专利名称：氧化石墨烯负载苯那普利的复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含药物成分的复合物及其制备和应用，尤其涉及一种药物缓释载体及其制备方法和应用。
背景技术：
苯那普利是一种广谱降血压药，它能扩张动脉与静脉，降低周围血管阻力或后负荷，减低肺毛细血管嵌压或前负荷，也降低肺血管阻力，从而改善心排血量，增加运动耐量和延长运动时间。苯那普利水溶性较差，不能在水中很好溶解，这就导致无法在人体内很好地被吸收；其药物利用率低，且吸收效果不好，仅为37%左右，在体内大多以转化或排泄的方式流失，很难起到应有的药效。苯那普利在体内达峰时间短，约为0.5 I小时，药效持续时间较短，需要重复给药。苯那普利存在的水溶性较差、利用率低、药效持续时间较短等问题为该药的临床应用带来了诸多不便，因此，迫切需要研究和发展药物载体对其进行负载以解决以上问题。开发新的缓释载体对于提高苯那普利利用率、减少给药频率有重要作用。氧化石墨烯是石墨烯重要的衍生物，它在石墨烯片层表面及边缘接有环氧基、羰基、羟基、羧基等含氧官能团。氧化石墨烯保留了石墨烯的一些优异特性，如巨大的比表面积、大量的结合位点等。氧化石墨烯保留了石墨烯的六元碳骨架，使其表面可以提供大量的结合位点；能与含有苯环尤其是大量连续苯环的分子结合。氧化石墨烯还具有许多新特性，如氧化石墨烯表面的含氧官能团夺取了同层碳环中可移动的η电子，使得部分碳原子形成的大η键断裂，从而造成氧化石墨烯失去了传导电子的能力，导电性明显下降；同时，这些含氧官能团的存在，使得不同片层的官能团之间产生相互排斥的作用，而氧原子的引入又使其可以与水形成氢键，因而与石墨烯相比，它可以在水中较好地分散，亲水性大大高于石墨烯。氧化石墨烯所具备的特性使其在生物医学领域具有较好的应用潜力，这引起了研究人员的极大兴趣，如果能将氧化石墨烯与苯那普利进行复合，这对于解决苯那普利在现有给药方式中存在 的问题将具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种负载率高、释放具有PH响应特性的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，还相应提供一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的制备方法和应用，通过应用本发明的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，可以延长药物作用时间，减少用药频率。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，所述复合物中包含氧化石墨烯和苯那普利，所述氧化石墨烯的表面含有羟基、羰基、羧基、环氧基中的一种或多种，所述苯那普利吸附于氧化石墨烯分子表面。本发明的上述技术方案主要基于以下原理:苯那普利的两个苯环分别位于不同的平面，由于氧化石墨烯强烈的J1-JI共轭作用，两个苯环分别被吸附到相邻氧化石墨烯片层上(后续键长计算结果与实验事实相符)；氧化石墨烯上的-OH和-COOH则与苯那普利上的-NH-和-COOH基团产生氢键，加强了它们之间的作用力，而氢键不稳定，在一定情况下(如PH变化)会加强或减弱，这就为苯那普利的选择性剥离提供了可能，这也是氧化石墨烯作为药物缓释载体进而得到本发明复合物的基础(参见图6 )。上述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，所述氧化石墨烯对苯那普利的负载量优选为 0.8mg/mg 1.3mg/mg。上述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，所述复合物优选为饼状复合物。上述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，优选的，所述复合物对其中包含的苯那普利的释放具有PH响应特性，即随着PH值的降低，其释放时间和释放量不断增加。在强酸性条件下释放量最大，且持续释放时间长达24小时，而在碱性或中性环境下释放较少。因而在后续的药物载体应用中，特别适合用于在胃中释放并发挥药效，且用药间隔可以长达一天。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的制备方法，包括以下步骤:分别配制氧化石墨烯溶液和苯那普利溶液，将二者以1:0.5 2的体积比混合均勻，振荡过夜，再将混合溶液以3000rpm IOOOOrpm的转速离心5min 30min,取沉淀，冷冻干燥处理得到氧化石墨烯-药物复合物。上述的制备方法中，作为进一步的改进，本发明利用改进的氧化法制备含氧官能团丰富、亲水性好的氧化石墨烯；具体的，所述氧化石墨烯溶液的制备优选包括以下步骤:
