N末端修饰的胰岛素衍生物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含额外的一个或多个二硫键的新型N末端修饰的胰岛素衍生物、包含其的药物组合物及其制备方法。
【专利说明】N末端修饰的胰岛素衍生物 发明领域
[0001] 本发明涉及包含一个或多个额外的二硫键的新型N末端修饰的胰岛素及其制备 方法。
[0002] 发明背景 糖尿病是代谢病，在这种病中，利用葡萄糖的能力部分或完全丧失。该病症可以例如通 过施用胰岛素来治疗。
[0003] 到目前为止，口服途径是最广泛使用的药物施用途径。然而，由于一些障碍如在胃 肠（GI)道和肠粘膜中的酶促降解、药物流出泵、从肠粘膜吸收不足和变化、以及在肝中的 首过代谢，胰岛素的施用常常局限于肠胃外途径，而不是优选的口服施用。
[0004] 人胰岛素由两个多肽链组成，即A和B链，其分别包含21个和30个氨基酸残基。 A和B链通过两个二硫键相互连接。多种蛋白酶的作用使人胰岛素在胃肠道的内腔中迅速 降解，限制了其吸收进入循环。当与天然胰岛素相比，亲水的并且对蛋白水解性降解稳定的 胰岛素类似物在动物模型中表现出更高的生物利用度。
[0005] 将二硫键引入蛋白是改善蛋白稳定性一种天然方式。也有许多成功地将二硫键工 程改造进蛋白并伴随稳定性增加的实例。至今，没有胰岛素中工程改造的二硫键的报道。
[0006]WO2008/145721涉及某些肽，所述肽已经被N末端修饰以保护所述肽免于氨肽酶 和二肽基肽酶的降解。WO2010/033220描述了与聚合物和任选一个或多个具有最高达10 个碳原子的部分偶联的肽缀合物。
[0007] 治疗性肽的药物组合物需要具有数年的保存限期以适合于常规使用。然而，由于 对化学和物理降解的敏感性，肽组合物本质上是不稳定的。
[0008]WO08/145728、WO2010/060667 和WO2011/086093 公开了用于口服施用的脂质 药物组合物的实例。
[0009] 药物组合物经常含有浓度最高达200ppm的醛和酮。醛和酮可以与胰岛素反应， 因此引起组合物中胰岛素的大量的化学降解。作为结果，胰岛素组合物的保存限期可能低 于3个月。药物开发需要至少2年的保存限期。
[0010] 已知，出于稳定性目的，含水药物组合物可以包含化合物诸如乙二胺。例如，WO 2006/125763描述了包含乙二胺作为缓冲剂的含水药物多肽组合物。
[0011] 然而，仍然寻求在不将乙二胺或其它稳定化合物加入组合物的情况下使药物组合 物、特别是无水脂质组合物中的胰岛素稳定的方法。
[0012] 发明概述 本发明涉及由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末端修饰的胰岛素， 其中所述肽部分具有不存在于人胰岛素中的至少一个二硫键。
[0013] 在一个方面，本发明涉及由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末 端修饰的胰岛素，其中所述肽部分具有两个或更多个半胱氨酸取代，且保留了人胰岛素的 三个二硫键。
[0014] 在一个方面，本发明涉及包含两个或更多个半胱氨酸取代的N末端修饰的胰岛 素，其中保留了人胰岛素的三个二硫键，其中以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述 方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存 在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，并且其中所述N末端修饰的胰岛素具 有具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但不具有不存在于人胰 岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。在一个方面，N末端修饰 的胰岛素具有具有相同肽部分、存在于人胰岛素中的二硫键和相同白蛋白结合部分、但不 具有N末端修饰基团的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。
[0015] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素包含修饰基团，所述修饰基团为一个 或两个有机取代基，其各自具有低于200g/mol的分子量（MW)，且其缀合于亲本胰岛素 (parentinsulin)的N末端。
[0016] 本发明还涉及包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物。
[0017] 发明描述 本发明涉及新型N末端修饰的胰岛素，在本文中也命名为N末端保护的胰岛素，其中将 一个或多个二硫键工程改造进胰岛素。本发明的新型N末端修饰的胰岛素特别适合用于在 口服制剂中使用。因此，本发明的一方面也考虑了包含新型N末端修饰的胰岛素（其中将 一个或多个二硫键工程改造进胰岛素）的口服药物组合物。
[0018] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结 合部分组成。
[0019] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有两个或更多个半胱氨酸取代，并 且保留了人胰岛素的三个二硫键。
