三唑并[4,5-d]嘧啶衍生物的制作方法
【专利摘要】式I的化合物：其中R1和R2具有权利要求1中所示的含义，是GCN2的抑制剂，并且可以用于，尤其用于治疗癌症。
【专利说明】三唑并[4, 5-d]嘧啶衍生物
[0001] 发明背景 本发明的目的是发现新的具有有价值特性的化合物，特别是可以用于制备药物的那些 化合物。
[0002] 本发明涉及化合物和化合物在抑制、调控和/或调节由蛋白激酶（特别是免疫调 节或应激反应激酶）引起的信号转导中的用途，此外，还涉及包含这些化合物的药物组合 物和所述化合物用于治疗激酶诱导的疾病的用途。
[0003] 因为蛋白激酶调节几乎每种细胞过程，包括代谢、细胞增殖、细胞分化和细胞存 活，所以，它们是各种疾病状态的治疗干预的有吸引力的靶向。例如，蛋白激酶发挥关键作 用的细胞周期控制、免疫调节、应激反应和血管生成是与许多疾病状况相关的细胞过程，诸 如但不限于：癌症，炎症性疾病,神经变性疾病，慢性感染，异常血管生成和与其相关的疾 病，动脉粥样硬化，黄斑变性，糖尿病，肥胖症和疼痛。
[0004] 式I的化合物抑制被称为通用控制蛋白2 (general control non derepressible 2) (GCN2)的应激反应eIF2激酶EIF2AK4。
[0005] 实体瘤的癌症治疗的许多策略集中于尽可能地手术除去肿瘤块，随后利用更具体 地靶向癌细胞途径的细胞毒素药剂或抑制剂进行放疗和化疗，根除任何残留的肿瘤细胞。 然而，这种方法的成功受到限制，并且通常没有持续效果。这主要是由于这种细胞毒素药剂 的治疗窗口狭窄（特异性和副作用）和癌细胞适应细胞毒素或其它抑制药剂所产生的选择 性压力的能力。对初始治疗获得抗性的少量肿瘤（干）细胞的存活，可以足以为肿瘤再生提 供种子。在大多数情况下，相比于初始肿瘤的治疗，这种复发更难以治疗。因此，更成功靶向 肿瘤细胞需要并行地靶向肿瘤细胞的多重存活和逃避机制（Muller & Prendegast 2007)。
[0006] 恶性肿瘤的形成伴随有细胞生理机能的较多积累（a major roll up)。在该过程 期间，基于无限增殖或对生长抑制信号不敏感而使癌细胞获得一些特性。此外，肿瘤细胞 还改变与微环境和之外之间的相互作用。后者的区域包括肿瘤细胞逃脱免疫监视的策略 (Muller & Prendegast 2007)。免疫监视不但限制恶性生长，而且提供了引发对于逃避免疫 反应的机制的进化的选择性压力，如[Dunn等人2004]所综述。实际上，常常观察到的是， 消除T细胞免疫足以提高肿瘤发病率[Shankaran等人2001]，人们相信，免疫逃逸影响相对 于进程的肿瘤休眠、促进侵袭和转移，并且负面地影响治疗响应。
[0007] 几项机理研究发现，在肿瘤微环境之内，免疫逃逸与代谢变化具有重要的联系。在 这里，在介导对抗原的免疫耐受性的过程中的重要作用与必需氨基酸色氨酸和精氨酸的分 解代谢有关，这种代谢分别是通过酶吲哚胺2, 3-双加氧酶（ID0)和精氨酸酶I(ARG)进 行的（Bronte and Zanovello,2005; Muller 等人，2005b; Muller and Prendergast，2007; Munn and Mellor，2007; Popovic 等人，2007)。
[0008] IDO是催化色氨酸降解为犬尿氨酸的单链氧化还原酶。IDO不负责分解代谢过量 的饮食色氨酸，但调节局部环境的色氨酸水平。在癌症患者中，色氨酸代谢的提高表明显著 地改变了色氨酸或分解产物的血清浓度，并且这与在肿瘤和引流淋巴结中共同升高的ID0 相关。根据一些出版物，ID0过表达与癌症的不良预后有关[Okamoto等人2005; Brandacher 等人2006]。
[0009] T细胞似乎优先对IDO激活敏感，从而使得，当缺乏色氨酸时，它们不能分离，并因 此不能被呈递给它们的抗原活化。Munn和Mellor与他们的同事揭示，ID0通过抑制T细胞 激活和对肿瘤抗原形成周围耐受性来调节免疫（Mellor and Munn,2004)。这些机理包括： 破坏被肿瘤细胞招募至它的瞬时微环境或肿瘤-引流淋巴结中的免疫细胞。本文中，被抗 原呈递细胞清除的肿瘤抗原交叉呈递至适应免疫系统。除了直接耐受性之外，成熟DC具有 扩增调控T细胞（Treg)的能力[Moser 2003]。