(1)生成石墨层间化合物:向反应容器中加入提如混勻的闻纯石墨和闻猛酸钟的混合物，所述高纯石墨和高锰酸钾的质量比为1: 3 9，然后缓慢加入混合酸液并不停搅拌，控制搅拌温度在0°C 15°c,搅拌时 间为5min 20min,得到石墨层间化合物；
(2)石墨层间化合物的氧化:将步骤(I)得到的石墨层间化合物转至油浴中缓慢升温至40°C 80°C，反应IOh 20h，完成氧化过程；
(3)氧化石墨层间化合物的水解:将步骤(2)得到的氧化石墨层间化合物冷却至室温，然后滴加双氧水进行水解，搅拌均匀；
(4)纯化:将步骤(3)后得到的溶液先进行低速离心并取上清液，然后对上清液进行高速离心并取沉淀；将沉淀溶于水中进行超声处理，再进行透析纯化，直至析出液为中性且检测不出SO/—离子，即得到氧化石墨烯溶液。上述的制备方法，所述步骤(I)中，混合酸液优选是指浓硫酸与磷酸的混合液，且浓硫酸与磷酸的体积比优选为5 10: I。上述的制备方法，所述步骤(4)中，低速离心优选是指转速控制在IOOOrpm 3000rpm,高速离心优选是指转速控制在3000rpm lOOOOrpm。上述的制备方法，所述步骤(4)中，透析时用到的透析袋的截留分子量优选为8000Da 12000 Da0上述的制备方法，所述氧化石墨烯溶液的浓度优选控制在lmg/mL 10mg/mL，所述苯那普利溶液的浓度优选控制在10mg/mL 50mg/mL。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物作为苯那普利缓释载体的应用。
本发明的上述技术方案主要基于以下原理:首先，经过我们的反复验证，本发明制得的氧化石墨烯不能进入生物细胞，并没有表现明显的毒性作用，生物细胞能在氧化石墨烯薄膜上良好生长，这说明氧化石墨烯在细胞水平上是相当安全的；当氧化石墨烯浓度达到100 mg/L时，细胞的相对存活率仍接近100%，这说明其毒性相当低；另外，小尺寸的氧化石墨烯具有一定的溶血能力，而较大尺寸和团聚后的氧化石墨烯溶血能力降低，进一步采用壳聚糖修饰后，溶血性几乎完全消除，采用胎牛血清、叶酸等修饰后，同样未表现出明显的细胞毒性；这些研究说明，氧化石墨烯在生物体内非常安全，且具有较好的生物相容性；更为重要的是，本发明制得的氧化石墨烯表面含大量亲水性官能团，使其具有良好的润湿性能和表面活性；氧化石墨烯表面提供的大量结合位点和氢键结合位点，可使其与负载物形成π-π结合或氢键结合；同时考虑到氧化石墨烯的低生物毒性和高生物相容性，这使得本发明的氧化石墨烯非常适合作为药物载体，进而为成型本发明的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物提供了理论前提和实验基础。与现有技术相比，本发明的优点在于:
1.本发明采用含氧官能团丰富、水溶性好的氧化石墨烯作为药物载体负载苯那普利，氧化石墨烯具有巨大的比表面积，可以提供大量的结合位点与苯那普利中的苯环作用，使苯那普利药物分子吸附在氧化石墨烯表面，同时氧化石墨烯表面和边缘的含氧官能团还能与药物形成氢键作用；两种作用力使氧化石墨烯对苯那普利具有较高的负载率，高于大多数常规药物载体；
2.由于不同pH条件下氧化石墨烯与苯那普利中能形成氢键的基团种类和数量不同，造成了不同PH条件下相互作 用力的差异，从而形成了释放规律的pH响应特性，本发明的载药复合物在强酸性条件下释放量最大，且持续释放时间长达24小时，因而特别适合用于在胃中释放吸收，且用药间隔可以长达一天。综上，本发明提高了苯那普利的水溶性，延长了苯那普利的作用时间，减少了用药频率，本发明采用氧化石墨烯作为药物载体，开发除了负载率高、释放具有pH响应特性的载药体系，为实现苯那普利在不同pH条件下的可控释放提供了前提和基础。