[0020] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有侧链。在一个方面，侧链连接于赖 氨酸残基的ε氨基。在一个方面，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基。
[0021] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有两个或更多个半胱氨酸取代，保 留的人胰岛素的三个二硫键以及连接于诸如B-链中的赖氨酸残基的ε氨基的侧链。
[0022] 在本发明的一个方面，以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述方式使得引 入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存在于人胰岛 素中的一个或多个额外的二硫键的形成。
[0023]本发明人已经令人惊讶地发现，本发明的N末端修饰的胰岛素在包含醛和/或酮 诸如微量醛和/或酮的药物组合物中是稳定的，同时当与亲本胰岛素即没有N末端修饰的 类似胰岛素相比时，所述胰岛素保留生物和药理性质。
[0024] 本发明人已经令人惊讶地发现，本发明的N末端修饰的胰岛素是物理稳定的并且 不易于产生原纤化，同时当与亲本胰岛素即没有N末端修饰的类似胰岛素相比时，所述胰 岛素保留生物和药理性质。
[0025] 在本发明的一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素用于含水制剂中，以用于皮 下注射胰岛素治疗。
[0026] 在本发明的一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素可用作超长效胰岛素，其或 者在含水制剂中以注射治疗或以口服治疗。
[0027] 在一个方面，除了赋予对醛和/或酮的化学稳定性之外，本发明的N末端修饰的胰 岛素的N末端修饰可以改变胰岛素受体亲和力。例如，如下文所述，在生理pH下使N末端 中性或带负电荷的N末端修饰可以为胰岛素受体赋予更低亲和力。
[0028] 本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，诸如本发明的酰化 的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其具有令人满意的生物利用度。与以相似剂量给 予的没有N末端修饰的相似胰岛素（亲本胰岛素）的生物利用度相比，本发明的优选的N 末端修饰的胰岛素的生物利用度是相似的。在一个方面，生物利用度比以相似剂量给予的 具有额外的一个或多个二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素的生物利用度高至少 10%，在一个方面生物利用度高至少20%，在一个方面生物利用度高至少25%，在一个方 面生物利用度高至少30%，在一个方面生物利用度高至少35%，在一个方面生物利用度高 至少40 %，在一个方面生物利用度高至少45 %，在一个方面生物利用度高至少50 %，在一 个方面生物利用度高至少55%，在一个方面生物利用度高至少60%，在一个方面生物利用 度高至少65%，在一个方面生物利用度高至少70%，在一个方面生物利用度高至少80%， 在一个方面生物利用度高至少90%，在一个方面生物利用度高至少100%，在一个方面生 物利用度比亲本胰岛素的高多于100%。
[0029] 当本文中使用时，术语"亲本胰岛素"应当是指没有N末端修饰的类似胰岛素。例 如，如果N末端修饰的胰岛素是酰化的N末端修饰的胰岛素，那么亲本胰岛素是具有相同肽 部分和相同白蛋白结合部分、但没有N末端修饰的酰化胰岛素，或者例如，如果N末端修饰 的胰岛素是酰化的蛋白酶稳定的N末端修饰的胰岛素，那么亲本胰岛素是具有相同肽部分 和相同白蛋白结合部分、但没有N末端修饰的酰化的蛋白酶稳定的胰岛素。
[0030] 在一个方面，生物利用度比以相似剂量给予的没有不存在于人胰岛素中的任何二 硫键的相似酰化且N末端修饰的胰岛素的生物利用度高至少10%，在一个方面生物利用度 高至少20%，在一个方面生物利用度高至少25%，在一个方面生物利用度高至少30%，在一个 方面生物利用度高至少35%，在一个方面生物利用度高至少40%，在一个方面生物利用度高 至少45%，在一个方面生物利用度高至少50%，在一个方面生物利用度高至少55%，在一个方 面生物利用度高至少60%，在一个方面生物利用度高至少65%，在一个方面生物利用度高至 少70%，在一个方面生物利用度高至少80%，在一个方面生物利用度高至少90%，在一个方面 生物利用度高至少100%，在一个方面，生物利用度比没有不存在于人胰岛素中的任何二硫 键的相似酰化且N末端修饰的胰岛素的生物利用度高多于100%。
[0031] 本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其 相对于作为静脉内ακ)施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修饰 的胰岛素为静脉内施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度（相对于静脉 内施用）是至少〇. 3%，在一个方面是至少0. 5%，在一个方面是至少1%，在一个方面是至 少1. 5%，在一个方面是至少2%，在一个方面是至少2. 5%，在一个方面是至少3%，在一个 方面是至少3. 5%，在一个方面是至少4%，在一个方面是至少5%，在一个方面是至少6%， 在一个方面是至少7%，在一个方面是至少8%，在一个方面是至少9%，在一个方面是至少 10%。
