胃酸分泌的快速作用抑制剂的制作方法

胃酸分泌的快速作用抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药学可接受的锌盐的用途，所述锌盐优选为单独或任选与一种或多种质子泵抑制剂(PPI)、H2阻断剂、抗-幽门螺旋杆菌抗生素/抗微生物、细胞保护剂或本文其它地方所述的组合药物组合的水溶性锌盐，所述锌盐用于提供在静息期间降低胃酸分泌，提高胃的pH，以及在分泌期降低胃酸释放时程的任选长时程的快速作用，且用于治疗包括胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、卓林格-艾丽逊综合征(ZE疾病)、溃疡病和胃癌以及预防或降低溃疡病可能性。而且，本发明的方法用于治疗对质子泵抑制剂(PPI)不相应的患者，且作为传统治疗的替代方法或由快速或完全抑制促分泌物产生胃酸分泌导致的病症。
【专利说明】胃酸分泌的快速作用抑制剂
[0001]本申请是申请号为200780003661.8的中国专利申请(国际申请日:2007年I月25日，国际申请号:PCT/US2007/001950，发明名称:胃酸分泌的快速作用抑制剂)的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及药学可接受锌盐的用途，所述锌盐优选为单独或任选与一种或多种蛋白泵抑制剂(PPI)、H2阻断剂、抗-幽门螺旋杆菌(H.pylori)抗生素/抗微生物剂、细胞保护剂组合，或本文其它地方所述的组合药物组合的水溶性锌盐，所述锌盐用于提供任选的减少胃酸分泌的任选长时程的快速作用，包括胃底的酸分泌(通过抑制小泡(vacuolar)H+-ATP酶)，和胃的上部区域的酸分泌(通过抑制H+/K+-ATP酶)，因而在静息期期间升高胃的PH值，并且在分泌期期间减少胃酸释放时程，和用于治疗包括胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、Zollinger-Ellison综合征(ZE病)、溃疡病和胃癌疾病，并阻止或减少溃疡病的发生可能性。此外，本发明方法可用于治疗对质子泵抑制剂(PPI)无反应的患者，并且作为传统治疗的替代方法，或治疗由快速或完全抑制促分泌物诱导的酸分泌所引起的疾病。
[0003]相关申请
[0004]本申请要求2006年I月27日的美国临时申请US60/762，595，2006年2月3日提交的US60/764，834和2006年10月11日提交的US60/850，891的优先权，每个所述申请在此处全部引入作为参考。
[0005]发明背景
[0006]哺乳动物胃壁细胞 的0.16N浓盐酸的产生包括神经和激素调节反馈环路的复杂组合卜3。在细胞激活后，存在复杂的离子的细胞转移，从而形成酸4'这些成分中任意一种的破坏(分泌受体、或离子转运体)可导致酸分泌的停止或酸分泌过多。后者中，每年超过三千万患者患有胃酸相关疾病，并且患者数量逐年增加8_n。临床上，酸的不受控制的释放或连续的分泌过多可导致胃和肠上皮两者均改变，但是在更严重的情况下，可导致食道糜烂，这可导致组织化生和死亡12_14。最近也出现了证据，表明高酸分泌性状态的复发期延长可导致胃类癌的形成15。
[0007]在尝试设计阻止胃酸分泌过多的治疗中，近年来使用了许多方法，其中两种最成功的是:a)胃壁细胞底外侧膜上组胺受体的抑制，b)靶向H，K-ATP酶的质子泵特异性药物(也称质子泵抑制剂；PPI) 16_18。两种治疗均极大地改善了患有这种疾病的患者的生活质量，然而当仍然服用药物时经历复发疾病的患者数量一直在增加19’2°。尽管这些治疗有高度的有效性并在全世界的临床上使用，但是也有胃酸相关疾病的治疗失败的报道，并且症状缓解的发生程度和速度对于患者是十分重要的21。估计约30%的GERD患者服用PPI的标准剂量时仍有症状22。此外，PPI药物具有较短的血浆半衰期，常导致夜间酸突破(breakthrough) 23 0在一般给药方案4_5天后，PPI的治疗口服剂量到达稳态并从而到达最大有效浓度24。PPI药物的这种缓慢并且累积作用的发生与它们仅抑制当PPI药物存在时有活性的泵的能力有关。在PPI给药后，有酸分泌的恢复，这是部分地由酶的从头合成所导
致的25。[0008]锌是饮食的重要部分，所有细胞需要锌以维持膜的完整性和功能。细胞内锌的缺乏导致细胞凋亡事件和细胞死亡26_3°。之前的研究探索了锌在保护性屏障又称胃表面的粘液凝胶层的增殖和产生中的潜在作用31_34。这些研究错误地将胃酸分泌的减少归咎于凝胶
层厚度的增加I35。
[0009]胃酸帮助蛋白消化；促进离子、钙和维生素B12的吸收；并且阻止细菌的过度生长。当酸和蛋白水解酶的浓度超过粘膜的防御机制时，溃疡发生。为了避免伴随这些严重病症的伤害，胃酸需被神经(例如乙酰胆碱)、激素(例如胃泌素和生长激素促泌素受体)，和旁分泌(例如组胺和生长抑制激素)多重通路，并且最近地通过钙敏感受体精细调节。任何调节通路的任何长期的改变导致细胞和阻止的破坏和临床表现，例如胃溃疡，或胃食管反流疾病(GERD)。通常使用两种方法治疗胃酸过度产生:a)外科手术，通过去除神经元件(迷走神经切断术)或b)药理学，既可通过组胺2受体拮抗剂，也可通过质子泵抑制剂(PPI’s)，或两者组合。
[0010]PPI药物例如奥美拉唑是胃H+/K+-ATP酶的不可逆抑制剂，最近开发了各种结合于H+/K+-ATP酶外表面的多重半胱氨酸残基的以奥美拉唑为母核化合物的衍生物，希望具有更紧密的分子结合，并且作用更长效。雷贝拉唑和兰索拉唑均是这些多重结合药物的例子，并且它们在胃腺的酸腔(acidic lumen)中活化，并且改变位于腔表面的H+/K+-ATP酶的半胱氨酸残基。在静止细胞中，酸分泌泵在管泡中，并且处于PPI药物只能抑制已经被活化并转移至胃壁细胞顶面的H+/K+-ATP酶的构象状态中。
[0011]尽管优化包括PPI类的药理学概貌可提供临床利益，但其他的研究领域可更有益，而且酸分泌过程的精细调节仍然不十分清楚，并且仍然是调节胃酸分泌治疗的重要靶点。
[0012]锌是大量生物过程所必需的，包括基因表达、复制、膜稳定、激素储存和释放，并且是酶的催化成分。在细胞水平没有对酸分泌的影响相关的锌的作用的研究。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylorus)存在于人胃粘膜的粘液层。由于pH值极低，胃是大多数其他微生物的不利环境。幽门螺旋杆菌在胃中活跃的能力归因于保护性机制，例如幽门螺旋杆菌的脲酶的产生，通过产生碱性微环境保护细菌免受胃酸度伤害，见，Taylor andBlaser, Epidemiol Rev, 13:42-59, (1991)。
[0013]胃是一个大器官，可分为3个主要区域，参与食物消化及液体和水的灭菌过程。当定义胃的功能过程时，通常分为两个区域:上胃，和下胃。上胃，被认为由胃底和胃体上部组成，并且表现为低频率、持久性收缩，负责产生胃中的基础压力。这种紧张性收缩也产生从胃至小肠的压力梯度，并负责胃胃排空。有趣的是，当吞咽食物时，由此导致的胃胀发生时，上胃作用以抑制此胃区域的收缩，允许胃充气，形成压力无显著增加的大库(largereservoir) ?下胃，被认为通过从胃此部分的胃壁细胞分泌HCl参与食物研磨和液化。
[0014]附图简述
[0015]图1A-E表明基础胃酸分泌、组胺诱导的胃酸分泌和通过ZnCl2抑制的原始图。分离单个的人和大鼠胃腺，用PH敏感的染料BCECF负载以测定单个胃壁细胞的细胞内pH值，并在加入酸后使用NH4Cl预脉冲技术(prepulse technique)从斜率计算PHi的恢复速率。(A, C)细胞外无Na+时，组胺(100 μ Μ)刺激的作为胃腺Η+/Κ+-ΑΤΡ酶功能的细胞内碱化。(B，D)组胺诱导的从胃腺的质子外流可被300 μ mol ZnCl2阻断。(E)柱图总结了平均值土 SE的数据(对照:n=32个细胞，3个腺，3只动物；组胺:n=120个细胞，15个腺，8只动物；组胺+ZnCl2:n=60个细胞，6个腺，4只动物)。
[0016]图2表明ZnCl2以剂量依赖的方式抑制胃酸分泌。在IOOymol组胺存在下，H+/K+-ATP酶活性(细胞内碱化表示为ΛρΗ/min)的ZnCl2浓度依赖与基础和组胺诱导的胃酸分泌相比较。(对于每个ZnCl2浓度有n=40个细胞，3-4个腺，3-4只动物)。
[0017]图3表明ZnCl2抑制作用的快速发生和可逆性。㈧原始图表明ZnCl2对组胺诱导的胃酸分泌的快速抑制作用。整个实验中加入组胺(ΙΟΟμΜ)。当观察到细胞内碱化(质子外流)时，向表面灌流槽加入ZnCl2 (300 μ Μ)。几秒后胃酸分泌消除(平的中间部分)。在将ZnCl2从表面灌流槽(superfusion bath)去除后,洗出药物,细胞内pH值继续增加。(B)原始图表明细胞用ZnCl2 (300 μ M)和组胺(ΙΟΟμΜ)孵育并灌流20分钟后的可逆性。在从表面灌流槽中去除ZnCl2后，细胞内碱化发生(质子排出)。
[0018]图4表明在口服ZnCl2使用后的胃酸分泌。向饮用水中加入300 μ mol ZnCl2。动物饮食和饮水与对照动物一样多。在实验之前，禁食12-18小时。如前所述测定组胺诱导的胃酸分泌。ZnCl2处理的动物的细胞表现出较低的质子外流(proton efflux)速率。150毫克/千克/天:0.022±0.0045; (n=60个细胞，10个腺，3只动物)，0.05毫克/千克/天:0.034±0.0036; (n=60个细胞，6个腺，4只动物)。
[0019]图5表明ZnCl2抑制新鲜分离的大鼠全胃标本的胃酸分泌。离体大鼠全胃标本在HEPES缓冲的林格溶液(对照:n=9) ,HEPES缓冲的林格溶液加100 μ M组胺(η=8)，或HEPES缓冲的林格溶液加100 μ mol组胺和300 μ mol ZnCl2 (n=8)中孵育。用组胺和ZnCl2孵育的胃标本的pH值比在HEPES缓冲的林格溶液和组胺中的胃标本高，并且其pH值与对照组胃的PH值相似。