图1是本发明实施例中制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的红外光谱对比图。图2是本发明实施例中制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的XRD对比图
-1'TfeP曰。图3是本发明实施例中制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的原子力显微镜照片。图4是本发明氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的微观结构示意图；其中，长条的弧形线条(图中示出3条)表示氧化石墨烯片，而弧形线条之间的S形曲线代表一个苯那普利分子，整体呈饼状。图5是本发明实施例中制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物在不同pH条件下的释放曲线。图6是本发明氧化石墨烯负载苯那普利的复合物中氧化石墨烯与苯那普利结合的微观机理示意图。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例:
一种如图1 图5所示本发明的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，该复合物中包含氧化石墨烯和苯那普利，氧化石墨烯的表面含有羟基、羰基、羧基、环氧基中的一种或多种(参见图1)，苯那普利吸附于氧化石墨烯分子表面。本实施例中，氧化石墨烯对苯那普利的负载量为1.12mg/mg(离心复合物后检测溶液中苯那普利的残留，借此即可计算复合物中结合的苯那普利的量)。该复合物为饼状复合物，该复合物对其中包含的苯那普利的释放具有pH响应特性(参见图5)。一种本实施例的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的制备方法，包括以下步骤:
(1)生成石墨层间化合物:冰水浴中放入二口圆底烧瓶，加入提如混勻的闻纯石墨Ig和高锰酸钾6 g的混合物，缓慢加入混合酸液(浓硫酸120 mL、磷酸13.3 mL)并不停搅拌，控制搅拌温度在10°C左右，搅拌20min，得到石墨层间化合物；
(2)石墨层间化合物的氧化:将步骤(I)得到的石墨层间化合物转至油浴中缓慢升温至50°C,反应18h后,完成氧化过程；
(3)氧化石墨层间化合物的水解:将步骤(2)得到的氧化石墨层间化合物冷却至室温，然后滴加双氧水进行水解，搅拌均匀；
(4)纯化:将步骤(3)后得到的溶液先进行2000rpm的低速离心，取上清液，然后对上清液进行8000 rpm的高速离心，取沉淀；将沉淀溶于水中进行超声处理5min，再用截留分子量为SOOODa 12000Da的透析袋进行透析纯化，直至析出液为中性且检测不出S042_离子，即得到氧化石墨烯溶液(冷冻干燥可得氧化石墨烯固体)；
(5)配制复合物:将步骤(4)制得的氧化石墨烯溶液(lOmg/mL)和另行配制的苯那普利溶液(50mg/mL),以1:1的体积比混合均勻,振荡过夜,再将混合溶液以8000 rpm的转速离心30 min，取沉淀，冷冻干燥处理得到氧化石墨烯-药物复合物。采用透析法研究载药复合物在不同pH下的释放效果，具体方法为:将氧化石墨烯-苯那普利复合物溶于不同pH值的水中，将该溶液置于透析袋于相应pH值的去离子水中进行透析，定时取样测定析出液中药物含量。在每个PH值进行3次平行实验即可得出其释放趋势曲线。本实施例制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的红外光谱图如图1所示，其中最上方为本实施例制得的氧化石墨烯的红外光谱图，中间为苯那普利的红外光谱图，最下方为氧化石墨烯负载苯那普利的复合物(GO-BENA)的红外光谱图，由图1可见，复合物的红外光谱出现了氧化石墨烯与苯那普利的红外谱图特征，这为本发明氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的成型制备提供了初证。