[0032] 本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其 相对于当作为s.c.(皮下）施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修 饰的胰岛素为皮下施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度（相对于皮下 施用）是至少0. 3%，在一个方面是至少0. 5%，在一个方面是至少1%，在一个方面是至少 I. 5%，在一个方面是至少2%，在一个方面是至少2. 5%，在一个方面是至少3%，在一个方 面是至少3. 5%，在一个方面是至少4%，在一个方面是至少5%，在一个方面是至少6%， 在一个方面是至少7%，在一个方面是至少8%，在一个方面是至少9%，在一个方面是至少 10%。
[0033]本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当皮下施用时，其 相对于当作为静脉内施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修饰的胰 岛素为静脉内施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度（相对于静脉内施 用）是至少10%，在一个方面是至少15%，在一个方面是至少20%，在一个方面是至少25%， 在一个方面是至少30%，在一个方面是至少35%，在一个方面是至少40%，在一个方面是至少 45%，在一个方面是至少50%，在一个方面是至少55%，在一个方面是至少60%，在一个方面是 至少70 %，在一个方面是至少80 %，在一个方面是至少90 %。
[0034]用于测量胰岛素生物利用度的标准试验对于本领域中技术人员是已知的，并且尤 其包括测量相同物种中口服和静脉内（i.v.)施用的、讨论中的胰岛素的浓度的曲线下的 相对面积（AUC)。血液（血浆）样品中胰岛素浓度的定量可以使用例如抗体测定（ELISA) 或通过质谱来完成。
[0035] 本发明的进一步方面涉及提供具有令人满意的效力的本发明的N末端修饰的胰 岛素。与人胰岛素的效力相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的效力可以是人胰岛 素的效力的至少5%，在一个方面是至少10%，在一个方面是至少20%，在一个方面是至少 30 %，在一个方面是至少40 %，在一个方面是至少50 %，在一个方面是至少75 %，和在一个 方面是至少100%。
[0036] 表观体内效力可以通过比较讨论的胰岛素与以相似剂量给予的比较胰岛素的血 糖对时间曲线来测量。测量体内效力的其它方法在在实施例中给出。
[0037]用于测量胰岛素体外效力的标准试验是本领域技术人员已知的，尤其包括下面的 试验：（1)胰岛素放射受体试验，其中将胰岛素的相对效力定义为替代特异性结合于例如 细胞膜，例如大鼠肝质膜部分上存在的胰岛素受体的50%的 125I-胰岛素所需的胰岛素和 胰岛素类似物/衍生物的比例；(2)脂肪生成试验，例如用大鼠脂肪细胞进行，其中将相对 的胰岛素效力定义为实现[3-?]葡萄糖向有机可提取的材料（即脂质）的最大转化的50% 所需的胰岛素和胰岛素类似物/衍生物的比例；(3)在分离的脂肪细胞中的葡萄糖氧化试 验，其中将胰岛素类似物/衍生物的相对效力定义为实现葡萄糖-1_[ 14C]向[14CO2]的最 大转化的50 %的胰岛素和胰岛素类似物/衍生物的比例；(4)胰岛素放射免疫测定法，其 可以通过测量胰岛素或胰岛素类似物/衍生物与125I-胰岛素竞争结合至特异性抗胰岛素 抗体的效果而测定胰岛素类似物/衍生物的免疫原性；以及（5)其它试验，其测量胰岛素 或胰岛素类似物或衍生物与抗体在动物血浆样品中的结合，诸如具有特异性胰岛素抗体的 ELISA试验。
[0038]本发明的N末端修饰的胰岛素可以具有延长的时间作用特征，即在高血糖例如糖 尿病患者中提供比人胰岛素持续更长的胰岛素作用。换言之，与人胰岛素相比，具有延长的 时间作用特征的胰岛素具有延长的葡萄糖水平的降低。在一个方面，本发明的N末端修饰 的胰岛素在单次施用胰岛素分子后提供持续约8小时至约2周的胰岛素作用。在一个方面， 胰岛素作用持续约24小时至约2周。在一个方面，所述作用持续约24小时至约1周。在 进一步的方面，所述作用持续约1周至约2周。在又进一步方面，所述作用持续约1周。在 又进一步方面，所述作用持续约2周。在一个方面，所述作用持续约1天至约7天。在一个 方面，所述作用持续约1天至约3天。在一个方面，所述作用持续约1天至约2天。在一个 方面，所述作用持续约2天至约3天。在进一步方面，所述作用持续约7天至约14天。在 又进一步方面，所述作用持续约7天。在又进一步方面，所述作用持续约14天。在一个方 面，所述作用持续约2天至约7天。在一个方面，所述作用持续约3天至约7天。在又进一 步方面，所述作用持续约3天。在又进一步方面，所述作用持续约4天。在又进一步方面， 所述作用持续约5天。在又进一步方面，所述作用持续约6天。在又进一步方面，所述作用 持续约7天。