[0010] 除了色氨酸分解代谢之外，在肿瘤调节的微环境中也会增加精氨酸的转化，并且 许多报道表明了精氨酸酶在肿瘤生长和发展期间的激活作用。在肿瘤浸润骨髓细胞中， 精氨酸被精氨酸酶I (ARG1)、精氨酸酶II (ARG2)转变为脲和鸟氨酸，并且被氧化氮合酶 (N0S2)的诱导形式氧化为瓜氨酸和一氧化氮（N0)。
[0011] 在结肠、乳房、肺和前列腺癌症患者中常常观察到ARG活性提高[Cederbaum 2004]，这与存在于前列腺癌症中的ARG和N0S的过表达有关[Keskinege等人2001， Aaltoma等人2001，Wang等人2003]。已经显示，在浸润巨噬细胞中，ARG活性削弱抗原特异 性T细胞反应和CD3受体的表达。此外，在肿瘤相关的骨髓细胞中，ARG和N0S的累积活性 可以对抗原特异性T淋巴细胞产生抑制信号，最终导致细胞凋亡[Bronte 2003 a ;2003b]。
[0012] ID0和ARG相关的机制都在感测相应氨基酸浓度的消耗浓度这一点处汇合。在氨 基酸缺失期间，称为通用控制蛋白2 (general control nonderepressible 2 ;GCN2)的eIF2 激酶EIF2AK4与胞内累积脱酰tRNA相互作用。因此，假定GCN2从自身抑制状态改变为激 活态构型，并通过自身磷酸化来进一步活化。然后，只有已知的底物蛋白eIF2a变成磷酸 化状态，并因此使翻译起始的复合体得到抑制[Harding等人2000]。这会削弱常规帽依赖 性（Cap-dependent)翻译起始，以及通过其相应蛋白的生成。另一方面，这主要利用非帽依 赖性（Cap-incbpendent)引发（通过激活转录因子4(ATF4))来诱导应激相关的靶基因的 特异性表达。通过表达相应的应激响应蛋白，例如，在氨基酸代谢中的酶，细胞试图补偿具 体细胞应激[Wek等人2006]。如果应激持续，则通过促凋亡转录因子CCAAT/增强子-结合 蛋白同源蛋白（CHOP)的转录，该相同的途径转变成促进细胞死亡途径[Oyadomari 2004]。 已经表明，在eIF2 α磷酸化和导致细胞生长抑制的翻译起始发生改变的T细胞中，色氨酸 饥饿引发GCN2依赖性应激信号传导途径（Munn等人2005)。Sharma等人[2007]公开了关 于直接ID0诱导的和GCN2依赖性的成熟型Treg的激活。类似地，Fallarino等人[2006] 发现了 CD4+CD25-细胞的GCN2依赖性转化为CD25+FoxP3+ Treg，产生IL-10和TGF β。 Rodriguez等人[2007]确定，在与TCR信号传导的组合中，通过色氨酸或精氨酸耗竭来激活 GCN2途径，可以导致CD3 ζ链下调、细胞周期停滞和无反应性。
[0013] 重要的是，GCN2途径不仅对于肿瘤免疫逃逸重要，而且在直接调节肿瘤存活方面 发挥积极作用。Ye等人[2010]发现，在人实体瘤中，上述转录因子ATF4过表达，表明在肿瘤 进展中的重要功能。氨基酸和葡萄糖缺乏是在实体肿瘤中和上调ATF4靶基因的活化GCN2 途径（参与氨基酸合成和转移）中存在的典型应激。与正常组织相比，在人和小鼠肿瘤中， 观察到GCN2激活/过表达和提高的磷酸eIF2 α，并且ATF4或GCN2表达的消除显著地抑制 体内肿瘤生长。可以得出结论，在肿瘤细胞中，GCN2-eIF2a-ATF4途径对于保持代谢体内 平衡是关键的。
[0014] 总的说来，目前的生物学用ARG/ID0途径进行干扰，这对于通过适应性机制阻碍 肿瘤免疫逃逸是有吸引力的。本文中，干扰GCN2功能是特别使人感兴趣的，因为它是ID0 和ARG两个途径的汇合点，而且它还对直接妨碍肿瘤代谢提供其它机会。