由图1可见，1720 cm—1附近的吸收峰对应于氧化石墨烯边缘羧基、羰基的C=O伸缩振动，在1410 cm-1附近的吸收峰归属于氧化石墨烯表面的C-OH伸缩振动，在1090 CnT1附近的吸收峰则对应于氧化石墨烯表面C-O-C的伸缩振动。由此看来，氧化过程使石墨表面和边缘枝接上了很多含氧官能团，形成了氧化石墨烯。而苯那普利在3100 cnT1位置的吸收峰对应于N-H的伸缩振动；在2500 cnT1 2800 cnT1位置的峰对应苯那普利中的多个-CH2基团，且因各个-CH2所连官能团不相同造成的。在1500 cnT1 1900 cnT1位置处有4个强吸收峰，这是苯环对应的伸缩振动峰。在1200 cnT1位置的强吸收峰则是C-O-C所对应的。在GO-BENA复合物的红外谱图中，两者对应的特征峰都有体现，原位于17200^1的C=O峰位移到了 1715CHT1左右,这是由于π - Ji共轭和氢键的作用导致了向低波数的位移，这也说明氧化石墨烯和苯那普利的负载不是简单的物理混合，而是有化学键(氢键)的连接作用。本实施例制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的XRD图谱如图2所示，由图2的X射线衍射(XRD)分析可知，与苯那普利结合后，氧化石墨烯的2 Θ峰从9.86°位移到了 5.50。，对应的层间距从0.891 nm增加到1.642 nm，这说明苯那普利的引入撑大了氧化石墨烯层与层之间的距离，这也证明了苯那普利的负载位置位于氧化石墨烯表面。本实施例制得的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的原子力显微镜(AFM)照片如图3所示，由图3可知，氧化石墨烯负载苯那普利后，自组装成如图3、图4所示的饼状结构，在溶液中均匀分散，视野中饼状结构的平均厚度约8nm，直径约200nm。结合图1 图3，我们可以确定氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的微观结构如图4所示。通过计算可知，本实施例复合物中氧化石墨烯层数约为3层。苯那普利的分布是中间较多，周围较少，这是由于氧化石墨烯平面中间部分结构比较完整，共轭作用强，对苯那普利的固定作用较强；而平面四周的层间距相应较小，因此呈现出中间高、四周低的扁平饼状结构(参见图4)。经试验证明，本发明制得的氧化石墨烯不能进入生物细胞，并没有表现明显的毒性作用，生物细胞能在氧化石墨烯薄膜上良好生长，当氧化石墨烯浓度达到100 mg/L时，细胞的相对存活率仍接近100% ;另外，小尺寸的氧化石墨烯具有一定的溶血能力，而较大尺寸和团聚后的氧化石墨烯溶血能力降低，进一步采用壳聚糖修饰后，溶血性几乎完全消除，采用胎牛血清、叶酸等 修饰后，同样未表现出明显的细胞毒性；这说明氧化石墨烯在生物体内非常安全，且具有较好的生物相容性；此外，本发明制得的氧化石墨烯表面含大量亲水性官能团，使其具有良好的润湿性能和表面活性；氧化石墨烯表面提供的大量结合位点和氢键结合位点，可使其与负载物形成结合或氢键结合；同时考虑到氧化石墨烯的低生物毒性和高生物相容性，这使得本发明的氧化石墨烯非常适合作为药物载体。另外采用透析法研究本发明复合物在不同pH值下的释放效果，具体方法为:将本实施例的氧化石墨烯负载苯那普利复合物溶于不同PH值的水中，并将该溶液置于透析袋中于相应PH值的去离子水中进行透析，定时取样测定析出液中药物含量，在每个pH值条件下进行3次平行实验，得到如图5所示的释放趋势曲线。由图5可以看出，苯那普利在不同pH环境下的释放曲线趋势有一致性，前10个小时为其快速释放期，释放量占到释放总量的65% 75% ； 10小时到24小时释放变缓，24小时以后基本达到平衡状态。在不同PH值条件下，本发明的复合物具有不同的缓释效果，随着PH值的降低，本发明复合物的释放量不断增加，缓释时间不断延长。相比较而言，在强酸性条件下释放量较大，例如在PH=2的环境中，苯那普利的释放量可达58%，且持续释放时间长达24小时；而在碱性或中性环境下释放较少，在pH=7的环境中释放率为42%，在pH=10的环境中更少，仅为28% (参见图5)。因此，本发明的复合物特别适合用于在胃中释放并发挥药效，且用药间隔可以长 达一天，在口服药领域有潜在的应用前景。
