蝉蜕蛋白酶酶解物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蝉蜕蛋白酶酶解物及其用途，具体步骤如下：A、净选蝉蜕，粉碎成细粉；B、将蝉蜕细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心，所得上清液和残渣备用；C、取上清液，干燥，得到蝉蜕胃蛋白酶酶解物；D、取残渣转入人工肠液中，加入胰蛋白酶水解，得到蝉蜕胰蛋白酶酶解物；步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。蝉蜕蛋白酶酶解物具有抗凝血或溶栓的作用。
【专利说明】蝉蜕蛋白酶酶解物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药制药领域，具体涉及蝉蜕蛋白酶酶解物及其应用。
【背景技术】
[0002] 蝶脱为蝶科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若虫羽化时脱落 的皮壳。性甘，味寒，归肺、肝经。具有疏散风热，利咽，透疹，明目退翳，解痉的作用，临床主 要用于风热感冒，咽痛音哑，麻疹不透，风疹瘙痒，目赤翳障，惊风抽搐，破伤风等。主要成分 为甲壳质及蛋白质、氨基酸等，药材中活性成分尚不清楚，因此目前多以全粉末入药，存在 着剂量大，易造成微生物污染等弊病。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃 肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子 物质，吸收入血而发生药效，故生物酶仿生提取方法模拟体内消化过程，提取的有效成分治 疗效果更佳。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种抗凝血和溶栓的蝉蜕蛋白酶酶解物及其应用。
[0004] 本发明的技术内容： 蝉蜕蛋白酶酶解物，由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心， 所得上清液和残渣备用； C、 取上清液，干燥，得到蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣转入人工肠液中，加入胰蛋白酶水解，得到蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
[0005] 蝉蜕蛋白酶酶解物，由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，密闭，于37°C恒温水浴30分钟后，加入3%胃蛋白酶水 解3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液置于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室 温，以4500r/min离心15分钟，所得上清液和残渣备用； C、 取上清液，干燥，得蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30分钟后，加入5%胰蛋白酶水解4小 时，将酶解液于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，取上清液， 干燥，得蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
[0006] 蝉蜕蛋白酶酶解物，由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，蝉蜕细粉与人工胃液的重量体积比为1:20,密闭，于 37°C恒温水浴30分钟后，加入3%胃蛋白酶水解3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶 酶解液置于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，所得上清液和 残渣备用； C、 取上清液，干燥，得蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30分钟后，加入5%胰蛋白酶水 解4小时，将酶解液于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，取上 清液，干燥，得蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
[0007] 所述蝉蜕胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制备抗凝血或溶栓的药物中的应 用。
[0008] 所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
[0009] 为了验证蝉蜕蛋白酶酶解物的抗凝血和溶栓作用，做了如下实验： 蝉蜕胃蛋白酶解产物抗凝血或溶栓活性评价： 本发明采用活化部分凝血酶时间法（APTT法）和纤维蛋白原平板法对活性成分的抗凝 血和溶栓效果进行评价，评价方法如下： 1材料 1. 1药材 蝉蜕(石家庄以岭药业股份有限公司提供)，置干燥箱60°C以下干燥，粉碎成细粉，备 用。
[0010] 1.2 试剂 牛纤维蛋白原（Sigma F8630,购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）;胰蛋白酶1 : 250 (Amresco0458,购自北京华美转导科技有限公司）;胃蛋白酶1 :10000 (Sigma P7000,购 自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；医用注射性尿激酶(购自北京市望京医院）；凝血 酶（Sigma T4648,购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；活化部分凝血酶时间（APTT) 试剂10*1. 5ml (购自上海太阳生物试剂公司）;三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公 司）；乙醇(分析纯)。
[0011] 生理盐水(称取氯化钠9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得）；人工胃液(取盐 酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得）；人工肠液(取0. 2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加 0. 2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)。
[0012] 1.3 动物 健康的雄性日本大耳白兔，体重约2Kg(北京维通利华实验动物技术有限公司提供）， 符合国家健康一级动物标准。
[0013] 1.4 仪器 UV-2000型分光光度计；800B型离心机(上海安亭科学仪器厂）；ES-120型电子分析天 平(长沙湘平科技发展有限公司）；恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂）；DZ-1BC型真空干 燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司）。