[0015] 几种途径抑制剂已经被认为是免疫调节剂。这些抑制剂主要解决ID0或ARG蛋 白的酶功能（Muller and Scherle，2006)。在小鼠中，应用精氨酸酶抑制剂N-轻基-去 甲-L-Arg，阻断s. c. 3LL肺癌的生长[Rodriguez 2004]。据报道，提供N0的阿司匹林如NCX 4016(2-(乙酰氧基）苯甲酸3-(硝基氧基甲基）苯酯）可干扰骨髓细胞的抑制性酶活性。 口服施用的N0阿司匹林使携带肿瘤的宿主的免疫状态正常化，可以提高肿瘤抗原特异性T 淋巴细胞的数量与功能，并且提高癌症接种引发的抗肿瘤免疫的预防和治疗效果（DeSanto 2005)。
[0016] 在癌症背景和其它环境中，已经广泛地使用底物类似物1甲基-色氨酸（1MT)和 相关的分子，以革巴向IDO。Friberg等人（2002)和Uyttenhove等人（2003)的研究证明，1MT 可以限制过表达ID0的肿瘤的生长。然而，在一些肿瘤模型中，1MT不能引起肿瘤退化，表明 当将ID0抑制用作单疗法时，只显示出适度的抗肿瘤效果。与此相反，1MT和各种细胞毒素 化学治疗剂的联合治疗可以引起形成的MMTV-neu/HER2肿瘤的退化，这种肿瘤对任何单一 药剂治疗的响应很差[Muller等人2005a]。治疗之前小鼠的⑶4+或⑶8+ T细胞的免疫耗 竭，消除了在该模型中观察到的联合效果，证明了 1MT间接地通过激活T细胞介导的抗肿瘤 免疫起作用的预期。通过证明1MT在小鼠中缺乏抗肿瘤活性（其对ID0是遗传有缺陷的） 提供了重要证据，证明ID0靶向对1MT作用是必要的[Hou等人，2007]。
[0017] 抑制GCN2能够使氨基酸饥饿诱导的免疫编辑的两个途径分支合并，并且降低肿 瘤绕过任何一个分支的抑制作用的选择。此外，如上面所详述，GCN2抑制为同时干扰肿瘤 代谢提供了机会，同时这可以提高单疗法的效果，或与其它抗癌方法联合治疗的效果。
[0018] 如上面所提到的，eIF2激酶GCN2通过与去酰基化的tRNA相互作用激活，其作为 营养剥夺应激的直接后果积累。其它细胞应激因素如UV照射、氧化还原应激或蛋白酶抑制 可以间接诱导GCN2激活[WEK等人，2006]。在所有已知情况下，eIF2a变得磷酸化，这主 要通过非帽依赖性（Cap-independent)引发（通过激活转录因子4(ATF4))来诱导应激相 关的靶基因的特异性表达。
[0019] Mitsuda等人（2007)显示，早老素-1受由GCN2调节的激活转录因子4(ATF4)诱 导。在阿尔茨海默病中，淀粉样蛋白-β(Αβ)(由γ-分泌酶从淀粉样前体蛋白产生）在 大脑皮质的积累是常见且关键的事件。具体地，早老素对于分泌酶活性是必需物质。 Ohata等人（2010)描述了 GCN2_eIF2 a -ATF4信号传导在自噬受损细胞中γ -分泌酶活性 的调节中的作用：自噬溶酶体系统的损伤可以引起细胞中的氨基酸失衡，因为自噬对于氨 基酸水平的维持是需要的。自噬溶酶体系统作为分泌酶活性通过GCN2的重要调节剂进 行讨论，导致自噬恶化中的Αβ聚集，这可以是用于减少Αβ产生的可能治疗目标。γ-分 泌酶在阿尔茨海默病（AD)的发展中起着重要作用。γ-分泌酶活性在自噬泡中富集，其增 强了 β淀粉样蛋白（Αβ)合成。
[0020] 老年斑主要由衍生自淀粉样前体蛋白（ΑΡΡ)的β-淀粉样肽（Αβ)构成，所述 淀粉样前体蛋白（ΑΡΡ)已经经历由β-分泌酶（BACE-1)和γ-分泌酶的蛋白水解加工。 0' Connor等人（2008)发现，eIF2 α蛋白的磷酸化在翻译上增加 BACE-1水平。
[0021] 在这种疾病状况（其促进分泌酶的活化或BACE-1的诱导，并伴随脑中Αβ的 聚集和斑块形成）下GCN2的抑制可以为缓和或者甚至停止神经变性疾病的进展提供有价 值的途径。