[0039] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素在单次施用胰岛素分子后提供持续约 8小时至约24小时的胰岛素作用。在一个方面，胰岛素作用持续约10小时至约24小时。 在一个方面，所述作用持续约12小时至约24小时。在进一步方面，所述作用持续约16小时 至约24小时。在又进一步方面，所述作用持续约20小时至约24小时。在又进一步方面， 所述作用持续约24小时。
[0040] 在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约96小时。在一个方面，胰岛素作用持 续约24小时至约48小时。在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约36小时。在一个 方面，胰岛素作用持续约1小时至约96小时。在一个方面，胰岛素作用持续约1小时至约 48小时。在一个方面，胰岛素作用持续约1小时至约36小时。
[0041] 作用持续时间（时间-作用曲线）可以通过抑制血糖的时间，或通过测量相关药 代动力学特性，例如或MRT(平均停留时间）来测量。
[0042] 本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，其在口服施用后相 对于人胰岛素具有令人满意的延长作用。与人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的 胰岛素的作用持续时间长至少10%。与人胰岛素的持续时间相比，在一个方面，所述持续时 间长至少20%，在一个方面长至少25%，在一个方面长至少30%，在一个方面长至少35%，在一 个方面长至少40%，在一个方面长至少45%，在一个方面长至少50%，在一个方面长至少55%， 在一个方面长至少60%，在一个方面长至少65%，在一个方面长至少70%，在一个方面长至少 80%，在一个方面长至少90%，在一个方面长至少100%，在一个方面长多于100%。
[0043] 在一个方面，与每日一次的胰岛素诸如LysB29(Nε-十四烧酰基）desB30人胰岛 素或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的作用 持续时间长至少10%。与每日一次胰岛素诸如LysB29(Ne-十四烷酰基）desB30人胰岛素 或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰岛素的相比，在一个方面，所述持续时间长至少20%，在一 个方面长至少25%，在一个方面长至少30%，在一个方面长至少35%，在一个方面长至少40%， 在一个方面长至少45%，在一个方面长至少50%，在一个方面长至少55%，在一个方面长至少 60%，在一个方面长至少65%，在一个方面长至少70%，在一个方面长至少80%，在一个方面长 至少90%，在一个方面长至少100%，在一个方面长多于100%。
[0044] 在一个方面，与每日一次胰岛素诸如LysB29(Nε-十四烧酰基）desB30人胰岛素 或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的作用持 续时间长至少1〇〇%。与每日一次胰岛素诸如LysB29(Nε-十四烷酰基）desB30人胰岛素或 A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰岛素相比，在一个方面，所述持续时间长至少200%，在一个方 面长至少250%，在一个方面长至少300%，在一个方面长至少350%，在一个方面长至少400%， 在一个方面长至少450%，在一个方面长至少500%，在一个方面长至少550%，在一个方面长 至少600%，在一个方面长至少650%，在一个方面长至少700%，在一个方面长至少800%，在一 个方面长至少900%，在一个方面长至少1000%，在一个方面长多于1000%。
[0045]在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解，即针对胃肠 (GI)道中或身体其它部位的快速降解，是稳定的。在一个方面，相对于没有一个或多个额外 的二硫键的N末端修饰的胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解是稳 定的。在一个方面，相对于以相似剂量给予的具有一个或多个额外二硫键但没有N末端修 饰的相似酰化胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解是稳定的。
[0046]针对蛋白水解性降解稳定的N末端修饰的胰岛素在本文被理解为本发明的N末端 修饰的胰岛素，相对于人胰岛素，其经受由一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在一个实施方 案中，相对于人胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素经受由一种或多种蛋白酶的更慢的 降解。在本发明的进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对由一种或多种 酶的降解是稳定的，该酶选自：胃蛋白酶（诸如例如，同种型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白 酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶（诸如例如，同种型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋 白酶C)，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶（IDE)，弹性蛋白酶（诸如例如，同种型胰腺弹性蛋白酶 I和/或II)，羧肽酶（例如，同种型羧肽酶A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，组织蛋 白酶D及源自大鼠、猪或人的肠提取物中存在的其它酶。