权利要求
1.一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，其特征在于:所述复合物中包含氧化石墨烯和苯那普利，所述氧化石墨烯的表面含有羟基、羰基、羧基、环氧基中的一种或多种，所述苯那普利吸附于氧化石墨烯分子表面。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，其特征在于:所述氧化石墨烯对苯那普利的负载量为0.8mg/mg 1.3mg/mg。
3.根据权利要求1或2所述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，其特征在于:所述复合物为饼状复合物。
4.根据权利要求1或2所述的氧化石墨烯负载苯那普利的复合物，其特征在于:所述复合物对其中包含的苯那普利的释放具有PH响应特性，所述pH响应特性是指随着pH值的降低，其释放时间和释放量不断增加。
5.一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物的制备方法，包括以下步骤:分别配制氧化石墨烯溶液和苯那普 利溶液，将二者以1: 0.5 2的体积比混合均匀，振荡过夜，再将混合溶液以3000rpm IOOOOrpm的转速离心5min 30min,取沉淀,冷冻干燥处理得到氧化石墨烯-药物复合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯溶液的制备包括以下步骤: (1)生成石墨层间化合物:向反应容器中加入提如混勻的闻纯石墨和闻猛酸钟的混合物，所述高纯石墨和高锰酸钾的质量比为1: 3 9，然后缓慢加入混合酸液并不停搅拌，控制搅拌温度在0°C 15°c,搅拌时间为5min 20min,得到石墨层间化合物； (2)石墨层间化合物的氧化:将步骤(I)得到的石墨层间化合物转至油浴中缓慢升温至40°C 80°C，反应IOh 20h，完成氧化过程； (3)氧化石墨层间化合物的水解:将步骤(2)得到的氧化石墨层间化合物冷却至室温，然后滴加双氧水进行水解，搅拌均匀； (4)纯化:将步骤(3)后得到的溶液先进行低速离心并取上清液，然后对上清液进行高速离心并取沉淀；将沉淀溶于水中进行超声处理，再进行透析纯化，直至析出液为中性且检测不出SO/—离子，即得到氧化石墨烯溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中，混合酸液是指浓硫酸与磷酸的混合液，且浓硫酸与磷酸的体积比为5 10: I。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中，低速离心是指转速控制在IOOOrpm 3000rpm,高速离心是指转速控制在3000rpm IOOOOrpm ;透析时用到的透析袋的截留分子量为8000 Da 12000 Da。
9.根据权利要求5 8中任一项所述的制备方法，其特征在于:所述氧化石墨烯溶液的浓度控制在lmg/mL 10mg/mL,所述苯那普利溶液的浓度控制在10mg/mL 50mg/mL。
10.一种如权利要求1 4中任一项所述的或者如权利要求5 9中任一项制备方法得到的复合物作为苯那普利缓释载体的应用。
全文摘要
本发明公开了一种氧化石墨烯负载苯那普利的复合物及其制备和应用，复合物中包含氧化石墨烯和苯那普利，氧化石墨烯的表面含有羟基、羰基、羧基、环氧基中的一种或多种，苯那普利吸附于氧化石墨烯分子表面。本发明的制备方法包括以下步骤将氧化石墨烯和苯那普利溶液以一定体积比混合均匀，振荡过夜，再将混合溶液以一定转速离心，取沉淀，冷冻干燥处理得到氧化石墨烯-药物复合物。本发明的复合物可作为苯那普利的缓释载体进行应用。本发明的复合物负载率高、释放具有pH响应特性，其应用可以延长苯那普利作用时间，减少用药频率。
文档编号A61K9/00GK103120641SQ20131004308
公开日2013年5月29日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者王建方, 龙吟, 陶呈安, 邹晓蓉, 朱慧, 肖华, 盛丽萍, 胡智宏 申请人:中国人民解放军国防科学技术大学