[0022] 其描述了持续、非急性的寄生虫或病毒感染与甚至具有免疫能力的宿主建立对于 感染性生物体或颗粒的免疫赦免状况（immune privileged conditions)相关联。这已经 与 ID0 表达的局部诱导相关联。Makala 等人（J Infect Dis. 2011 Mar 1; 203 (5) :715-25) 显示，皮肤利什曼虫皮肤感染刺激免疫调节酶吲哚胺2, 3双加氧酶（ID0)在局部淋巴结中 的表达。诱导的ID0减弱树突状细胞的T细胞刺激功能并抑制对外源和名义寄生虫抗原 的局部T细胞应答。ID0消除降低局部炎症和寄生虫负荷，就像在具有确立感染的小鼠中 ID0 的药理学抑制一样。de Souza Sales (Glin Exn Tmmunol. 2011 Aug; 165 (2) : 251-63)证 实了吲哚胺2, 3-双加氧酶在瘤型麻风免疫抑制中的作用。Boasso等人(Blood. 2007 Apr 15; 109 (8) : 3351-9)发现，HIV抑制通过诱导浆细胞样树突细胞中的吲哚胺2, 3-双加氧酶 而抑制⑶4+ T细胞增殖，并且ID0的体外抑制导致来自HIV感染患者的PBMC中的⑶4 (+) T细胞增殖反应增加。
[0023] ID0/GCN2途径的抑制剂药物可以用来增强针对慢性和持续感染的宿主免疫。 支献： Aaftoma, S.H., P.K. Upponer?, and V.M. Kc^ma. 2001. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and Its prognostic value in prostate cancer. Anttrancer Res. 21:3101-3106. 2. Brandacher, G.; Peraltioner, A.; Ladumer, R.; Schneeberier, S.; Obrist, P,; Winkter, C,; Werner, E. R.; Werner-Felmayer? G.; Weiss, H. Gobel, G,; Pargrefter,, R,; Konif srainer, A.; Fuchs, 0.; Ambeiger, A Prc^nostic value of indoleamine 2,3- dioxygenase expression in colorectal cancer: effect on luroorinlltrating T cells. Clin. Cant?rRes. 2006,12,1144-1151. 3. Bronte V? 2an〇￥elto P. (2005). Regulation of immyne responses by L-arginine metaijofem. Nat Rev Immunol 5; 641-€54, 4. Bronte, V.? P. Seraini, C. De Santo, I. Mango? V. Tosello, A. Mazzoni, D*M. Segal, €. Staib, M. Liawel, G. Sutler, et al. 2003a. li-4- induced arginase 1 suppresses allareadive 了 c*lis jn tumoiMtearinf mice· JJmimmDL 170:270- 278. 5. Bronte, V., P. Serafini, A. Mazzoni, D.M. 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[0024] 具体地，本发明涉及化合物和化合物的用途，其中抑制、调控和/或调节GCN2引起 的信号转导发挥作用。
[0025] 因此，合成特异性地抑制、调控和/或调节免疫调节或应激反应激酶（特别是 GCN2)引起的信号转导的小分子化合物是期望的，并且是本发明的目的。
[0026] 此外，本发明的目的是合成新化合物，所述新化合物用于预防和治疗肿瘤性恶性 肿瘤，包括，但不限于，实体瘤癌症，淋巴或血液系统的癌症，神经变性疾病和慢性感染的癌 症。
[0027] 已经发现，根据本发明的化合物和其盐具有很有价值的药理学特性，同时具有很 好的耐受性。
[0028] 此外，式I的化合物可以用于分离GCN2和研究GCN2的活性或表达。此外，它们尤 其适合用于与未调节的或紊乱的GCN2活性有关的疾病的诊断方法。
[0029] 式I的化合物还可以抑制酪氨酸激酶FMS (CSF1R)、FLT3或FLT4或这些激酶的组 合，优选地，除了针对GCN2的抑制活性之外。