[0020]图6表明测定使用本发明的大量锌盐的全胃管腔内(intraluminal)的pH测定。来自大鼠的分离的全胃标本在食道和十二指肠连接处插入导管，并在体外使用37° CPH7.4的林格溶液灌流。之后血灌流液加入100 μ M组胺，以诱导胃酸分泌。胃腔使用0.5cc的非缓冲等渗盐水灌注。在一些研究中，加入下列锌盐中的一种至腔灌流液中，终浓度300 μ M(氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、柠檬酸锌)。每个柱子的数据是来自5个单独动物的5个单独胃的总和。数据是所有研究的平均值，伴随显示的平均值的标准误差。
[0021]图7A-C表明大鼠胃底的免疫组织化学。㈧在大鼠胃底腺的胃壁细胞中胃H+，K+-ATP酶α亚基的免疫定位(40Χ)。(B)胃底胃壁细胞电子显微镜金标记的H+，K+-ATP酶蛋白。在此可见核、顶膜和小管样结构(8，OOOx)。(C)相同细胞放大倍数更高(25，000Χ)。在此可见金标记H+，K+-ATP酶蛋白分布于小管样结构的边界(箭头)。(在此图中:η=核，C=小管样结构，am=顶膜)
[0022]图8A-D表明在胃底(stomach fundus)和胃体中的基础胃酸分泌和组胺诱导的胃酸分泌。分离单个的大鼠胃腺，加入PH敏感的染料BCECF以测定单个胃壁细胞的细胞内pH值，并在加入酸后使用NH4Cl预脉冲技术从斜率计算PHi的恢复速率。(A)在从灌流槽中去除Na+后，Fl腺碱化(质子外流)的原始图。(B)细胞外无Na+时，组胺(100 μ Μ)刺激的为Η+/Κ+-ΑΤΡ酶功能的Fl腺的细胞内碱化。(C)在静息状态下胃体腺碱化图。⑶细胞外无Na+时，组胺(100 μ Μ)刺激的为Η+/Κ+-ΑΤΡ酶功能的胃体腺的细胞内碱化。
[0023]图9表明Fl腺的一系列促分泌素。Fl腺在基础状态下,没有刺激时,表现出碱化速率0.039 Δ pHi/mini0.009 (n=52个细胞/8个腺/5只动物)。在100 μ M组胺存在条件下，恢复速率是0.042 ± 0.007 Δ pHi/min (n=64个细胞/8个腺/6只动物)。在100 μ M乙酰胆碱存在下，Fl腺以0.075±0.0015 ApHiAiinOi=Se个细胞/10个腺/6只动物)的速率碱化。在100 μ M五肽胃泌素存在条件下，Fl腺表现出的碱化速率是0.062±0.007 Λ PHi/min (n=49个细胞/6个腺/5只动物)。
[0024]图1OA-D表明使用奥美拉唑和AZD0865的Fl腺与胃体腺胃酸分泌比较的原始图。分离单个的大鼠胃腺，加入PH敏感的染料BCECF以测定单个胃壁细胞的细胞内pH值，并如前所述在加入酸后使用NH4Cl预脉冲技术从斜率计算PHi的恢复速率。(A)表明在组胺(ΙΟΟμΜ)刺激后Fl腺碱化的细胞内pH值的测定原始图。此图表明奥美拉唑(200 μ M)没有抑制Fl腺的胃酸分泌。(B)在组胺(ΙΟΟμΜ)刺激后细胞内碱化的胃体腺图。此图表明奥美拉唑(200μΜ)抑制了胃体内的胃酸分泌，细胞内碱化速率0.014±0.(K^ApHi/min。(C)细胞内pH值的测定图，表明与胃体不同，AZD0865不完全抑制胃底内质子排出测定。暴露于10μΜ AZD0865的胃底腺，细胞内恢复速率是0.031±0.0OeApHi/min。(D)在胃体中，AZD0865表现出钾依赖的强的恢复抑制，细胞内碱化速率是0.021 ±0.008 ApHiAiiru
[0025]发明简述
[0026]本发明涉及用于快速抑制胃酸分泌的新组合物和方法，所述组合物和方法有较小的潜在副作用。首先，本发明涉及包含有效量的至少一种药学可相容的锌盐(优选水溶性盐)的锌组合物，所述锌盐可在患者胃中产生快速的胃酸分泌减少(即，在不超过约5分钟，不超过约10分钟，不超过约20分钟，不超过约30分钟，不超过约I小时的时期内)，伴随导致胃pH值增加(升高)至胃内pH值水平至少约为3.0-3.5，至少约为4.0，至少约为4.0至约为5.0。在本发明的 这方面，需要增加胃pH值的患者使用有效量的药学可相容的锌盐治疗，从而胃中发生快速的PH值升高。这种方法发明依赖于有效量的至少一种药学可相容的，优选水溶性锌盐的给药(优选，但不局限于，摄入)，并且大部分溶解在低PH值的胃液中，并且优选在从低pH (约1.0至约2.0)至高pH值(约5.5至约7.5或更高)的pH范围内，从而使有效量的锌盐的给药可提供酸释放的最初快速抑制和随后的胃中酸释放抑制的维持。在本发明中，胃酸抑制优选在约20分钟至约I小时的快速时期内抑制(通常，在不超过约5分钟，不超过约10分钟，不超过约20分钟，不超过约30分钟，不超过约I小时的时期内)。
[0027]虽然根据本发明的化合物的作用定位在上胃，特别是在胃的胃底区(通过对第二种可识别蛋白H+-ATP酶的抑制)和/或上胃的胃体上部(通过对H+/K+-ATP酶的抑制)，但患者胃中胃酸分泌快速减少的发生遍及整个胃(在上胃和下胃均通过对H+/K+-ATP酶的抑制)。因此，本发明的另一方面是有用于抑制H+/K+-ATP酶(通常遍及整个胃)、H+-ATP酶(主要在胃的胃低区)和优选两者均抑制的效量的药学可接受锌化合物的使用。本发明化合物可用于抑制胃底区的H+-ATP酶的发现具有重要的临床分支(ramifications),这是由于下列原因:
[0028]I)由于长期暴露于酸导致内出血、溃疡形成，和或胃类癌形成，暴露于酸导致的食道糜烂有威胁生命的后果。根据本发明，现在所表明一在胃底中的腺直接靠近食道连接(食道接合点)，腺分泌酸并且可被根据本发明的化合物抑制，因此制造特别对治疗GERD、NERD和相关病症有效的本发明化合物。
[0029]2)对PPI (质子泵抑制剂)不敏感和有酸反流疾病的复发症状的患者数量一直在增加。在胃底腺中确定的蛋白对PPI药物不敏感，并且可能是这些患者对经典治疗无反应的原因。
[0030]3)长时期使用PPI药物的患者表现出胃酸分泌的“反弹”。此结果可能与胃底H+-ATP酶相关，我们显示的这一结果对组胺和细胞内质子浓度敏感。
[0031]在本发明优选的实施方案中，优选水溶性的单个锌盐，不考虑pH值(即，在从约
1.0至约7.5或以上的pH值范围内)。用于本发明的优选盐是氯化锌。在另一个实施方案中，提供了低PH值的可溶性锌盐与高pH的可溶性锌盐或可容易地通过小肠吸收的锌盐(例如锌的氨基酸螯合化合物)的混合物，任选地，与药学可接受缓冲液组合。在本发明的这方面，单独提供了有效量的选自氯化锌(ZnCl2)、醋酸锌、抗坏血酸锌、氨基酸螯合锌(单或双螯合物)的锌盐和其混合物，优选氯化锌与至少一种醋酸锌、葡萄糖酸锌、抗坏血酸锌和氨基酸螯合锌的混合物，或提供与药学可接受载体、添加剂或赋形剂组合。
[0032]在多个方面中，本发明涉及单独使用至少一种的水溶性锌盐或与至少一种化合物/组合物的组合(在所治疗的疾病状态或病症的内容中)，所述化合物/组合物选自传统质子泵抑制剂化合物/组合物、H2阻断剂、抗生素/抗微生物剂(有效对抗幽门螺旋杆菌)、细胞保护剂或这些药物的混合物(Helidac, Prevpac)以提供减少胃酸分泌的快速作用，以降低胃的PH值，以预防溃疡病或降低溃疡病的可能性，以治疗溃疡病、治疗胃癌、治疗选自胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、Zollinger-Ellison综合征(ZE病)、溃疡病和胃癌的疾病或病症，并且预防或减少溃疡病发生的可能性。
[0033]药物组合物包含锌盐混合物，该锌盐使本发明快速和延长释放的特性均最大化，任选地与药学可接受载体、添 加剂或赋形剂组合，并且还任选与有效量的选自质子泵抑制剂、H2阻断剂、抗-幽门螺旋杆菌抗生素/抗微生物、细胞保护剂和药物组合的其他药物的组合是本发明的另一方面。可使用这些组合物任何一种或多种治疗本文其它地方公开的各种病症/疾病状态。
[0034]本发明涉及如下内容:
[0035]1.增加患者胃中胃液pH的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
[0036]2.上述I的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐的混合物。
[0037]3.上述I的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0038]4.上述2的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0039]5.上述I的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。[0040]6.上述I的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌。
[0041]7.上述1-6中任一项的方法，其中所述锌盐或至少一种所述锌盐为氨基酸螯合锌。
[0042]8.上述7的方法，其中所述氨基酸螯合锌选自:L_或D-氨基酸的单螯合物和二螯合物。
[0043]9.上述8或9的方法，其中所述氨基酸螯合物为锌与选自下述氨基酸的螯合物:L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸和L-甲硫氨酸。
[0044]10.上述I或2的方法，其中所述锌盐为氯化锌和任选至少一种选自下述的其它锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、硫酸锌和氨基酸螯合锌。
[0045]11.上述I的方法，其中所述锌盐为氯化锌。
[0046]12.上述1-11任一项的方法，其中所述锌盐或所述锌盐混合物与至少一种质子泵抑制剂共给药。