[0047]在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳 定的，该酶选自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶（IDE)，弹性蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶 和组织蛋白酶D。在进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶 的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本发明的 N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和IDE。在仍 进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的， 该酶选自：糜蛋白酶和羧肽酶。
[0048] "蛋白酶（protease) "或"蛋白酶（proteaseenzyme) "是消化酶，其可以使蛋白和 肽降解，并且可以在人体的各种组织中发现它，诸如例如胃（胃蛋白酶），肠腔（糜蛋白酶， 胰蛋白酶，弹性蛋白酶，羧肽酶等）或胃肠道的粘膜表面（氨肽酶，羧肽酶，肠肽酶，二肽基 肽酶，内肽酶等），肝（胰岛素降解酶，组织蛋白酶D等），和其它组织中。
[0049]可以测定找作为本发明的N末端修饰的胰岛素对蛋白酶诸如糜蛋白酶、胃蛋白酶 和/或羧基肽酶A或者对酶的混合物诸如组织提取液（来自肝，肾，十二指肠，空肠，回肠， 结肠，胃等）的蛋白水解稳定性的量度。在本发明的一个实施方案中，相对于人胰岛素，1? 增加。在进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛 素，1?增加。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，找增加至少2倍。在仍进一步 的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，1?增加至少2 倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，找增加至少3倍。在仍进一步的实施方 案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，1?增加至少3倍。在 仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T1A增加至少4倍。在仍进一步的实施方案中，相 对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，1?增加至少4倍。在仍进一步 的实施方案中，相对于人胰岛素，1?增加至少5倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有 一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，1?增加至少5倍。在仍进一步的实施方 案中，相对于人胰岛素，找增加至少10倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或 多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，1?增加至少10倍。
[0050] 术语"稳定性"在本文中用于包含N末端修饰的胰岛素的药物组合物来描述组合 物的保存期限。当是指本发明的N末端修饰的胰岛素时，术语"稳定化的"或"稳定的"因 此是指相对于包含没有N末端修饰的胰岛素的组合物或相对于没有一个或多个额外二硫 键的胰岛素具有增加化学稳定性、增加物理稳定性或增加物理和化学稳定性的组合物。
[0051] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学稳定性。在一个方面， 本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的物理稳定性。在一个方面，本发明的N末端修饰 的胰岛素具有改善的化学和物理稳定性。
[0052] 在一个方面，相对于人胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和/ 或物理稳定性。在一个方面，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素， 本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和/或物理稳定性。在一个方面，相对于具 有一个或多个额外二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素，本发明的N末端修饰的胰 岛素具有改善的化学和/或物理稳定性。
