专利名称：一种禽流感(h9 亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
禽大肠埃希氏菌病又称禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis),指部分或全部由大肠埃希氏菌(Escherichia coli, E. coli)所引起的局部或全身性感染的疾病,可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎(Calnek B W主编(高福，苏敬良主译).禽病学.第10版.北京中国农业出版社，1999，158-171)等一系列病征，是2至12周龄的鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型极多，已知大肠杆菌有菌体(0)抗原173种，表面(K)抗原103种，鞭毛抗原60种。病原性大肠杆菌的许多血清型可引起多种动物发病。世界许多国家已经做了详细调查，确定最常与禽病有关的血清型是01、02、036和078，很少分离到其他血清型。国内学者绍华斌、霍龙飞和刘瑞田等也得出过相同结论(李树博.当前禽大肠杆菌病的流行特点与防控措施.现代畜牧兽医 2011. 12，39-40)。低致病性禽流感(Mildlypathogenic avian influenzavirus, MPAIV)在实验室条件下，受感染鸡死亡率很低，但是和E. coli混合感染时，死亡率会有不同程度的提高，鸡产蛋率锐减，肉鸡增重减少(Swayne D E, Pathobiology ofH5N2Mexican avian inf iuenzavirus infections of chickens. Vet Pathel. 1997，34 (6) : 557-567)。其中，H9 亚型禽流感病毒是导致低致病性禽流感发生、流行的诸多因素中较为重要的一种。由于低致病性禽流感和禽埃希氏大肠菌病两种疾病极易发生混合感染，而且混合感染后发病率高、危害大，这种背景下，研制一种可同时预防这两种疾病的疫苗显得尤为重要。
发明内容
本发明目的是通过自行分离的一株H9亚型禽流感病毒株和四株禽大肠埃希氏菌菌株(血清型分别为01、02、036、078)，提供一种可同时预防H9亚型禽流感和禽大肠埃希氏菌病两种疾病的疫苗，一次免疫即可预防两种疾病。为解决上述技术问题，本发明的技术方案在于1.禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗中该疫苗含有该疫苗含有灭活的H9亚型禽流感病毒和灭活的01、02、036和078四个血清型禽源大肠埃希氏菌。2.本发明所述禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的制备方法(I)分别按常规方法用鸡胚繁殖H9亚型禽流感病毒制备成灭活并经浓缩的病毒液；用含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤分别培养的四型禽源大肠埃希氏菌菌液，经灭活和浓缩，再按3:3:2:2的体积比例混合成四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩菌液；
(2)将以上制备的灭活并经浓缩的H9亚型禽流感病毒液与四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩混合菌液按1:1体积比混合后制备成水相，再按常规方法制备灭活佐剂疫苗。3.给鸡接种有效剂量的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗能使接种鸡获得对H9亚型禽流感病毒和禽源大肠埃希氏菌国内流行菌毒株产生有效预防的免疫力。
具体实施例方式1.疫苗生产用菌毒株(I)菌毒株来源本发明生产用毒株为一株H9亚型禽流感病毒株LGl株，为我单位自行分离、保存，并已经商品化，产品名称鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，产品批准文号兽药生字(2010) 150252152。本发明生产用菌株为四株禽源大肠埃希氏菌(或大肠埃希氏菌Escherichiacoli, E. coli)菌株 QLl 株、QL2 株、QL36、QL78 株，分别为四个血清型:01、02、036、078，是由本发明人由野外分离得到。以上菌株已与2013年01月31日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号QLl 株为 CGMCC No. 7241，QL2 株为 CGMCC No. 7242，QL36 株为 CGMCC No. 7243和 QL78 株为 CGMCC No. 7244。(2)菌毒株特性I)免疫原性 H9亚型禽流感病毒株LGl株免疫鸡HI抗体几何平均滴度应> 6. 51og2,免疫原性良好。禽源大肠埃希氏菌菌株用I月龄SPF鸡8只，每只颈部皮下注射疫苗0. 5ml，21日后连同条件相同的对照鸡8只，各肌肉或腹腔注射强毒菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)的混合菌液0. 5ml (按照菌数1:1:1:1混合，共含活菌2 5亿)。观察10日，对照鸡应全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸡至少保护6只。判定标准土有轻微临床反应，减食、排白色粪便I 3日，内脏无肉眼可见病变。+临床减食4日以上或停食I日以上，排黄白色粪便4日以上，剖检见心脏或肝脏有轻度纤维素渗出性炎症。+ +临床同(+)，可见明显心包积液及纤维素渗出性炎症。+ + +临床同(+ )，有严重心包膜炎，并与肝或胸膜发生粘连。+ + + +试验鸡死亡，其他同(+ ++ )。2)毒力H9亚型禽流感病毒株LGl株将毒种用灭菌生理盐水作5 15倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚20个，每胚0.1 0. 3ml，置37°C孵育，在接种后48 96小时内，至少有15个鸡胚死亡。禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)菌株含0.1%微量盐溶液(制作方法见中华人民共和国兽用生物制品规程，二〇〇〇版，81页)的马丁肉汤20 24小时培养菌液0. 3 0. 6ml(含活菌2 5亿)，肌肉或腹腔注射I月龄SPF鸡5只，应出现明显临床症状，于14日内死亡或活鸡内脏有明显病变，应在(++)以上。3)禽源大肠埃希氏菌血清型根据国内目前禽源大肠埃希氏菌病流行情况，本发明选取了四个血清型中免疫原性优良的菌株作为制苗用菌株，分别为01，02，036，078血清型中的QLl株、QL2株、QL36株、QL78 株。2.禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的生产制备(I)抗原液制备I) H9亚型禽流感病毒液制备①毒种繁殖将H9亚型禽流感病毒株LGl株生产用毒种用灭菌生理盐水作500 1500倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 0. 3ml，收获24 96小时内死亡的鸡胚液，装于灭菌容器内，红细胞凝集价不低于1:256。②接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作500 1500倍稀释，尿囊腔内接种9 11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml。接种后S封针孔，直36 37 C继续鮮育，不必翻蛋。③孵育和观察鸡胚接种后，24小时照蛋I次，弃去死胚。以后每4 8小时照蛋I次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2 8°C冷却4 24小时。