[0047]13.上述12的方法，其中所述质子泵抑制剂选自:奥美拉唑、艾美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑。
[0048]14.上述1-13任一项所述的方法，其中在给药所述锌盐不超过约I小时的时间内，所述患者中的所述胃液的所述PH升高至至少约3.0。
[0049]15.上述1-13任一项所述的方法，其中在给药所述锌盐不超过约30分钟的时间内，所述患者中的所述胃液的所述pH升高至至少约3.5。
[0050]16.上述1-13任一项所述的方法，其中在给药所述锌盐不超过约20分钟的时间内，所述患者中的所述胃液的所述PH升高至至少4.0。
[0051]17.降低溃疡可能性的方法，所述方法包括向由于胃中酸释放提高而有溃疡风险的患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
[0052]18.上述I的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐。
[0053]19.上述I的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0054]20.上述2的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌(可溶于胃的低pH的稀酸)、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0055]21.上述17-20中任一项的方法，其中所述锌盐与有效量的至少一种质子泵抑制剂组合。
[0056]22.上述21的方法，其中所述质子泵抑制剂选自:奥美拉唑、艾美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑及其混合物。
[0057]23.治疗患有选自下述疾病状态或病症的患者的方法:胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、卓林格-艾丽逊综合征(ZE综合征)、溃疡病和胃癌，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。[0058]24.上述23的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐的混合物。
[0059]25.上述23的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0060]26.上述23的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0061]27.上述23的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0062]28.上述23的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌。
[0063]29.上述23-28中任一项的方法，其中所述锌盐或至少一种所述锌盐为氨基酸螯合锌。
[0064]30.上述29的方法，其中所述氨基酸螯合锌选自:单和二螯合的L-或D-氨基酸。
[0065]31.上述29或30的方法，其中所述氨基酸螯合物为锌与选自下述氨基酸的螯合物:L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸和L-甲硫氨酸。
[0066]32.上述23或24的方法，其中所述锌盐为氯化锌和任选至少一种选自下述的其它锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、硫酸锌和氨基酸螯合锌。
[0067]33.上述23的方法，其中所述锌盐为氯化锌。
[0068]34.上述23-33中任一项的方法，其中所述锌盐或锌盐混合物与至少一种选自下述的药物共给药:质子泵抑制剂、H2阻断剂、细胞保护剂或两种或多种这些药物的混合物。
[0069]35.上述34的方法，其中所述质子泵抑制剂选自:奥美拉唑、艾美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑。
[0070]36.上述34的方法，其中所述H2阻断剂为西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁、雷尼替丁或其混合物。
[0071]37.上述34的方法，其中所述细胞保护剂为碱式水杨酸铋、硫糖铝或其混合物。
[0072]38.上述34的方法，其中所述药物混合物为prevpac。
[0073]39.上述23-38的方法，其中所述所述疾病状态或病症为GERD、NERD或ZE综合征。
[0074]40.上述2 3-38的方法，其中所述疾病为溃疡病且所述锌盐还可与至少一种选自下述的药物组合:抗-幽门螺旋杆菌剂或helidac。
[0075]41.抑制患者胃中小泡H+-ATP酶、H+/K+-ATP酶或同时抑制H+-ATP酶和H+/K+-ATP酶二者的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
[0076]42.上述41的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐的混合物。
[0077]43.上述41的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0078]44.上述42的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0079]45.上述41的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0080]46.上述41的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌。
[0081]47.上述41-46的方法，其中所述锌盐或至少一种所述锌盐为氨基酸螯合锌。
[0082]48.上述47的方法，其中所述氨基酸螯合锌选自:L_或D-氨基酸的单螯合物和二螯合物.[0083]49.上述47或48的方法，其中所述氨基酸螯合物为锌与选自下述氨基酸的螯合物:L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸和L-甲硫氨酸。
[0084]50.上述41或42的方法，其中所述锌盐为氯化锌和任选至少一种选自下述的其它锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、硫酸锌和氨基酸螯合锌。
[0085]51.上述41的方法，其中所述锌盐为氯化锌。
[0086]52.上述41-51中任一项的方法，其中所述锌盐或所述锌盐混合物与至少一种质子泵抑制剂共给药。
[0087]53.上述52的方法，其中所述质子泵抑制剂选自:奥美拉唑、艾美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑。
[0088]54.上述41-53 中任一项的方法，其中在给药所述锌盐不超过约20分钟的时间内，所述患者中所述胃液的所述pH增加至至少4.0。
[0089]55.上述41-54中任一项的方法，其中所述患者对于质子泵抑制剂治疗没有有效应答。
[0090]56.药物组合物，其包含有效量的至少一种药学可接受锌盐与有效量的质子泵抑制剂、H2阻断剂、抗-幽门螺旋杆菌剂、细胞保护剂，或其混合物的组合，任选与药学可接受载体、添加剂或赋形剂组合。
[0091]57.上述56的组合物，其中所述质子泵抑制剂为艾美拉唑、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑或其混合物。
[0092]58.上述56的组合物，其中所述H2阻断剂为西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁、雷尼替丁或其混合物。
[0093]59.上述56的组合物，其中所述抗-幽门螺旋杆菌剂选自:阿莫西林、克拉霉素(biaxin)、甲硝唑(fIagyl)、四环素及其混合物。
[0094]60.上述56的组合物，其中所述细胞保护剂为碱式水杨酸铋或硫糖铝。
[0095]61.治疗患者幽门螺旋杆菌感染的方法,所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐，任选与抗-幽门螺旋杆菌剂组合。
[0096]62.上述61的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐的混合物。
[0097]63.上述61或62的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0098]64.上述61-63中任一项的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0099]65.上述61或62的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
[0100]66.上述61或62的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌。
[0101]67.上述61-66中任一项的方法，其中所述锌盐或至少一种所述锌盐为氨基酸螯合锌。
[0102]68.上述67的方法，其中所述氨基酸螯合锌选自:L_或D-氨基酸的单螯合物和二螯合物。
[0103]69.上述67或68的方法，其中所述氨基酸螯合物为锌与选自下述的氨基酸的螯合物:L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸和L-甲硫氨酸。