[0030] Fms类酪氨酸激酶3 (FLT3)，也称为FLK-2 (胎儿肝激酶2)和STK-I (干细胞激酶 1)，在造血干细胞的增殖和分化中起重要作用。FLT3受体激酶在80%以上的骨髓性患者的 细胞中和一部分急性淋巴母细胞性白血病细胞中以非常高的水平表达。此外，所述酶还可 以在淋巴原细胞危象（lymphoid blast crisis)慢性粒性白血病患者的细胞中发现。已经 报道，在30%的急性骨髓性白血病（AML)中和同样在急性淋巴母细胞性白血病（ALL)的亚 组中，FLT3 激酶发生突变（Gilliland 等人 Blood 100,1532-1542(2002) ; Stirewalt 等人， Nat. Rev. Cancer，3,650-665 (2003)。FLT3突变中的活化突变与不良预后相关（Malempati 等人，Blood，104,11 (2004)。正在开发FLT3抑制剂，其中一些已经显示有希望产生临床上 抗 AML 的效果（Levis 等人 Int. J. Hematol，52,100-107 (2005)。
[0031] 已经报道，一些小分子FLT3抑制剂在具有FLT3-活化突变的细胞系中可有效诱导 细胞凋亡，并且可使其骨髓细胞中表达突变FLT3的小鼠的存活时间有效延长（Levis等人， Blood, 99，3885-3891 (2002); Kelly 等人，Cancer Cell, 1，421-432 (2002); Weisberg 等人，Cancer Cell, 1，433-443 (2002); Yee 等人，Blood, 100, 2941-2949 (2002)。
[0032] 美国专利申请20090054358描述了用于免疫抑制，特别是用于治疗免疫相关病症 如器官排斥、骨髓移植排斥、非髓性抑制骨髓移植排斥、强直性脊柱炎、关节炎、再生障碍性 贫血、贝赫切特氏病、1型糖尿病、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、韦 格纳氏肉芽肿病、高IgE综合征、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、Crohn氏病、 多发性硬化、重症肌无力、银屑病和狼疮以及其它自身免疫性疾病的Flt3抑制剂。Flt3抑 制剂也可以用于治疗神经系统病症，如神经变性疾病，例如由轴突变性引起的疾病。神经变 性疾病包括，例如，多发性硬化；脱髓鞘核病症，诸如多发性硬化，急性横贯性脊髓炎，但不 限于此。
[0033] Scott 等人（Bioorg. Med Chem Let. (2008) 18 (17) p4794)描述了用于治疗癌症的 CSF-1R抑制剂。CSF-1R是III类受体酪氨酸激酶的成员。细胞集落刺激因子1 (CSF-1)， 也称为巨噬细胞/单核细胞集落刺激因子（M-CSF)，与CSF-1R结合，导致二聚化、自身磷酸 化和信号转导的激活。1CSF-1/CSF-1R信号传导对于正常单核细胞发展是必需的。在癌 症中，促致瘤性巨噬细胞已经得到鉴定，并且与乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中的不良预后关 联。升高水平的CSF-1和CSF-1R已经在几种肿瘤类型包括乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌中 得到报道，并且也已经与侵袭和转移关联。因此，CSF-1R活性的抑制可以通过降低肿瘤相关 巨噬细胞（ΤΑΜ)的水平对肿瘤具有多重效应，并且对肿瘤本身具有直接作用（C.E. Lewis， J.W. Pollard, Cancer Res·, 66 (2006)，第 605 页；I. Bingle, Ν·等人，J. Pathol·, 196 (2002)，第 254 页；Β·Μ· Kacinski, Ann. Med·，27 (1995)，第 79 页；E. Garwood 等人· J Clin Oncol 26: 2008)。