[0014] 2 方法 2. 1不同提取方法 2. 1. 1仿生酶解 称取蝉蜕药材细粉8g于250ml圆底烧瓶，按固液比1:20加入人工胃液(取盐酸9ml， 加蒸馏水稀释成l〇〇〇ml，即得)，密闭，于37°C恒温水浴作用30min后，加入3%胃蛋白酶水 解3h，将酶解液置于85°C恒温水浴作用15min灭酶，冷却至室温，以4500r/min离心15min， 取上清液水浴挥干，即得蝉蜕胃蛋白酶酶解物。残渣称重按固液比1:20加入人工肠液(取 0· 2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0· 2mol/L溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)， 密闭，于45°C恒温水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h,将酶解液于85°C恒温水浴 作用15min灭酶，冷却至室温，以4500r/min离心15min,取上清液，干燥即得蝶脱胰蛋白酶 酶解物。
[0015] 2. 1.2 水提取 称取蝉蜕药材细粉8g于250ml圆底烧瓶，按固液比1:20加蒸馏水，回流提取3次，每 次2h，合并提取液，干燥，即得蝉蜕水提物。
[0016] 2. 1.3水提醇沉 称取蝉蜕药材细粉8g于250ml圆底烧瓶，按固液比1:20加蒸馏水，回流提取3次，每 次lh，合并提取液，浓缩至药液比1:1，加入95%乙醇至含醇量90%，置冰箱中放置过夜后 4500r/min离心15min，取上清液回收干燥，即得蝉蜕90%水提醇沉物。残渣干燥，即得醇沉 (渣)。
[0017] 2. 2抗凝纤溶药效指标 供试品溶液的制备取上述适量蝉蜕提取物，加生理盐水或90%乙醇配制成浓度为 10mg/ml溶液，即为供试品溶液。
[0018] 取健康家兔(雌雄各半，产地北京）耳缘静脉注射乌拉坦麻醉，颈动脉取血，3. 8% 枸橼酸钠抗凝（1 : 9)，混勻后以1000r/min，离心lOmin，取上清液，即得富血小板血楽 (PRP)，以3000r/min，离心lOmin，取上清液，即得贫血小板血浆（PPP)。
[0019] 2.2.1 PT 试验 取ΡΡΡΙΟΟμ 1于测试杯中，加样品液10μ 1，37°C预温3min，加入PT试剂200μ 1(预温 3min)，开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间。以生理盐水为阴性对照（每个 样品平行测定6份） 2. 2. 2 APTT 试验 取ΡΡΡΙΟΟμ 1于测试杯中，加样品液10μ 1，37°C预温3min，加人APTT试剂100μ 1(预 温5min)，孵育5min后加入CaCl2 100μ 1(预温15min)，开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准 确记录凝固时间。以生理盐水为阴性对照(每个样品平行测定6份)。
[0020] 2. 2. 3血小板聚集率试验 PPP调零后，将PRP 300μ 1与样品液?ομ 1置于测试杯中37°C预温10min，加入诱导 剂ADP(lmmol/L) 10 μ 1，测定10min内血小板最大聚集率。以生理盐水为阴性对照(每个样 品平行测定6份)。
[0021] 血小板最大聚集率=PRP最大聚集时与基线之间的距离/90 X 100% 血小板聚集抑制率=(对照管血小板聚集率％_给药管聚集率％)/对照管血小板聚集 $%X100% 2. 2. 4血凝-纤溶动态图试验 取PRP 150μ 1与样品液10μ 1混勻，37°C预温10min，PPP调零，同时加入0· lmol/L CaCl2 50 μ 1，搅动10s，平衡记录仪记录动态图，直至图形峰值持续稳定2min为止，以生理 盐水或90%乙醇为阴性对照（每个样品平行测定6份)。所得曲线即为血凝-纤溶动态图。 根据动态图观察以下参数： ①凝固启动时间（CST):即从曲线开始前，与横轴平行的直线线段。CST反映从凝固 剂加入到纤维蛋白开始形成所需要的时闻，是体现血凝开始快慢的参数。?最大凝固程 度（MCE):即曲线上升的峰值段，也是开始凝固到凝固完全时透光度变化的峰值。MCE的高 低与测定用血浆量，即纤维蛋白原水平有关。它表示液态的纤维蛋白原已基本凝固成凝胶 态的纤维蛋白，凝固反应已基本完成。@凝固时间（CT):即从曲线开始到曲线峰值所需的 时间，CT是血浆开始凝固到凝固完全所需的时间，是反映血浆凝固快慢的参数。g)平均凝 固速度（ACR):即MCE / CT的比值，代表平均每秒钟形成的凝固程度，ACR是反映纤维蛋白 形成，即血凝反应速度的参数。
[0022] 3实验结果 3. 1 PT与APTT药效考察 经SPSS17. 0软件统计，PT结果表明，所有蝉蜕提取物均不能明显延长PT值，推测其抗 凝作用可能与外源性凝血系统无关。
[0023] APTT结果表明，与生理盐水对照，胰蛋白酶酶解物、水提物、90%水提醇沉(渣)可延 长APTT，推测其可干扰内源性凝血因子的活性，达到抗凝作用。结果见表1和图1。
[0024] 表1蝉蜕不同工艺提取物PT、APTT药效考察（交土s,n = 5 )
【权利要求】
1. 蝉蜕蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，然后加入胃蛋白酶水解，得到胃蛋白酶酶解液，离心， 所得上清液和残渣备用； C、 取上清液，干燥，得到蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣转入人工肠液中，加入胰蛋白酶水解，得到蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
2. 根据权利要求1所述的蝉蜕蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，密闭，于37°C恒温水浴30分钟后，加入3%胃蛋白酶水 解3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液置于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室 温，以4500r/min离心15分钟，所得上清液和残渣备用； C、 取上清液，干燥，得蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30分钟后，加入5%胰蛋白酶水解4小 时，将酶解液于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，取上清液， 干燥，得蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
3. 根据权利要求1所述的蝉蜕蛋白酶酶解物，其特征在于由以下方法制备： A、 净选蝉蜕，粉碎成细粉； B、 将蝉蜕细粉置于人工胃液中，蝉蜕细粉与人工胃液的重量体积比为1:20,密闭，于 37°C恒温水浴30分钟后，加入3%胃蛋白酶水解3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶 酶解液置于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，所得上清液和 残渣备用； C、 取上清液，干燥，得蝉蜕胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30分钟后，加入5%胰蛋白酶水 解4小时，将酶解液于85°C恒温水浴15分钟，冷却至室温，以4500r/min离心15分钟，取上 清液，干燥，得蝉蜕胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为蝉蜕蛋白酶酶解物。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的蝉蜕蛋白酶酶解物的应用，其特征在于：所述蝉蜕 胃蛋白酶酶解物或胰蛋白酶酶解物在制备抗凝血或溶栓的药物中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、 散剂、口服液或丸剂。
【文档编号】A61P7/02GK104055801SQ201310095752
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月23日 优先权日:2013年3月23日
【发明者】李晓燕, 赵韶华, 王鑫国, 王玉蓉 申请人:河北以岭医药研究院有限公司