[0104]70.上述67或68的方法，其中所述锌盐为氯化锌和任选至少一种选自下述的其它锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、硫酸锌和氨基酸螯合锌。
[0105]71.上述61的方法，其中所述锌盐为氯化锌。
[0106]72.上述61-71中任一项的方法，其中所述锌盐或锌盐的混合物与至少一种抗-幽门螺旋杆菌剂共给药。
[0107]73.上述72的方法，其中所述抗-幽门螺旋杆菌剂选自:阿莫西林、克拉霉素(biaxin)、甲硝唑(flagyl)、四环素及其混合物。
[0108]74.有效量的至少一种药学可接受锌盐在制备用于提高患者胃中胃液pH的药物中的用途。
[0109]75.上述74的用途，其中所述锌盐为至少两种锌盐的混合物。
[0110]76.上述74的用途，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0111]77.有效量的至少一种药学可接受锌盐在制备用于治疗患者选自下述疾病状态或病症的药物中的用途:胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、卓林格-艾丽逊综合征(ZE综合征)、溃疡病和胃癌。
[0112]78.上述77的方法，其中所述锌盐为至少两种锌盐的混合物。
[0113]79.上述77的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0114]80.至少一种药学可接受锌盐，任选与抗-幽门螺旋杆菌剂组合，在制备用于治疗患者幽门螺旋杆菌感染的药物中的用途。
[0115]81.上述80的方法，其中所述锌盐为至少两种锌盐的混合物。[0116]82.上述80的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0117]83.至少一种药学可接受锌盐在制备用于抑制患者胃中小泡H+-ATP酶、H+/K+-ATP酶或同时抑制H+-ATP酶和H+/K+-ATP酶的药物中的用途。
[0118]84.上述83的方法，其中所述锌盐为至少两种锌盐的混合物。
[0119]85.上述83的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
[0120]发明详述
[0121 ] 下列术语的使用遍及描述本发明的说明书。
[0122]术语“患者”或“受试者”指需要治疗的动物、优选哺乳动物，甚至更优选人，向它们给药根据本发明的化合物，以治疗使用根据本发明化合物可治疗的病症或疾病状态。根据治疗的疾病或病症，本文中术语患者指治疗疾病的动物。
[0123]使用术语“有效”描述治疗、化合物、组合物、成分或本发明相关方面，当在本文中使用时，产生预期结果，所述预期结果可包括胃中PH值的增加，酸过度释放相关的症状的减少，或疾病状态或病症的有利治疗。术语有效，包含此处所描述的一种或多种活性药物的量或浓度，和与产生预期作用一致的时期。
[0124]本文中使用的术语“药学可接受锌盐”或“锌盐”，指包含锌的盐或盐组合，溶解在降低PH值的胃液中，并且在约2或更低的低pH值条件下一定程度上在胃粘膜中吸收，在约
4.0至5.0或高于胃的较高pH和在小肠的高pH值条件下到达并在治疗期内维持血流中锌的有效浓度。示例性的药学可相容的锌盐包括无机和有机锌盐，例如醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌(在胃的低PH值稀酸中可溶)、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌和氨基酸螯合锌(包括，依赖于浓度，L或D氨基酸的单和双螯合物(优选，天然产生的L-氨基酸，其可从容易地从胃肠道吸收)，所述螯合物与锌复合或螯合，螯合物包括优选L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸(还可为D-组氨酸)、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸和L-甲硫氨酸等。注意对于本发明的目的，认为锌氨基酸螯合物为锌盐。优选地，药学可接受锌盐是水溶性的。
[0125]本领域普通技术人员将识别本发明中使用的有利的锌盐。在本发明的一方面，向患者给药至少一种药学可相容(pharmaceutically compatible)的、水溶性锌盐，以提供胃中酸释放的快速抑制，导致胃中PH在延长的时期内增加至高于4(通常在约4.0和5.0之间，在一些情况下高于5.0)，延长的时期优选至少2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时或更长时间。值得注意的是在本发明一些的优选方面中，选择对患者给药的锌盐或盐的组合可被调节至在低PH值的胃中提供始起始大剂量(bolus))浓度，以产生对酸释放的快速抑制，并升高胃中的pH值至高于约4的的水平。此外，优选的锌盐或盐的组合在不同的酸度水平和PH值一即在非常酸的水平(pH，小于约2.0)至pH约4.0或更高的水平抑制胃中的酸释放。
[0126]使用术语“提供减少胃酸分泌的快速作用”描述根据本发明的方法导致pH水平增加至至少约为4.0，更优选地至约4.0至约5.0或稍高，在不超过约30分钟，优选地在不超过约20-30分钟，甚至更优选地在不超过约10-20分钟，在约15分钟或更短的时期内，或任选择的，在不超过约5分钟的时期内pH水平增加。
[0127]术语“促分泌期(secretagogue)”指胃的胃壁细胞向胃液中分泌酸至较低pH值的时期。通常促分泌期在饭后发生，但酸的分泌可在其他时间发生。分泌期可为短的时程或长的时程。
[0128]术语胃食管反流疾病或“GERD”或“酸反流”是液体内容物反胃(回流，或反流)至食道的情况。液体可使食道的内层发炎并损伤，虽然这仅发生在少数患者中。反胃的液体通常包含胃产生的酸和胃蛋白酶。反流的液体也可包含从十二指肠回流至胃的胆汁。认为酸是最有害的反流液体成分。胃蛋白酶和胆汁也可损伤食道，但它们在食道炎症和损伤(食道炎)产生中的作用不如酸的作用明显。
[0129]GERD是慢性病症。一旦发生，通常是终生的。如果食道内层损伤(食道炎)，也是慢性病症。此外，在食道治疗痊愈和治疗停止后，大多数患者在几个月内损伤复发。因此，一旦GERD治疗开始，需要不断地持续治疗，通常为短期治疗。
[0130]事实上，胃液体内容物反流至食道中在大多数正常个体中发生。事实上，一项研究表明在正常个体中与在GERD患者中一样，反流经常发生。但是，在GERD患者中，反流液更经常包含酸，并且酸残留在食道中时间更长。
[0131]重力、吞咽和唾液是食道的重要保护机制，但只有当个体在直立位时有效。在晚间当睡觉时，重力没有作用，吞咽停止，病症唾液分泌减少。因此，在晚间发生的反流更可能导致酸在食道中残留更长时间并且导致对食道的更大损伤。
[0132]一些的病症使人对GERD敏感。例如，反流是怀孕期间严重的问题。妊娠的激素水平升高很可能通过降低食道下端括约肌的压力导致反流(见下)。同时，成长的胎儿增加腹压。这两种作用均可增加反流。而且，患有减弱食道肌肉疾病的患者(见下)，例如硬皮病或混和性的结缔组织疾病，更易于出现反流。
[0133]GERD的原因是复杂的。可能有多种原因，并且不在不同个体中可能有不同的原因，或者在相同个体中在不同时间原因可能不同。许多GERD患者产生异常大量的胃酸，但这在大多数患者中是不常见的并且不是疾病促成因素。促成引起GERD的因素是食道下端括约肌(lower esophageal sphincter)、食管裂孔_、食道收缩和胃排空。虽然不针对GERD的原因，但本发明可减少有害的酸反流至食道，导致损伤的趋势。
[0134]当食道收缩波缺损时，反流的胃酸不能推进胃中。在患有GERD的患者中，描述了收缩的几种异常。例如，收缩波在每次吞咽后不开始，或收缩波在到达胃前消失。而且，收缩所产生的压力太弱，不能将酸推回进胃。这种减少食道中胃酸清除的收缩异常，在GERD患者中经常发现。事实上，在患有最严重GERD的患者中，最经常发现收缩异常。在晚间，当重力不再对酸反流至胃有帮助时，异常食道收缩的作用加重。注意吸烟也大量减少酸从食道的清除。这种作用在末次吸烟后持续至少6小时。
[0135]大多数在白天期间的反流发生在餐后。这种反流很可能是由于含有食物的胃的膨胀所导致的瞬时的LES(食管下端括约肌)的松弛。已发现少数GERD患者，约20%，具有在餐后排空异常缓慢的胃。较缓慢的胃排空延长餐后含有食物的胃的膨胀。因此，较缓慢的胃排空延长更可能发生反流的时间。[0136]术语“非侵蚀性反流疾病(non-erosive reflux disease) ”或“NERD”用于描述特殊形式的GERD，如上所述。在一些情况下，GERD侵蚀食道内层，形成称为食道炎的病症。NERD是不引起食道炎的GERD。因为大多数GERD患者没有食道炎，NERD是最常见的GERD形式。因为它的名称包含单词“非侵蚀性的”，所以NERD似乎是最低严重度的GERD，但并不必然如此。NERD事实上更有可能产生额外的食道并发症，并且对胃底折叠术的反应可能性更低。在一项研究中，只有56 %的NERD患者(与90%的有侵蚀性反流的患者相比)报告了他们的症状通过胃底折叠术完全消除。NERD引起吞咽困难的可能性也是两倍。
[0137]胃灼热是NERD的主要症状。有许多潜在原因，包括食管裂孔疝、生活方式行为，和饮食。许多人通过简单的调整他们的行为处理胃灼热。在一些情况下，需要用药或手术。传统的抗酸药也用于治疗NERD。