[0034] Su JL 等人（Cancer Cell. 2006 Mar; 9 (3) :209-23)报道，VEGF-C/Flt-4 轴促进癌 细胞的侵袭和转移。Flt-4(VEGF受体）被其特异性配体VEGF-C激活。所得信号传导途径 促进血管生成和/或淋巴管生成。VEGF-C/Flt-4轴增强癌细胞活动性和侵袭，并且有助于 促进癌细胞转移。检查来自各种类型癌症的肿瘤组织揭示与临床转移和患者存活密切相关 的Flt-4和VEGF-C表达的高水平。Flt-4激酶的抑制可以降低不同类型癌症中的侵袭能 力。
[0035] 组合针对GCN2的抑制特异性和针对FMS (CSF1R)、FLT3或FLT4或这些激酶的组 合的特异性对于治疗不同疾病阶段的肿瘤性恶性肿瘤可以是特别有优势的。可以组合刺激 针对癌症/肿瘤细胞的免疫应答的影响，以降低肿瘤相关巨噬细胞的水平，以及癌症对于 转移形成的侵袭能力。在一个进一步方面，对GCN2的抑制活性特别与FLT3的抑制的组合 对于治疗神经变性病症可以是有利的，因为它可以协同对脑中的炎症过程和蛋白沉积物生 成的调节的抑制作用。在另一个方面，对GCN2的抑制活性特别与FLT3的抑制的组合可以 为调节免疫应答以治疗免疫相关病症和炎性或自身免疫性疾病提供优势。
[0036] 在一个进一步实施方案中，本发明特别涉及抑制、调控和/或调节GCN2、FMS (CSF1R)、FLT3或FLT4或这些激酶的组合的信号转导的式I的化合物，包含这些化合物的 组合物，和使用其治疗GCN2、FMS (CSF1R)、FLT3或FLT4或这些激酶的组合诱导或调节的疾 病和病症的方法。
[0037] 本发明的进一步目的是合成新化合物，所述新化合物用于预防和治疗肿瘤性恶性 肿瘤，包括，但不限于，实体瘤癌症，淋巴或血液系统的癌症，神经变性疾病的癌症，免疫相 关病症，如关节炎，牛皮癣，狼疮，多发性硬化或其它自身免疫性疾病以及慢性感染。
[0038] 此外，式I的化合物可以用于分离和研究SykGCN2、FMS (CSF1R)、FLT3或FLT4的 活性或表达。此外，它们尤其适合用于与未调节的或紊乱的SykGCN2、FMS (CSF1R)、FLT3或 FLT4活性有关的疾病的诊断方法。宿主或患者可以属于任何哺乳动物物种，例如，灵长类物 种，特别是人；啮齿类，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔；马，牛，狗，猫，等等。动物模型对于实验 研究是有益的，能够提供治疗人疾病的模型。
[0039] 可以通过体外试验来测定具体细胞对用根据本发明化合物的治疗的敏感性。典型 地，将细胞的培养物与各种浓度的根据本发明的化合物结合一段时间，结合时间足以使活 性剂（诸如抗IgM)诱导细胞响应，诸如表面标志物的表达，通常在大约一小时和一周之间。 可以使用来自血液或活检样品培养的细胞来进行体外试验。使用能够识别标志物的特异性 抗体，通过流式细胞术评价表达的表面标志物的数量。
[0040] 剂量根据使用的具体化合物、具体疾病、患者状态等等而变化。治疗剂量典型地足 以显著地减少靶组织中的不希望的细胞群体，同时保持患者的生存能力。治疗通常持续直 到细胞载荷（cell burden)出现相当大的减少，例如，减少至少约50%，并且可以持续直到身 体内基本上不能检出更多不希望的细胞。
[0041] 为了鉴定信号转导途径和检测各种信号转导途径之间的相互作用，许多科学家已 经开发了合适模型或模型系统，例如，细胞培养模型（例如Khwaja等人，ΕΜΒ0,1997,16， 2783-93)和转基因动物的模型（例如White等人，Oncogene，2001，20, 7064-7072)。为了测 定信号转导级联中的某些阶段，可以使用相互作用化合物，以便调节信号（例如Stephens 等人，Biochemical J.，2000,351，95-105)。根据本发明的化合物还可以在动物和/或细胞 培养模型中或在本申请提到的临床疾病中用作检测激酶依赖性信号转导途径的试剂。
[0042] 激酶活性的测定是本领域技术人员众所周知的技术。在文献（例如 Campos-Gonzcilez，R. and Glenney，Jr.，J. R. 1992，J. Biol. Chem. 267，第 14535 页） 中，描述了使用底物例如组蛋白（例如Alessi等人，FEBS Lett. 1996, 399, 3,第333-338 页）或碱性髓鞘蛋白来测定激酶活性的一般测试系统。