[0053] 本文所用的术语"物理稳定性"是指，胰岛素暴露于热-机械应激和/或与使之不 稳定的界面和表面诸如疏水表面和界面的相互作用导致的N末端修饰的胰岛素形成胰岛 素的无生物活性的和/或不溶性的聚集体的趋势。因此，物理不稳定性涉及相对于人胰岛 素的构象变化，其包括更有序结构的损失、聚集、原纤化（fibrillation)、沉淀和/或吸附至 表面。已知肽诸如胰岛素倾向于例如原纤化导致的不稳定。通过在不同温度不同时间期间 将填充合适的容器（例如，盒或小瓶）的溶液暴露于机械/物理应激（例如搅动）之后例 如目视检查、比浊法和/或浊度测定法的常规方法，可以评价包含N末端修饰的胰岛素的溶 液的物理稳定性。在具有黑背景的尖锐聚焦光中进行溶液的目视检查。通过例如在从〇到 3的等级（显示无浊度的溶液对应于目测评分0,且日光下显示可见浊度的溶液对应于目测 评分3)排序浊度的程度的目测评分而表征溶液的浊度。当溶液在日光下显示可见浊度时， 对于蛋白聚集，溶液被分类为物理不稳定的。或者，可以通过本领域技术人员公知的简单的 浊度测定评价溶液的浊度。也可以通过使用N末端修饰的胰岛素的构象状态的光谱试剂或 探针评价本发明的N末端修饰的胰岛素的物理稳定性。探针优选与蛋白的非天然构象体优 先结合的小分子。蛋白结构的小分子光谱探针的一个实例是硫磺素T。硫磺素T是已经广 泛用于淀粉样原纤维的检测的荧光染料。在原纤维和还可能其它蛋白构型存在的情况下， 当结合于原纤维蛋白形式时，硫磺素T产生在约450nm的新的最大激发和在约482nm的 增强的发射。未结合的硫磺素T在该波长基本上无荧光。例如如实施例109中所述可以测 定本发明的N末端修饰的胰岛素的物理稳定性。
[0054] 可以使用其它小分子作为蛋白结构从天然至非天然状态的变化的探针。例如，优 先结合于蛋白的暴露的疏水斑块（patch)的"疏水性斑块"探针。疏水性斑块通常埋在天 然状态的蛋白的三级结构内，但当蛋白开始解折叠或变性时变得暴露。这些小分子的光谱 探针的实例是芳族的疏水性染料，诸如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光谱探针是金属-氨基酸 复合物，诸如疏水性氨基酸诸如苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸和缬氨酸等的钴金 属复合物。
[0055] 本文所用的N末端修饰的胰岛素的术语"化学稳定性"是指导致化学降解产物的 形成的蛋白结构中的化学共价变化，与天然蛋白结构相比，该化学降解产物具有潜在的更 低的生物学效力和/或潜在的增加的免疫原性特性。根据天然蛋白的类型和性质和蛋白暴 露的环境，可以形成各种化学降解产物。化学降解的消除最可能不能完全避免，在本领域技 术人员公知的药物组合物的储存和使用期间经常看到逐渐增加量的化学降解产物。大多数 蛋白倾向于脱酰胺化，在该过程中谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基被水 解形成游离的羧酸。其它降解途径涉及形成高分子量转化产物，其中两个或更多的蛋白分 子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此共价结合，导致形成共价结合的二聚 你，"％聚你私多聚H犧f吻]{StabilityofProteinPharmaceuticals,Ahern.T.J. & C, /7(9/?a? Afer7o_rA。氧化可以作为化学降解的另一种变体被 提及。可以通过在暴露于不同的环境条件之后在各个时间点测定化学降解产物的量评价N末端修饰的胰岛素的化学稳定性（例如经常可以通过升高温度来加速降解产物的形成）。 经常通过根据分子大小、亲水性、疏水性和/或电荷使用各种层析技术（例如，SEC-HPLC和 /或RP-HPLC)分离降解产物来测定各个降解产物各自的量。
[0056] 在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素具有很少或没有聚集的趋势。 当在硫磺素测定中试验时，相对于没有一个或多个额外的二硫键的人胰岛素和/或N末端 修饰的胰岛素的聚集趋势，聚集趋势优选显著改善。
[0057] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的热力学稳定性，诸如例如， 折叠稳定性，构象的稳定性和/或更高的熔解温度。
[0058] 当本文使用时，如果与没有一个或多个额外的二硫键的人胰岛素或N末端修饰的 胰岛素相比，所述衍生物的变性需要更高的应激水平诸如更高的温度和/或更高浓度的变 性剂，那么N末端修饰的胰岛素被称为具有改善的"热力学稳定性"。
