氨酸)(PE1-接枝-(PEGJDOPA))，其包含接枝有对水性介质具有亲和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺(有时缩写为“聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”)和对纳米颗粒表面具有亲和力的聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PD0PA)。本发明还提供了用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂、使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用所述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过以下方法制备的胶体溶液:使用前述贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物颗粒的表面，然后将所述颗粒分散在水中。
[0020]下文中，将更详细地描述本发明。
[0021]用于本发明的贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4- 二羟基苯丙氨酸)(PE1-接枝- (PEGJDOPA))，其包含接枝有对水性介质具有亲和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺(有时缩写为“聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”)和对纳米颗粒表面具有亲和力的聚3，4-二羟基苯丙氨酸(PD0PA)，并且包含贻贝粘附氨基酸，即3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)。
[0022]为了制备聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇；聚3，4- 二羟基苯丙氨酸)，首先使聚乙二醇和聚乙烯亚胺通过共价键组合以形成聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇。将所形成的产物用作生物相容性大分子引发剂(macro-1nitiator)。
[0023]本文使用的聚乙二醇可以是数均分子量为300至50，000并且在其末端具有羟基
或羧基的聚乙二醇。根据本发明的一个实施方案，所述聚乙二醇是在一端具有甲氧基并且在另一端取代有羧基的甲氧基聚乙二醇羧酸。
[0024]本文使用的聚乙烯亚胺可以是没有毒性的支化聚乙烯亚胺，其数均分子量为100至10，100，优选100至2，000。如果支化聚乙烯亚胺的数均分子量小于100，则本发明所产生的共聚物不能与因此有用的生理活性物质合适地组合。另一方面，当数均分子量为10，100或更大时，可导致上述物质难以通过肾脏从身体中排泄出来。因此，本发明优选使用数均分子量在前述范围中的聚乙烯亚胺。
[0025]用于本发明的聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PDOPA)可以是具有3，4_ 二羟基苯丙氨酸(DOPA)作为单体的缩合聚合物。重复单元通过酰胺键连接。重复单元的数目范围为I至100。聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PDOPA)可使用以下多种偶联方法通过固相合成和液相合成来聚合:碳化二亚胺介导的反应、对称酸酐法、混合酸酐法、活性酯法、叠氮化物法、酰氯法和N-羧酸酐(N-carboxyanhydride)法。提供前文所述的这样的实例方法以清楚理解聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PD0PA)。但是，聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PDOPA)不限于通过上述方法合成的聚合物。用于本发明的聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PDOPA)可通过前文所述的几种方法制备，优选通过N-羧酸酐法制备。
[0026]用于本发明的聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)可包含:由以下结构(A)表示的聚乙二醇单元、由以下结构(B)表示的聚乙烯亚胺单元和由以下结构(C)表示的聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PD0PA)。
[0027]
【权利要求】
1.用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂，其包含: 通过聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的对比剂，其中所述铁氧化物纳米颗粒的直径为I至25nm。
3.根据权利要求1所述的对比剂，其中在所述水性介质中分散的所述铁氧化物纳米颗粒的水动力学直径为3至lOOnm。
4.根据权利要求1所述的对比剂，其中所述聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)由聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚3，4- 二羟基苯丙氨酸构成，并且其中所述聚乙二醇的数均分子量为300至50，000并且在其一端具有羟基或羧基。
5.根据权利要求1所述的对比剂，其中所述聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)由聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚3，4- 二羟基苯丙氨酸构成，并且其中所述聚乙烯亚胺是数均分子量为100至10，100的支化型聚乙烯亚胺。
6.根据权利要求1所述的对比剂，其中所述聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)由聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚3，4- 二羟基苯丙氨酸构成，并且其中所述聚3，4- 二羟基苯丙氨酸(PDOPA)选自:由L-DOPA (L-3, 4- 二羟基苯丙氨酸)的N-羧酸酐合成的L-PD0PA、由D-D0PA(D-3, 4-二羟基苯丙氨酸)的N-羧酸酐合成的D-PDOPA和由L, D-DOPA的N-羧酸酐合成的L，D-PDOPA。
7.根据权利要求1所述的对比剂，其中所述聚乙烯亚胺-接枝_(聚乙二醇；聚3，4-二羟基苯丙氨酸)包含由结构A表示的聚乙二醇单元、由结构B表示的聚乙烯亚胺单元和由结构C表示的聚3，4- 二羟基苯丙氨酸单元:
[A]
8.根据权利要求7所述的对比剂，其中所述聚乙烯亚胺单元由以下结构表示:
9.用于对比增强淋巴系统造影术的方法，其使用根据权利要求1至8中任一项所述的对比剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中对比增强淋巴系统造影术的方法通过利用施用所述对比剂之前淋巴结的MRI信号与施用所述对比剂之后所述淋巴结的另一 MRI信号之间的MRI信号强度之变化或差异以使所述淋巴结对比成像来执行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过静脉注射进行所述对比剂的所述施用。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述淋巴结中MRI信号强度的所述变化基于T2信号强度的改变。
13.一种方法，其用于通过使用根据权利要求1至8中任一项所述的对比剂来诊断淋巴结癌症。
【文档编号】A61K49/08GK103458932SQ201280011330
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2011年6月22日
【发明者】朴炷锳, 明岏在, 全烽植, 金应奎, 权恩苾, 玄泽焕, 凌代舜 申请人:韩华石油化学株式会社