[0043] 为了鉴定激酶抑制剂，许多测定系统是合适的。在闪烁近似测定（Sorg等人，J. of. Biomolecular Screening, 2002，7，11-19)和闪板（flashplate)测定中，测定作为底 物的蛋白或肽（含有YATP)的放射性磷酸化。在抑制性化合物的存在下，可检测放射性 信号的降低，或检测到完全没有信号。此外，均相时间分辨荧光共振能量转移（HTR-FRET) 和突光偏振（FP)技术可合适地作为测定法（Sills等人，J. of Biomolecular Screening, 2002， 191-214)。
[0044] 其它非放射性的ELISA测定法使用特定磷酸抗体（磷酸-AB)。磷酸-AB只结合磷 酸化底物。可以使用第二过氧化酶缀合的抗绵羊抗体（Ross等人，2002, Biochem. J.)，通 过化学荧光来检测这种结合。 现有技术
[0045] 其它三唑并嘧啶衍生物在W0 2005/012307 A1和W0 2006/075023 A2中被描述为用 于治疗疾病如阿尔茨海默病或糖尿病的GSK3抑制剂。
[0046] 本发明概述 本发明涉及式I的化合物
【权利要求】
2. 根据权利要求1的化合物，其中 R2代表呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻二唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑 基、噻唑基、三唑基或四唑基，其未被取代或被A、[C(R3)2]pCyc、[C(R 3)2]pAr、[COajpHet1、 CN 或[C(R3)2]pC00R3 单取代， 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
3. 根据权利要求1或2的化合物，其中 Ar 代表苯基，其未被取代或被 Hal、A、[C (R3) 2] p0R3、NR3C0A、S (0) Jet1 和 / 或 0 [C (R3) 2] pHet1单取代、双取代或三取代， 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
4. 根据权利要求1-3中一项或多项的化合物，其中 Het代表吡唑基、二氢吲哚基、喹喔啉基、苯并[1，2, 5]噻二唑基或吡啶基，其未被取代 或被A或[C (R3) 2] P0R3单取代， 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
5. 根据权利要求1-4中一项或多项的化合物，其中 Het1代表批略烧基、氣杂环丁烧基、氧杂环丁烧基、脈陡基、吗琳基、批P坐基、批陡基或 四氢吡喃基，其未被取代或被A或=0单取代， 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
6. 根据权利要求1-5中一项或多项的化合物，其中 R1代表Ar或Het， R2代表呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻二唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑 基、噻唑基、三唑基或四唑基，其未被取代或被A、[C(R3)2]pCyc、[C(R 3)2]pAr、[COajpHet1、 CN 或[C(R3)2]pC00R3 单取代， R3代表Η或甲基， Ar 代表苯基，其未被取代或被 Hal、A、[C (R3) 2] p0R3、NR3C0A、S (0) Jet1 和 / 或 0 [C (R3) 2] pHet1单取代、双取代或三取代， Het代表吡唑基、二氢吲哚基、喹喔啉基、苯并[1，2, 5]噻二唑基或吡啶基，其未被取代 或被A或[C (R3) 2] P0R3单取代， Het1代表批略烧基、氣杂环丁烧基、氧杂环丁烧基、脈陡基、吗琳基、批P坐基、批陡基或 