[0138]术语“卓林格-艾丽逊综合征(Zollinger-Ellison syndrome) ”或“ZE综合征”在整个说明书中使用用于描述由激素胃泌素的异常产生导致的病症。在ZE综合征中，在胰腺或小肠中的小肿瘤(胃泌素瘤)产生血中高水平的胃泌素。ZE综合征是由通常发现于胰头和上部小肠中的肿瘤引起的。这些肿瘤产生激素胃泌素，并称为胃泌素瘤。高水平的胃泌素引起胃酸的过度产生。高胃酸水平导致胃和小肠中的多发的溃疡。患有ZE综合征的患者可经历异常疼痛和痢疾。在没有症状，有严重的胃和小肠的溃疡形成患者中也诊断怀疑为ZE综合征。
[0139]选择用于治疗ZE综合征的药物是如前所述的质子泵抑制剂(PPI)。这些药物显著地减少胃酸的产生，并促进胃和小肠中溃疡的痊愈。它们也提供了腹痛和痢疾的缓解。
[0140]如果有没有扩散至其他器官(例如淋巴结和肝脏)的证据，可尝试手术去除单个的胃泌素瘤。在今天很少需要对胃进行手术(胃切除术)以控制酸产生。肿瘤的早期诊断和手术去除相关的治愈率仅为20%至25%。但是，胃泌素瘤生长缓慢，病症患者可在发现肿瘤后生活很多年。在控制酸过度产生的症状中抑酸药物非常有效。
[0141]整个说明书中使用术语“溃疡”以描述组织糜烂区域，例如，特别是胃肠(GI)道内层、特别是胃(消化溃疡 )、食道或小肠(十二指肠溃疡)区域。由于糜烂，溃疡形成凹面。常低于周围组织的水平。溃疡有不同的原因，但在GI道中，认为主要是由于细菌
H.pyloridus(h.pyloridus)(幽门螺旋杆菌)的感染。然而，GI溃瘍可被压力、吸烟和其它非感染因素恶化，所述非感染因素特别包括过度的胃酸，因为较低的PH值对幽门螺旋杆菌是更好的生长环境。
[0142]幽门螺旋杆菌感染的传统治疗包括抗微生物药/抗生素，例如阿莫西林、克拉霉素(biaxin)、甲硝唑(flagyl)和四环素(“抗-幽门螺旋杆菌剂”)；H2_阻断剂，例如西米替丁(泰胃美(tagamet))、法莫替丁(pepcid)、尼扎替丁(爱希(axid))、雷尼替丁(善得胃(zantac));质子泵抑制剂(PPI)，例如艾美拉唑(耐信nexium)、兰索拉唑(prevacid)、奥美拉唑(prilosec)、泮托拉唑(protonix)和雷贝拉唑(aciphex);细胞保护剂,例如碱式水杨酸铋、硫糖铝；和药物的组合，例如Helidac (碱式水杨酸铋、甲硝唑和四环素组合)、Prevpac (兰索拉唑、克拉霉素和阿莫西林)。
[0143]使用本发明通过单独给药有效量的至少一种药学可药学可接受水溶性锌盐，或与至少一种其它的如上所述的传统治疗模式组合(优选，通过共给药)，治疗患者的幽门螺旋杆菌感染。[0144]使用术语“共给药(coadministration) ”或“组合治疗”描述使用至少两种有效量的活性化合物，同时用于一种或多种如本文其他地方所述疾病状态或病症的治疗。尽管术语共给药优选地包括向患者同时给药两种活性化合物，但不是必须同时向患者给药化合物，尽管有效量的个体化合物(individual compounds)会在患者体内同时存在。活性组合物可包括有效量的一种或多种如本文其他地方所述的锌盐和/或其他化合物/组合物，例如质子泵抑制剂、H2阻断剂、抗生素/抗微生物剂、细胞保护剂或组合药物，用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症通常使用这些化合物。
[0145]遍及说明书使用的术语“质子泵抑制剂”，将质子泵抑制剂描述为帮助控制胃灼热和胃食管反流疾病(GERD)疼痛不适，并促进胃和十二指肠溃疡痊愈的药物。质子泵抑制剂仅为处方可用。它们以片剂、胶囊、注射剂、或制成混悬液的粉末形式出现。
[0146]质子泵抑制剂通过阻断胃酸的产生发挥作用。它们抑制胃中称为质子泵的系统，所述质子泵又称“氢-钾三磷酸腺苷酶”系统。质子泵抑制剂作用相当广泛。使用质子泵抑制剂治疗胃和十二指肠溃疡，包括由服用非留体抗炎药导致的胃溃疡。还可用于缓解如上所述的食道炎(食道或食管发炎)和严重的胃食管反流(GERD)的症状。
[0147]与一些抗生素(例如阿莫西林和克拉霉素)或根据本发明的锌盐组合，质子泵抑制剂对于幽门螺杆菌的感染(胃的细菌感染)的治疗是有效的。幽门螺旋杆菌细菌是引起胃溃疡复发的主要原因。PPIs也是如上所述的称为卓林格-艾丽逊综合征的罕见病症的首选治疗方法。
[0148]尽管质子泵抑制剂易控制，但显示了副作用，包括痢疾、感到或出现不适、便秘、肠胃气胀、腹痛、头痛和更罕见地，过敏反应、搔痒、头昏、脚踝肿胀、肌肉和关节疼痛、视力模糊、抑郁和嘴干燥，和其他。质子泵抑制剂的长期使用可导致胃感染。由于质子泵抑制剂完全停止了酸产生一而胃酸帮助杀死微生物例如胃中细菌一使用PPIs可导致胃中潜在的有害微生物的生长。
[0149]质子泵抑制剂显示了显著的，有时为有害的药物相互作用，包括与癫痫药苯妥英和阻止血块的华法林的反应，以增加它们的作用，与酮康唑和伊曲康唑的反应，以减少它们的吸收性，与地西泮(valium)的反应，以减少它的代谢。
[0150]通常质子泵抑制剂服用I 一 2个月，但在某些情况下，可服用更长时间。当人停止服用质子泵抑制剂时，症状可能恢复。质子泵抑制剂可导致内出血，包括吐血、在呕吐物中检测道咖啡渣样物质，或黑柏油样便的指征出现，立即就医。
[0151]常用的质子泵抑制剂包括奥美拉唑(Prilosec)、艾美拉唑(Nexium)、兰索拉唑(Prevacid)、泮托拉唑(Protonix)和雷贝拉唑钠(Aciphex)。
[0152]本发明涉及提供减少胃酸分泌、升高静息期(resting phase)时胃的pH值、降低促分泌期时胃酸的释放时程的快速作用，并具有任选的长时程作用的方法，和治疗下述病症，包括胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、卓林格-艾丽逊综合征(ZE病)、溃疡病，和胃癌的方法，在这些病症中减少胃酸分泌是有益的，和通过减少胃酸分泌预防或减少溃疡病的可能性的方法。而且，本方法用于治疗对质子泵抑制剂(PPI)不响应的患者，并作为传统治疗的替代，或治疗由于快速且完全抑制促分泌而导致胃酸粉笔而引起的病症。
[0153]该方法包括给药有效量的至少一种药学可接受水溶性锌盐以减轻或治疗病症或、疾病状态。该方法可包括水溶性锌盐的单独给药或与如本文中公开的其他药物在单个时间(single time)的组合，或优选地组合更长时程，通常约2_3天至约2_3个月，具有不同的时间间隔，这依赖于治疗的预后(prognosis)和结果。
[0154]根据本发明锌盐可单独给药，或与其他化合物、组合物或治疗方法组合，依赖于治疗的病症或疾病状态，包括有效量的质子泵抑制剂或其他此处描述的可用于治疗幽门螺旋杆菌感染的药物。这些药物包括质子泵抑制剂，例如艾美拉唑、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑或雷贝拉唑、H2阻断剂例如西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁、抗-幽门螺旋杆菌剂例如阿莫西林、克拉霉素(biaxin)、甲硝唑(flagyl)或四环素、细胞保护剂例如碱式水杨酸秘或硫糖招、或组合药物例如Helidac或Prevpac。
[0155]在本发明优选的方面中，使用至少一种水溶性锌盐，其中锌盐或组合具有在低pH值(即，PH值约为1-2，发生在胃酸性情况下)和较高pH值(即，在胃中胃酸分泌被抑制后，PH值约为4-5或稍高，或者甚至更高一即在十二指肠中pH值约为5.5-6.0至在空肠和回肠PH值约为6.5-7.5 —在回肠中pH比空肠中稍高)中均可溶并且可吸收(通过胃肠粘膜)的特性。通过提供胃肠粘膜(即，在胃中和通过小肠的不同部分)水溶的和可吸收的组合物，使锌盐的生物利用度最大化，有利于病症或疾病状态的治疗。在这个方面，有效量的氯化锌和至少一种选自醋酸锌、葡萄糖酸锌、抗坏血酸锌和氨基酸螯合锌(单氨基酸螯合物或双氨基酸螯合物)的锌盐的组合是优选的，虽然其他锌的酸化合物组合可能产生有利的结果。
[0156]优选的锌盐包括质子化形式的阴离子平衡离子的pKa至少约为4至约为5.5或更高的锌盐。锌盐的混合物中优选所有锌盐在pH值从1-2至约7.5的范围内可溶。醋酸锌、葡萄糖酸锌、羟乙酸锌和抗坏血酸锌的单独或与另一种锌盐的组合，特别是氯化锌，在本发明的用途中是特别有用的。氨基酸螯合锌(单氨基酸螯合物或双氨基酸螯合物)也可为优选使用的，其中氯化锌和选自L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-N-乙酰半胱氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-牛磺酸、L-甘氨酸、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸的锌螯合物(单或双氨基酸螯合物)或其混合物的组合。
[0157]根据本发明优选 的锌盐包括氯化锌(由于与氯通道的相互作用，平衡离子(counterion)的pKa不重要)和有机酸锌包括醋酸锌(pKa4.75)、葡萄糖酸锌和抗坏血酸锌(pka为4.2和11.6)。此外，羟乙酸锌和乳酸锌也可优选使用，优选羟乙酸锌。当使用锌盐组合时，优选在胃中低PH值时有效的至少一种锌盐(用于迅速抑制胃酸分泌)与在胃中PH值为4.0-5.0或更高时显示增加作用的药物组合，或优选与在小肠吸收的药物组合(锌的单或双氨基酸螯合物)。