④收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液。在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、`胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价，死胚液血凝价应不低于1:256 (微量法)，活胚液血凝价应不低于1:64。收获的胚液取样作无菌检验，应无菌生长，置_15°C以下保存，应不超过3个月。2)禽源大肠埃希氏菌菌液制备将四个禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)菌分别接种含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤(制作方法见中华人民共和国兽用生物制品规程，二〇〇〇版，附录339页)，35 36°C培养20 24小时，分别收获菌液后按照3:3:2:2的体积比例混合,再将混合后的菌液按照2% 4%的接种量接种含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤，35 36°C通气培养10 14小时候后收获菌液。(3)灭活H9亚型禽流感病毒液灭活按0.1 0. 2%加入甲醛溶液，经37°C灭活48小时，其间每隔4 6小时振摇I次。禽源大肠埃希氏菌菌液灭活按0. 4% 0. 8%加入甲醛溶液，经38°C灭活48 72小时，期间每隔4 6小时振摇一次。(4)浓缩H9亚型禽流感病毒液浓缩用中空纤维超滤器将灭活后的病毒液浓缩成全量的
40 60%0禽源大肠埃希氏菌菌液浓缩将灭活菌液于2 8°C静置2 3日，抽弃上清，浓缩成全量的50% 70%。(5)乳化I)油相制备取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121°C高压灭菌30分钟，置室温下保存备用。2)水相制备取灭菌吐温-804份，加入灭活胚液96份(H9亚型禽流感灭活病毒液与禽源大肠埃希氏菌灭活菌液按1:1的比例混合)，充分振摇，使吐温-80完全溶解。3)乳化取油相2份放于胶体磨或乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0. 01%。乳化后，取3 5ml以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌一次。3.禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗成品检验( I)性状外观应为乳白色乳剂。剂型油包水型。 取I清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均应不扩散。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相应不多于0. 5ml。黏度按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本发明简称为“现行《中国兽药典》”)规定方法进行检验，应符合规定。(2)无菌检验按现行《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。(3)安全检验用3 5周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2ml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。(4)效力检验I)禽流感部分用7 10日龄SPF鸡15只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0. 3ml，另5只不接种作为对照。21日后，采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫鸡HI抗体几何平均滴度应> 1:90. 5，对照鸡应为阴性。2)禽源大肠埃希氏菌部分用I月龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗0. 3ml, 21日后连同条件相同的对照鸡8只，各肌肉或腹腔注射禽源大肠埃希氏菌菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)的混合菌液0.5ml (按照菌数1:1:1:1混合，共含活菌2 5亿)。观察10日，对照鸡应全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上);免疫鸡至少保护8只。
(5)甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。4、禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗主要技术指标(I)效力指标用7日龄SPF鸡15只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0. 3ml，另5只不接种作为对照。21日后，采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫鸡HI抗体几何平均滴度应> 1:90. 5，对照鸡应为阴性。用I月龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，21日后连同条件相同的对照鸡8只，各肌肉或腹腔注射埃希氏大肠菌杆菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)的混合菌液0.5ml (按照菌数1:1:1:)混合，共含活菌2 5亿)。观察10日，对照鸡应全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上);免疫鸡至少保护8只。(2)安全指标
用3 5周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2ml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。本发明涉及的微生物菌种本发明涉及到的H9亚型禽流感病毒株LGl株，为本发明人自行分离、保存。并已经商品化，产品名称鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，产品批准文号兽药生字(2010) 150252152。本发明涉及到的禽源大肠埃希氏菌有四个菌株，QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株
(036)、QL78株(078)，为本发明人自行分离，以上菌株已与2013年01月31日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号分别为QL1株为CGMCC No. 7241，QL2株为CGMCC No. 7242，QL36株为 CGMCC No. 7243 和 QL78 株为 CGMCC No. 7244。本发明的积极意义本发明涉及一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内禽类疫病中，H9亚型禽流感与禽源大肠埃希氏菌多血清型混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用H9亚型禽流感病毒LGl株和禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株
(078)作为疫苗制备用菌毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明涉及到的H9亚型禽流感毒株、禽源埃希氏大肠菌菌株均为国内流行菌毒株，能够有效预防目前流行疾病。实施例以下实施例进一步说明本发明。实施例1—生产用菌毒种制备(I) H9亚型禽流感病毒LGl株生产用毒种制备将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚
0.1ml，收获24 96小时内死亡的鸡胚液，装于灭菌容器内。将检验无菌且红细胞凝集价不低于1:256的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存。(2)禽源大肠埃希氏菌菌株生产用毒种制备一级种子繁殖将禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)各株冻干菌种分别接种于马丁肉汤中，36°C培养24小时，然后划线接种麦康凯琼脂平板上培养，选取粉红色或砖红色、边缘整齐、表面光滑、菌落隆起的典型菌落10个混合于少量马丁肉汤中，接种马丁琼脂斜面若干支、置36°C培养24小时，作为一级种子。在2 8°C保存，使用期不超过21日。二级种子繁殖取禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)各株一级种子接种于马丁肉汤中，36°C培养24小时，作为二级种子。在2 8°C保存，使用期不超过3日。实施例2—疫苗制备(I)抗原液制备I) H9亚型禽流感病毒液制备①接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml o接种后S封针孔，直37 C继续鮮育，不必翻蛋。②孵育和观察鸡胚接种后，24小时照蛋I次，弃去死胚。以后每4小时照蛋I次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2 8°C冷却。
③收获将冷却4 24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液。在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器中，每组抽样测定血凝价，死胚液血凝价均> 1:256，活胚液血凝价均> 1:64。收获的胚液按0. 1%加入甲醛溶液，经37°C灭活48小时，其间每隔4小时振摇I次。经检验灭活后，用中空纤维超滤器将灭活后的病毒液浓缩2倍。2)禽源大肠埃希氏菌菌液制备将各禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)菌株的二级种子液按照3:3:2:2的比例混合，接种含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤(制作方法见中华人民共和国兽用生物制品规程，二〇〇〇版，附录339页)，接种量为培养基量的3%，36°C培养12小时，收获菌液按0. 6%加入甲醛溶液，经38°C灭活60小时，期间每隔4小时振摇一次。将灭活菌液于2 8°C静置2 3日，抽弃上清，浓缩成全量的60%。(2)乳化I)油相制备取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121°C高压灭菌30分钟，置室温下保存备用。2)水相制备取灭菌吐温-804份，加入抗原液96份(H9亚型禽流感灭活病毒液与禽源大肠埃希氏菌灭活菌液按1:1的比例混合)，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
3)乳化取油相2份放于胶体磨或乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0. 01%。乳化后，取3 5ml以3000r/min离心15分钟，离心管中的疫苗无分层现象。实施例3-疫苗成品检验本实施例使用疫苗是本申请人按本发明提供的技术方案制备的6批禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，批号为201、202、203、204、205和206批。(I)性状外观应为乳白色乳剂。剂型油包水型。取I清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均未见扩散。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底无的水相析出。黏度按现行《中 国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本发明简称为“现行《中国兽药典》”)规定方法进行检验,结果均为38cP,符合规定。(2)无菌检验按现行《中国兽药典》规定方法进行检验，均无菌生长。(3)安全检验用3 5周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2ml、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，批号为201、202、203、204、205和206批)，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应(见表I)。表I禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗成品安全检验结果
权利要求
1.一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，其特征是该疫苗含有灭活的H9亚型禽流感病毒和灭活的Ol、02、078和036四个血清型禽源大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。
2.—种权利要求1所述的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于 (1)分别按常规方法用鸡胚繁殖H9亚型禽流感病毒制备成灭活并经浓缩的病毒液；用含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤分别培养的四型禽源大肠埃希氏菌菌液，经灭活和浓缩，再按3:3:2:2的体积比例混合成四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩菌液； (2)将以上制备的灭活并经浓缩的H9亚型禽流感病毒液与四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩混合菌液按1:1体积比混合后制备成水相，再按常规方法制备灭活佐剂疫苗。
3.—种权利要求1所述的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的应用，其特征在于给鸡接种有效剂量的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗能使接种鸡获得对H9亚型禽流感病毒和禽源大肠埃希氏菌国内流行菌毒株产生有效预防的免疫力。
全文摘要
本发明涉及一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内禽类疫病中，H9亚型禽流感与大肠埃希氏菌多混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用H9亚型禽流感病毒LG1株和禽源大肠埃希氏菌QL1株(O1)、QL2株(O2)、QL78株(O78)、QL36株(O36)作为疫苗制备用菌毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明涉及到的H9亚型禽流感毒株、禽源大肠埃希氏菌菌株均为国内流行菌毒株，能够有效预防目前流行疾病。
文档编号A61K39/295GK103055310SQ201310042429
公开日2013年4月24日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者鲍海忠, 鞠洪涛, 宋晓飞, 王蕾, 徐龙涛, 吴昊 申请人:齐鲁动物保健品有限公司