四氢吡喃基，其未被取代或被A或=0单取代， A代表具有1-10个C-原子的非支链或支链烷基，其中一个或两个非相邻CH-和/或 CH2-基团可以被N-和/或0-原子替代，并且其中1-7个H-原子可以被F或C1替代， Cyc代表具有3-7个C原子的环烷基，其未被取代或被[C(R3)2]p0H单取代， Hal 代表 F、Cl、或 I， n代表0、1或2， m代表1、2或3， P 代表 〇、1、2、3 或 4， 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
7.根据权利要求1的化合物,其选自
其中R2具有权利要求1所示的含义， 和/或 式I的碱或酸转变为它的一种盐。
9. 包含至少一种式I化合物和/或其药学可接受的盐、溶剂化物、互变异构体和立体 异构体的药物，包括其所有比例的混合物，以及任选包含药学可接受的载体、赋形剂或媒介 物。
10. 式I化合物和其药学可接受的盐、溶剂化物、互变异构体和立体异构体，包括其所 有比例的混合物，其用于治疗和/或预防炎症性状况、免疫状况、自身免疫状况、过敏性状 况、风湿性状况、血栓性状况、癌症、感染、神经变性疾病、神经炎性疾病、心血管疾病和代谢 性状况，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1的化合物。
11. 根据权利要求10的化合物，其用于治疗和/或预防癌症，其中待治疗的癌症是实体 瘤或血液和免疫系统的肿瘤。
12. 根据权利要求11的化合物，其中所述实体瘤源自以下的肿瘤：上皮，膀胱，胃，肾， 头和颈，食管，宫颈，甲状腺，肠，肝，脑，前列腺，泌尿生殖道，淋巴系统，胃，喉部，骨骼，包括 软骨和尤因肉瘤，生殖细胞，包括胚胎组织肿瘤，和/或肺，源自单核细胞白血病，肺腺癌， 小细胞肺癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，神经纤维瘤，血管肉瘤，乳腺癌和/或恶性黑素瘤。
13. 根据权利要求10的化合物，其用于治疗和/或预防疾病，所述疾病选自类风湿关节 炎、系统性狼疮、哮喘、多发性硬化、骨关节炎、缺血性损伤、巨细胞动脉炎、炎症性肠病、糖 尿病、囊胞性纤维症、牛皮癣、Sj0grens综合症和移植器官排斥。
14. 根据权利要求10的化合物，其用于治疗和/或预防疾病，所述疾病选自阿尔 茨海默氏病、唐氏综合征、伴随淀粉样变-荷兰型的遗传性脑出血、脑淀粉样血管病、 Creutzfeldt-Jakob病、额颞痴呆、亨廷顿氏病、帕金森氏病。
15. 根据权利要求10的化合物，其用于治疗和/或预防疾病，所述疾病选自利什曼原 虫、分枝杆菌，包括麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌和/或鸟分枝杆菌、利什曼原虫、痕原虫、 人类免疫缺陷病毒、EB病毒、单纯疱疫病毒、丙型肝炎病毒。
16. 药物，其包含至少一种式I化合物和/或其药学可接受的盐、溶剂化物和立体异构 体，包括其所有比例的混合物，和至少一种其它药物活性组分。
17. 套装（药盒），所述套装（药盒）由以下的独立包装组成： (a) 有效量的式I化合物和/或其药学可接受的盐、溶剂化物、盐和立体异构体，包括 其所有比例的混合物， 和 (b) 有效量的其它药物活性组分。
18. 化合物 [3-(4-甲氧基-苯基）-3Η-[1，2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-基]-[4-甲基-5H-噁 唑-(2Z)-叉基]-胺（〃A12〃） 和其药学可接受的溶剂化物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比例的混合 物。
【文档编号】A61K31/519GK104066734SQ201280068233
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年1月28日
【发明者】D.多奇, G.赫尔策曼, K.席曼, A.韦格纳 申请人:默克专利股份公司