[0158]不限制于理论，认为在胃中低pH值条件下有效的锌盐(例如氯化锌和硫酸锌)和在较高PH值时有效的一种或多种有机酸锌盐的组合，可使锌至胃粘膜的传递最大化，以获得有利作用，起初通过溶解在胃的酸性胃液中，酸的起始抑制发生并且PH值升高，并且随后，通过胃或小肠中较高PH值条件下锌的吸收，锌的血中浓度增加到治疗水平。在胃中较高PH值水平或在小肠中较高pH值(5.5-7.5或更高)条件下锌盐的吸收和作用是有益的，因为锌吸收的延缓将在延长时期内减少在稍后时间的胃酸分泌(与在低PH值条件下的起始作用相比)。根据本发明的组合物可单个时间给予，但通常优选在约2-3天至几个月或更长的时期范围内每日一次或两次口服给药。[0159]根据本发明的组合物也与持续的(sustained)或延长的(extended)释放剂型有关，所述剂型包括第一成分，第一成分允许或促进在低PH值的胃液中的快速溶出，以便有效快速抑制胃酸分泌(在PH水平约为4.0至约为5.0或更高条件下具有组合(concombinant)增加)和第二成分，第二成分在胃，或更优选地，在小肠中的较高pH值条件下释放锌盐，以持续释放的形式维持血流中锌的有效水平，从而在长时期内抑制胃中的胃酸分泌。第一,决速作用成分可使用在低pH值的胃液中溶出的锌盐(例如氯化锌或硫酸锌在PH值约为1.0至约为2.0时)，使用标准赋形剂例如乳糖、粉末形式的糖粉、各种硬脂酸盐等容易地配制，第一快速作用成分在胃中快速溶出，并且第二种持续或延长释放剂型使用任何量的多聚粘合剂(polymeric binders)、基质(多聚的和/或易蚀的)、颗粒,或肠包衣中的任何一种,从而允许锌盐在小肠中的释放在延长或持续释放基础上。许多这些技术在本领域是众所周知的。示例性的专利例如Becker的美国专利4，863，741、Newton等人的美国专利4，938，967、MacFarlane等人的美国专利号4，940, 556和Morella等人的美国专利5，202，128，等，对于提供指导，所述技术是本领域众所周知的，对于本发明中使用的快速释放/持续或延长释放剂型的制剂是有用的。
[0160]上述制剂可用于提供如本发明其它地方所公开的一种或多种锌盐，和任选地，用于治疗或减少胃溃疡、GERD, NERD、卓林格-艾丽逊综合征、胃癌中的一种或多种和减少/抑制胃酸分泌和升高胃的PH值至约4.0至约5.0或更高的其他药物的生物利用度的提高。值得注意的是在胃中胃酸分泌的抑制中，约100微摩尔(μπιο?)的锌盐的血药浓度产生约70%的抑制。使用300 μ mol浓度的锌盐，抑制接近100%。从血液递送方面在100 μ mol或300 μ mol的抑制作用的时间是快速的(即锌盐一进入接触细胞膜，就发生抑制)。表明在促泌素存在下，抑制发生在约10-15分钟至约I小时的时间内。锌盐可口服给药(优选一天不超过一次或两次)或静脉给药，单独给药或与任选的PPI药物组合给药。
[0161]如此处描述的氯化锌的单独使用，或与至少一种其他的锌盐的组合使用是优选的。其他优选的锌盐包括醋酸锌、葡萄糖酸锌、抗坏血酸锌和氨基酸螯合锌(单和双氨基酸螯合物)。这些锌盐和组合可 单独使用或与其他药物组合，所述其他药物例如质子泵抑制剂(艾美拉唑、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑或雷贝拉唑)、H2阻断剂(西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁)、抗-幽门螺旋杆菌剂(阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑或四环素)、细胞保护剂例如碱式水杨酸秘或硫糖招、或组合药物例如Helidac或Prevpac。
[0162]药物组合物包含有效量的单独的药学可接受锌盐，或优选地与至少一种其他的锌盐或有效量的传统质子泵抑制剂例如艾美拉唑、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑或雷贝拉唑，H2阻断剂例如西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁或雷尼替丁，抗-幽门螺旋杆菌剂例如阿莫西林、克拉霉素(biaxin)、甲硝唑(flagyl)或四环素,细胞保护剂例如碱式水杨酸秘或硫糖招，或组合药物例如Helidac或Prevpac的组合,任选地与药学可接受载体、添加剂或赋形剂组合。
[0163]药物制剂包括适用于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉)给药。口服组合物或肠胃外组合物(特别是用于静脉给药的组合物)是优选的。根据本发明的组合物也可以大丸剂(bolus)、甜剂(electuary)或糊剂形式出现。用于口服给药的片剂和胶囊可包含常规的赋形剂，例如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可根据本领域众所周知的方法包衣。口服液体制剂可为例如水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或可以干燥产物与水或其他合适的溶剂在使用前组成的形式出现。这些液体制剂可包括常规的添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水溶剂(可包括食用油)、或防腐剂。上文讨论的理想剂型，使用本领域众所周知的标准方法，可适合于提供组合物中活性成分的持续释放的特性。提供在低PH值胃液中有效量的起始锌盐剂量，随后在较长时程内的提供锌的延长释放作用的组合物是优选的。
[0164]在根据本发明的药物方面，根据本发明的化合物优选配制为与药学可接受载体的混合物。通常，优选口服给药药物组合物，但特定的剂型可能优选肠胃外给药，尤其是，静脉或肌内剂量形式，也有通过其他的肠胃外途径，例如经皮、口腔、皮下、栓剂或其他途径，包括通过鼻内吸入。口服剂量形式优选片剂或胶囊(优选硬或软明胶)形式给药。静脉和肌内剂型优选在灭菌盐水中给药。当然，本领域普通技术人员可在说明书的教导范围内修改剂型，以提供多种用于特殊给药途径的剂型，而不使本发明的组合物不稳定或中和治疗活性。
[0165]特别的，本发明的化合物优选稳定的水溶性的，并且可使用水溶性的锌的混合物作为立即释放/持续释放药物形式。这可通过简单的选择盐的类型并且从而调节锌盐混合物的比例，使立即释放和较长时程作用最大化。当然，选择赋形剂以影响所使用的锌盐的递送和生物等效性。可以在技术人员的技术范围内修改特定化合物的给药途径和给药方案，以控制本发明化合物的药代动力学，从而使对患者的有益作用最大化。
[0166]包含本发明化合物的剂型可为固体、半固体、冻干粉末、或液体剂型，例如片剂、胶囊、粉末、持续一释放剂型、溶液、混悬液、乳剂、栓剂、乳膏、软膏、洗涤剂、气雾剂等，优选适于精确剂量的简单给药的单位剂量形式。
[0167]组合物通常包括传统的药物载体或赋形剂，并且还包括其他药物试剂、载体等，优选组合物是约0.05%至约75-80%重量的锌盐化合物或本发明化合物，其余由合适的药物添加剂、载体和/或赋形剂组成。对于口服给药，赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。视需要，组合物也可包含小量的非毒性辅助物质，例如润湿 剂、乳化剂或缓冲液。
[0168]液体组合物可通过在载体中溶解或分散化合物(约0.5%至约20% )，和任选的药物添加剂，例如盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油，或乙醇，从而形成溶液或混悬液。对于在口服液体制备中使用，组合物可制备为溶液、混悬液、乳剂或糖浆，即可在液体形式中使用也可在适于在水或正常生理盐水中水化的干燥形式中使用。
[0169]当组合物在用于口服给药的固体制剂形式中使用时，制剂可为片剂、颗粒剂、粉末、胶囊等。在片剂制剂中，组合物通常使用添加剂例如赋形剂，例如糖或纤维素制剂，粘合剂例如淀粉糊剂或甲基纤维素，填充剂、粉碎机和其他药物制剂制备中通常使用的添加剂制剂。
[0170]用于肠胃外给药的可注射组合物通常包含在合适的静脉溶液中的组合物，所述静脉溶液例如灭菌生理盐溶液。组合物也可配制在脂或磷脂、脂质体混悬液、或在水性乳剂中的混悬液。
[0171]本发明的药物组合物也可通过鼻气雾剂或吸入给药。这种组合物根据药物制剂领域中众所周知的技术制备，并且可制备为盐水中的溶液，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、以增强生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物，和/或其他常规增溶或分散剂。[0172]用于制备这些剂量形式的方法对于本领域技术人员是已知或将是明白的；例如，见“Remington，s Pharmaceutical Sciences” (第 17 版，)Mack Pub.Co, 1985)。普通技术人员利用本发明前药形式在向患有病毒感染的患者传递本发明化合物中适用的有利的药代动力学参数，从而使化合物的预期作用最大化。
[0173]根据本发明药物组合物也可包含其他活性成分，例如质子泵抑制剂、H2阻断剂、抗微生物剂、细胞保护剂或组合药物。此外，根据本发明的化合物也可包含抗癌药物(治疗胃癌)。每种活性化合物的有效量或浓度包括在根据本发明化合物的药物组合物中。
[0174]这种组合的个体化合物既可连续也可同时在单独或组合的药物剂型中给药。
[0175]当一种或多种的根据本发明的化合物与第二种治疗药物组合中使用时，化合物的剂量即可与当化合物单独使用时相同，也可不同。合适的剂量容易被本领域技术人员理解。
[0176]使用下列实施例描述本发明。可以理解的是它们仅是示例性的，并且理解为不以任何方式限制本发明的范围。
[0177]实施例
[0178]胃产生酸，以帮助分解食物，使食物更容易消化。在一些情况下，事实上胃酸可刺激胃和十二指肠(小肠末端)的内层。有时酸“反流”向上并且刺 激食道内层。刺激胃或食道内层导致酸消化不良(胃灼热)并且有时导致溃疡或出血。
[0179]我们表明在这种特殊应用中，ZnCl2在细胞水平上通过去除大鼠和人胃腺中胃的HVk+-ATP酶的活性，具有有效的对胃酸分泌的抑制作用。我们还表明微摩尔浓度的ZnCl2的加入，并且通过加入ZnCl2的饮食，可有效阻止在大鼠全胃中的组胺依赖的胃酸分泌。
[0180]材料和方法