[0059]可以通过诸如例如Hudson和Andersen,PeptideScience,vol76 (4)，PP. 298-308 (2004)中所述圆二色光谱和NMR评价构象的稳定性。熔解温度被理解为胰岛素 结构可逆或不可逆地变化的温度。更高的熔解温度对应更稳定的结构。可以，例如，通过 圆二色光谱和/或NMR将构象稳定性评价为温度的函数，或通过差示扫描量热法而测定熔 解温度。也可以在逐渐增加浓度的变性剂诸如例如盐酸胍存在的情况下通过CD光谱和或 NMR测定热力学稳定性。可以从这种实验测定以前所述（Kaarsholm,N.C.，等人，1993， 历32，10773-8)的解折叠的自由能。蛋白变性后，远UV范围（240-218-nm) 内的负CD逐渐减小，与伴随蛋白解折叠的有序的二级结构的损失一致（Holladay等 人，1977，Jcia, 494，245-254;Melberg和Johnson, 1990， 沒iocAi?.沿·〇Μ_7·5.Jcia, 494，245-254)。在近UV范围（330-250-nm)内的胰岛素CD谱 反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境（Morris等人，1968，AiocAi?. Biophys. Acta. , 1QQ, --οο?等乂，\WIb, Biochim. Biophys. Acta, 145-155;Strickland&Mercola, 1976，15，3875-3884)。从这些研究 以前计算的胰岛素的解折叠的自由能为4.5kcal/mol(Kaarsholm,N.C.,等人，1993， Biochemistry,32, 10773-8)〇
[0060] 在近UV范围（330-250-nm)内的胰岛素⑶谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪 氨酸发色团的环境。由于酪氨酸残基是胰岛素二聚体表面的部分，在该区域（尤是在276nm)的摩尔椭圆率（molarelipticity)的变化反映在胰岛素的结合状态上。测量胰岛素的 结合状态的另一种方式是通过在本领域已知并且在实施例中描述的非解离条件下应用大 小排阻层析法。
[0061] 可以选择N末端修饰的胰岛素的N末端修饰基团的电荷，使得与亲本胰岛素的胰 岛素受体亲和力相比，N末端修饰的胰岛素已经保留或改变对于胰岛素受体（IR)的亲和 力。
[0062] 例如，与没有N末端修饰的亲本胰岛素相比，在生理pH下（即pH7. 4)为中性或带 负电荷的N末端修饰基团可以导致降低的IR亲和力。作为另一个实例，与没有N末端修饰 的亲本胰岛素相比，在生理PH下带正电荷的N末端修饰基团可以导致保留的或仅仅稍微降 低的IR亲和力。
[0063] 根据本发明的一个方面，用于本发明的N末端修饰基团在生理pH下可以是中性或 带正电荷或带负电荷的。
[0064] 在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结 合部分组成。
[0065]当将术语"在生理pH下带正电荷"使用为关于如本文中所述的N末端修饰基团时， 是指在包含N末端修饰多肽的溶液中，至少10%的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的 电荷。在一个方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少30%的N末端修饰基团在生理pH下 具有+1的电荷。在进一步方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少50%的N末端修饰基 团在生理pH下具有+1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少70% 的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽的 溶液中至少90%的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。
[0066] 在生理pH下带正电的N末端修饰基团的实例包括但不限于：N,N-二-C1-4烷基诸 如N,N-二甲基和N,N-二乙基、N-脒基（amidinyl)、4-(N,N-二甲基氨基）丁酰基、3-(1-哌 啶基）丙酰基、3 - (N，N-二甲基氨基）丙酰基和 N，N-二甲基-甘氨酰基：
【权利要求】
1. N末端修饰的胰岛素，其由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成，其中所 述肽部分具有至少一个不存在于人胰岛素中的二硫键。 2. N末端修饰的胰岛素，其由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成，其中所 述肽部分具有两个或更多个半胱氨酸取代，且保留了人胰岛素的三个二硫键。
3. 根据权利要求1或2的N末端修饰的胰岛素，其中以这样的方式选择半胱氨酸取 代的位点，所述方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构 中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，并且其中所述N末端 修饰的胰岛素具有具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但不具 有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。
4. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中，所述修饰基团是一个或 两个有机取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量（MW)，且缀合于亲本胰岛素的N末 端。
5. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中修饰基团在化学式V (针 对A链N末〗而图不）中指定为Y'和Z :
且其中Y'和Z连接至胰岛素肽的N末端氨基酸。
6. 根据权利要求5的N末端修饰的胰岛素，其中Y'和Z是不同的，且 Y' 是 R-C(=X)-， Z是H， R是H，NH2，直链或支链的CI-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二甲基 铵、二乙基铵或二丙基铵、CO2H或-OCH2CO2H取代的直链或支链的C2-C4烷基，C5-C6环烷 基，取代的C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，且 X是0或S。
7. 根据权利要求5或6的N末端修饰的胰岛素，其中Y'和Z是不同的，且 Y' 是 R-C(=X)-， Z是H， R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO 2H取代的C1-C4烷基，且 X是0。
8. 根据权利要求5的N末端修饰的胰岛素，其中Y'和Z是相同的且是甲基。
9. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团选自： N，N-二甲基、N，N-二乙基、氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊二酰基和二羟 乙酰基。
10. 根据权利要求2-9中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置是 AlOC 和 B3C。
11. 根据权利要求2-10中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱 氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸：A14E、B16H、B25H、 desB27 和 desB30。
12. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分选自：A10C， A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30 人 胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30 人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30 人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30 人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30 人胰岛素。
13. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述白蛋白结合部分具 有通式 Acy-AAln-AA2m-AA3p-(化学式 IV)， 其中 n为0或1-3范围内的整数； m为0或1-10范围内的整数； P为〇或1-10范围内的整数； Acy是包含约14个-约20个碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸； AAl是中性的线性或环状氨基酸残基； AA2是酸性氨基酸残基； AA3是中性的含烷撑二醇的氨基酸残基； AA1、AA2和AA3在所述式中出现的顺序可以独立地互换；AA2可以沿所述式出现数 次（例如，Acy-AA2-AA32-AA2_) ;AA2可以沿所述式独立地（=不同的）出现数次（例如， Acy-AA2-AA32-AA2_) ;Acy、AAl、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺（肽）键，所述酰胺（肽） 键形式上可通过除去Acy、AAl、AA2和AA3各自的氢原子或羟基（水）来获得；且与肽部分 的连接可以来自化学式IV酰基部分中的AAl、AA2或AA3残基的C末端或来自化学式IV部 分中存在的AA2残基的一个或多个侧链中的一个。
14. 根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自： 八1〇￥'，-二甲基），六10(：，六14￡，81〇￥°，#°-二甲基），83(：，82511，（168827， B29K 〇VE十八烷二酰基-gGlu-2xOEG)，desB30人胰岛素 八1〇￥'，-二甲基），六10(：，六14￡，81?，#°-二甲基），83(：，82511，8291(〇￥￡二十 烷二酰基-gGlu-2xOEG)，desB30人胰岛素。
15. 药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素。
【文档编号】A61K38/28GK104364262SQ201280063236
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】P.马德森, T.B.克杰德森, T.M.塔格莫塞 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司