[0181]动物。Sprague-Dawley大鼠，150-250克(Charles River实验室)在控制温度和湿度、循环光照的房间中饲养，喂食标准食物并自由饮水，并根据耶鲁动物管理(Yale AnimalCare)建立的动物管理的人道条例操作。在实验前，动物禁食18-24并自由饮水。
[0182]大鼠和人胃腺的分离。在去除胃后，纵向打开胃，并分离胃体和胃窦，并剪成0.5平方厘米的切片，并使用冰冷的林格溶液清洗以去除残余的食物颗粒。转移组织至解剖显微镜台上。使用之前描述的手-解剖技术(hand-dissection technique)分离单个的腺36。分离后，将单个的分离的腺粘附在盖玻片上，所述盖玻片提前包被Cell-Tak(Collaborative Research, Bedford, MA),并转移腺至倒置显微镜台上。
[0183]人组织从OR在HEPES缓冲的林格溶液中转移。组织储存在冰上，并立即如所述解剖分尚的腺。
[0184]细胞内pH值的数字成像。分离的胃腺如之前所描述的在包含10 μ mol的pH值敏感的染料BCECF-AM (2’，7’)- 二 - (2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基-荧光素，乙酰-甲基酯(Molecular Probes, Eugene, OR)的HEPES-缓冲的林格溶液中孵育10分钟3卜39。随后装有染料的小室使用HEPES溶液冲洗，以去除所有非去酯化(non-de-esterfied)染料。灌注室装在倒置显微镜(Olympus 1X50)台上，使用表面荧光模式，物镜40x。从单色器光源在440nm和490nm连续激发BCECF,并且在535nm使用加强的电荷稱合元件照相机记录监测的荧光信号。描画感兴趣的个别区域并同时在实验过程中每15秒监测。最少每个腺体选择8个细胞或区域。
[0185]通过使用包含20mM NH4Cl的无Na+的HEPES溶液使细胞酸化后，观察PHi的恢复，检测单个胃壁细胞的质子排出。之后胃壁细胞使用无Na+的HEPES灌流，去除了所有Na+/H+交换体(NHE)的活性，使H+留在细胞质中，并且pHi开始立即下降。在这种情况下，唯一可能的H+排出通路是通过H+/K+-ATP酶的激活。
[0186]强度比数据(490/440)使用高K+/尼日利亚菌素校准技术(nigericincalibration technique)转为pH值4°。细胞内pH值恢复速率从相同的起始pH值计算，以消除在不同实验情况在个体细胞的可能的细胞内缓冲能力的差异。包括所有波长的个体图像的所有数据记录在硬盘上，这样允许我们在实验后可回到个体图像进行进一步分析。恢复速率表示为ΛρΗ/min，并在pH值为6.5-6.8的范围内计算。所有化学药品来自于Sigma和Molecular Probes0所有数据总结为平均值土标准误差，并通过在基线值分组测定进行数据分析。
[0187]全胃pH值测定。在实验之前，动物禁食24小时以减少基础胃酸分泌至一致的最小值。使用过量的异氟醚处死并进行剖腹。在十二指肠和食道连接处结扎胃，并切断。之后灌注Iml的非缓冲的、等渗盐水(140mM)进入胃腔。此体积不使胃扩张，因此避免潜在的由伸张导致的胃酸分泌刺激。之后将胃放置于充氧的HEPES-缓冲的林格溶液中或仅包含100 μ M组胺或还包含300 μ M ZnCl2 (pH7.4)的相同溶液中，并保持在37° C。I小时后，胃内容物通气并且记录PH值。
[0188]大鼠口服锌补充给药。设计这些研究以通过增加饮食锌调节胃酸分泌。在这些研究中，我们使用口服的ZnCl2溶液(氯化锌在自来水中)。在研究时程中动物自由进食并且自由饮用包含锌的水。向饮用水中加入150毫克/千克/天或0.5毫克/千克/天的ZnCl25天。动物在实验前自由饮水，并使用标准食物喂食，直至实验前24小时，在实验前24小时它们仅可自由饮用含包含ZnCl2的水。5天给药期(exposure period)和24小时的禁食后，处死动物，并对动物执行全胃切除术。使用上述手解剖技术分离单个胃腺。
[0189]结果
[0190]在人和大鼠中的组胺诱导的胃酸分泌可被ZnCl2抑制。新鲜分离的胃腺中的单个胃壁细胞的第一组PH 4则 定用于H+/K+-ATP酶活性的测定。质子泵活性在无钠和碳酸氢盐调节下，从使用NH4C1预脉冲技术酸化后的PHi ( Δ pHi/min)的碱化率计算。在这些条件下的H+排出依赖于H+/K+-ATP酶的活性，如前所示41。在无任何刺激条件下，仅观察到低的pHi恢复速率(0.011 ±0.002--单位/分钟，n=32个细胞来自于3个腺，3个腺来自于3只动物；图1E)。在大鼠胃腺接触组胺(100 μ M)后，碱化率增加至0.051 + 0.004ρΗ单位/分钟(η=60个细胞来自于15个腺，15个腺来自于8只动物；图1Α)。在组胺(100 μ Μ)存在条件下，向表面灌流槽加入300 μ M的ZnCl2阻止组胺对Na+-非依赖的PHi恢复速率(0.0012±0.004ρΗ单位/分钟)的刺激作用，并且减少至与没有接触组胺的对照腺(η=60个细胞，来自于6个腺，6个腺来自于4只动物；图1Β)相同的水平。人胃腺还表现出在组胺刺激下的强的质子外流。这种作用可被ZnCl2去除(图1C，D) ;(η = 26个细胞，3个腺)。因此新鲜分离的大鼠和人的胃腺表现出Η+/Κ+-ΑΤΡ酶活性，所述Η+/Κ+-ΑΤΡ酶活性可被组胺刺激，并可被ZnCl2抑制。
[0191]ZnCl2以剂量依赖的方式抑制大鼠胃酸分泌。ZnCl2以剂量依赖的方式抑制H+排出(图2)。在此实验方案中，组胺可刺激胃酸分泌，并且表示为ApHi/分钟。因此大鼠胃腺使用ΙΟΟμΜ组胺(15分钟)孵育，并且组胺在整个实验中出现。为了研究ZnCl2的抑制能力，我们使用不同浓度(25 μ Μ-300 μ Μ)。ZnCl2在整个实验中出现，包括组胺孵育的15分钟时期。与组胺诱导的质子排出速率和对照相比，300 μ M的ZnCl2表现出98%的质子排出抑制。
[0192]通过ZnCl2的胃酸分泌的快速发作和可逆抑制。可用的的酸阻断剂有不可逆的(即奥美拉唑)和可逆的(P-CAB’ S)42。我们研究了在我们的体外装置中ZnCl2的抑制作用的可逆性。因此我们在整个实验期间使用组胺(ΙΟΟμΜ)刺激胃酸分泌。当观察到细胞内碱化(胃酸分泌)，向表面灌流槽加入ZnCl2 (300 μ Μ)。在几秒后胃酸分泌停止(图3Α)。在相同实验中，去除ZnCl2后，胃酸分泌返回至正常水平。我们还能够表明在胃壁细胞使用ZnCl2 (300 μ Μ)和组胺(ΙΟΟμΜ)孵育和表面灌流20分钟后的可逆性。在从表面灌流槽去除ZnCl2后，细胞内碱化(质子排出)以正常的非抑制速率进行(图3Β)。
[0193]口服锌补充给药减少大鼠的基础胃酸分泌。设计这些研究以通过增加饮食锌调节胃酸分泌。向饮用水中加入150毫克/千克/天或0.5毫克/千克/天的ZnCl25天。使用如前所述的BCECF测定H+排出速率。组胺刺激的胃壁细胞表现出强的恢复速率(质子排出)0.051 ±0.004 (n=120个细胞来自15个腺8只动物)。图4表明与仅给组胺的对照组相比，在饮用水中的ZnCl2 (150毫克/千克/天或0.5毫克/千克/天)显著降低组胺诱导的胃酸分泌。150毫克/千克/天:0.022±0.0045; (n=60个细胞来自10个腺来自3只动物)，0.05毫克/千克/天:0.034±0.0036; (n=60个细胞来自6个腺来自4只动物)。
[0194]ZnCl2降低离体的胃酸产生。为了确定是否ZnCl2能抑制整个器官中的胃酸分泌，我们检测了在HEPES中或有100 μ M组胺的相同溶液或100 μ M组胺和300 μ M ZnCl2均有的溶液中孵育的新鲜分离的大鼠胃的胃腔(luminal)pH值。如图5中所示，组胺存在下，平均的胃腔pH值比仅孵育在HEPES中的对照胃标本低(3.15±0.27对4.59±0.48，每组n=9, P〈0.005)。组胺和ZnCl2存在下，胃腔pH值几乎与没有刺激的对照组一样高，尽管此发现没有显著性(4.54 ± 0.065 对 4.59 ± 0.48，每组 η=8, Ρ>0.005)。
[0195]不同的锌盐在升高管腔内pH方面表现出不同的效力。使用许多根据本发明的锌盐，对整胃管腔内PH值进行测定，评价盐和浓度对管腔内pH值的作用。分离的大鼠整胃标本在食道和十二指肠连接插管，并且使用37° C pH7.4的林格溶液体外灌流。之后血灌流液加入100 μ M组胺，以诱导胃酸分泌。胃腔使用0.5cc的非-缓冲的等渗盐灌注。在一些研究中，向胃灌流液中加入终浓度为300 μ M的下列锌盐中的一种(氯化锌，硫酸锌，醋酸锌，柠檬酸锌)。对于每个柱图数据为来自5个单独动物的5个单独胃的总和。数据是所有研究的平均值，伴随显示平均值的标准误差。这些结果见附加的图6。
[0196]讨论
[0197]在此研究中，我们检测了在人和大鼠胃腺中通过ZnCl2的剂量依赖的胃酸分泌抑制。此外我们试图评价ZnCl2作用的发生(onset)并使用整胃制备和口服锌补充剂(supplementation),研究对胃酸分泌的作用。
[0198]通过经典已知的促分泌的组胺诱导胃酸分泌，组胺通过H+，K+-ATP酶，与静息时的未刺激的胃腺的基础胃酸分泌比较可导致强的质子排出图1e)。在随后的研究中，我们检测了 ZnCl2对促分泌敏感的胃酸分泌的抑制作用。我们证实ZnCl2 (300 μ M)对组胺诱导的胃酸分泌的抑制能力。ZnCl2以剂量依赖方式抑制单个的胃腺中的胃酸分泌。ZnCl2消除质子排出至人和大鼠胃腺对照实验中相似的水平(图1)。此剂量与人每日40毫克的补充剂相当。锌摄取的每日推荐量是11毫克。在文献中，认为10倍高的量是有毒的。因此，40毫克的ZnCl2作为口服的胃酸阻断剂显著低于报道的毒性剂量。此外，相同量的ZnCl2还可阻止在离体整胃标本中的胃酸分泌(图5)。在这些实验中向胃的管腔面施用ZnCl2，并且因此结论是金属离子直接作用在胃壁细胞的H+/K+-ATP酶或进入细胞调节胃酸分泌的信号转导通路。ZnCl2如何进入细胞现在仍不清楚。之前的研究描述了锌进入细胞通过在底外侧膜上的电压依赖性的Ca2+通道和/或HC03/C1_交换体。口服施用的ZnCl2证实了我们之前的结果。通过ZnCl2处理大鼠，质子排出与对照组的胃酸分泌相比显著降低(图4)。对照指组胺刺激。在图中，锌处理的腺仍比对照组(非-组胺处理)高。[0199]如在介绍中提到的，质子泵抑制剂的急性作用延迟发生，并且完全的抑制作用很慢，要求几个剂量循环。例如奥美拉唑在第一天治疗时仅到达30%的抑制43。我们的研究以ZnCl2作用的快速发生和可逆性为特征。作用的快速发生和作用时程的延长可向GERD和其他胃酸相关疾病的患者提供病症改善。如图5a中我们可以通过加入300 μ M ZnCl2在最大质子排出期间抑制组胺诱导的胃酸分泌。另一方面，在从表面灌流槽中去除ZnCl2后组胺诱导的胃酸分泌持续，这表明ZnCl2的可逆性(图3b)。
[0200]对我们的发现的总结表明ZnCl2可提供更快速和更延长的胃酸分泌的抑制。在单个的大鼠和人胃腺和整胃标本中，胃酸分泌的抑制剂是可逆的和快速作用的。
[0201]这种治疗可向GERD患者提供显著的益处。进一步研究通过ZnCl2抑制胃酸分泌的确切机制是必需的，并且所述研究将帮助定义ZnCl2在临床情况中的胃酸相关疾病治疗中的未来地位。
[0202]胃底区(fundicregion)
[0203]在下列实施例中，表明胃的胃底区和胃底腺包含功能性的酸分泌蛋白。此外，表明胃底腺有钠和钾非依赖性蛋白质子ATP酶，通常指小泡H+-ATP酶。证据包括使用抗体对H+-ATP酶亚基的免疫荧光数据和功能数据(图7-10)，其中测定在没有Na和K的情况下这些细胞的质子排出速率。此外有证据表明此过程在组胺存在下放大，认为组胺是仅影响胃体的胃壁细胞中的胃的H，KATP酶的化合物。在大鼠模型和进行胃去除手术的患者中去除的切除胃中活性是明确的。
[0204]材料和方法
[0205]动物和化学药品
[0206]体重在200_300g的雄性Sprague Dawley大鼠，在气候和湿度控制,光照循环的房间中饲养，并喂食标准饲料，伴随自由饮水。在实验之前，动物禁食，同时允许自由饮水18-24小时，以降低基础胃酸分泌。在异氟醚麻醉后，处死动物，剖腹暴露胃。在分离食道和十二指肠连接后进行全胃切除术，保留连接切除胃的1-2厘米的食道。我们总结食道连接对于所有的胃底分离有通常的界标。使用镊子夹住接近胃底3_的食道时，去除5_的完整食道。
[0207]胃底腺分离
[0208]去除的胃底组织放置于冰冷的HEPES-缓冲的林格溶液(在4° C pH值调节至
7.4)中，并且转移至解剖显微镜台上。在50X的放大倍数下观察胃底腺。临近食道连接的腺用手分离。在分离后，单个的腺粘至盖玻片，所述盖玻片用生物粘合剂Cell-Tak(Cell-TakTM细胞粘合剂，BD Biosciences; Bedford, MA)预处理。[0209]免疫组织化学/免疫突光
[0210]雄性Wistar大鼠(200-250克)使用戊巴比妥腹腔注射麻醉，并通过左心室使用PBS灌流，随后使用如前所述的多聚甲醛-赖氨酸-高碘酸盐(PLP)固定剂灌流19a。去除并清洗胃中食物残余，并在4°C浸在PLP中固定过夜。使用PBS清洗胃三次，并且在2.3M的在PBS中的冷冻保护剂中至少12小时后，切成5 μ m厚度的片。如前所述进行免疫染色2°a。切片在I %的SDS中孵育5分钟，使用PBS清洗3次，在一抗使用之前使用含有1%牛血清白蛋白的PBS孵育15分钟。一抗(primary antibody)(小鼠单克隆抗人β胃H+，K+-ATP酶，Affinity Biorereagents，CA，USA)使用PBSl:50稀释，在4。C使用过夜。之后切片使用高NaCl的PBS (PBS+2.7%NaCl)清洗两次，每次5分钟，使用PBS清洗一次，并使用二抗孵育(驴抗兔，Alexa546, Molecular Probes, Oregon),在室温1: 1000稀释。切片使用高NaCl 的 PBS 清洗两次，并且在使用 VectaMount (Vector Laboratories, Burlingame, CA)固定前使用PBS清洗一次。样本使用Nikon E-800显微镜观察。
[0211]免疫金标记
[0212]大鼠使用5ml的10%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。使用PBS和PLP通过左心室的心脏灌流固定。去除胃并在PLP中固定4小时，之后转移至保持缓冲液过夜。胃食道连接冷冻并制作Epon切片，并且切片用 于金标记和电子显微镜观察。
[0213]苏木素伊红染色
[0214]大鼠使用5ml的10%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。通过左心室的心脏灌流固定，使用PBS以冲洗，并且之后使用Karnovsky固定剂灌流2小时，之后在保持液中过夜。制作胃食道连接切片，切片用于电子显微镜观察H+，K+-ATP酶蛋白的形态，和在胃食道连接处腺的苏木素/伊红染色。
[0215]离体胃底腺的细胞内pH值(PHi)的测定
[0216]使用与我们发展的离体胃腺灌流2°a’21a的相同方法，单个的胃底腺加入10μΜ浓度的pH敏感染料(BCECF，(2’ 7-双(2-羧乙基)-5-(和6)-羧基荧光素-乙酰基甲基酯；Molecular Probes, OR USA)) 15分钟。在加入染料后，灌流室固定在倒置显微镜台上(Olympus 1X50),显微镜连接至数字成像系统(Universal ImagingCorp; Dowingtown, PA)，并且使用HEPES缓冲的林格溶液在37° C灌流5分钟，以去除未酯化的染料。在表面荧光模式中使用60x/.80和40x/.90物镜进行测定。BCECF在440± IOnm和490±10nm连续激发，产生的细胞内荧光信号在535nm使用加强的电荷耦合元件照相机监测。每15秒获得数据点。获得的490/440强度比数据使用高K+/尼日利亚菌素校正技术22as’22as转化为细胞内PH值(PHi)。在没有碳酸氢盐的情况下监测酸排出。在使用NH4Cl-预脉冲技术22a’23a之后测定细胞内碱化的速率，所述NH4Cl-预脉冲技术可导致可重现的并且持续的细胞内酸化。在包含:1)100 μ M组胺2) 100 μ M五肽胃泌素3) 100 μ M乙酰胆碱4) 100 μ M组胺+100 μ M和200 μ M浓度的奥美拉唑的无Na+的HEPES溶液中，测定细胞内pH值的恢复速率(H+，K+-ATP酶活性)。
[0217]细胞内pH值的恢复速率从相同初始的起始pH值减去在不同实验情况下细胞的单个(individual)细胞内缓冲能力的可能变化来计算。在硬盘上记录包括全波长的单个图片的所有数据，从而允许我们在实验后返回到单个图片，用于进一步分析。恢复速率表示为Λ PHi/分钟，在pH值为6.5-6.9的范围内计算。[0218]通过组胺、乙酰胆碱或五肽胃泌素的胃酸分泌的活性通过在与BCECFdOO μ Μ)负载的实验前，将腺预孵育15分钟而诱导。所有数据总结为平均值土S.E.。显著性使用单因素方差分析检测，Ρ〈0.05认为有统计学显著性。所有的化学药品获得自Sigma和MolecularProbes。
[0219]结果
[0220]H+，K+-ATP酶的免疫组织化学定位
[0221]使用特异的抗体定向高度保守的胃H+，K+-ATP酶的α或β亚基中的表位的免疫组织化学实验确定在胃底腺(fundic glands)中两种亚基的特异染色(图7A)。
[0222]电子显微镜
[0223]在获得禁食大鼠的胃食道连接(Junction)Epon切片后，做电子显微镜的胃腺观察，所述胃腺是正在此连接之后的胃腺，并命名为F1，并在我们所有的实验中使用。图7B、C表明在胃底腺的胃壁细胞中的H+，K+-ATP酶金标记定位。我们注意到在分泌或小泡小管中细胞的顶点染色密度较高。这可能与胃底区与胃体相比高的基础质子排出速率有关，因为蛋白通常在胃底腺中的膜上，而胃体受体在分泌小管的内侧，直至有刺激。
[0224]H2受体染色
[0225]在胃底和胃体中均进行H2受体染色，以检测受体在胃两个区域的存在和密度。我们发现在胃体腺中清晰的底外侧染色，并且胃底腺不能检测到染色。这些结果与组胺刺激胃底胃酸分泌的作用缺乏有关。可见H2受体在胃底腺没有，在胃体存在(没有显示出数据)。
[0226]促分泌素诱导的胃酸分泌
[0227]使用pH值敏感的 染料BCECF检测细胞内pH值，并使用实时的荧光成像系统持续监测，以确定细胞内PH值的改变。质子外流速率计算为Λ PHi/分钟，使用我们实验室开发的用于胃体腺的技术21a_25a。我们检测了促分泌素存在和缺失情况下外流速率的改变。
[0228]组胺对胃底和胃体H+，K+-ATP酶的作用
[0229]我们使用100 μ M组胺孵育单个腺20分钟。在整个表面灌流方法期间，存在组胺。在胃体腺中，我们测定了组胺刺激的质子排出速率为0.056±0.008 ApHi/分钟，而没有任何促分泌素的基础胃酸分泌为0.011±0.002 ApHi/分钟(图8C、D)。与胃体比较，胃底甚至在基础情况下表现出高的质子排出速率(0.039±0.009 Λ PHi/分钟)。这与组胺诱导的胃酸分泌相似(0.040±0.0079 ApHi/分钟，图8Α、Β)。此数据表明与对照组比较组胺对Fl区的腺没有作用。
[0230]乙酰胆碱和胃底胃酸分泌
[0231]下面我们根据通过ACH的神经刺激研究了胃底腺的功能特性。与组胺不同，在刺激后有显著的质子排出速率改变。尽管对照组仍活跃地排出质子，但在染料负载和整个灌流期间，使用100 μ M乙酰胆碱刺激20分钟的腺的质子排出速率增加。我们测定乙酰胆碱引起碱化速率的增加(0.075 ±0.0015 ApHi/分钟对对照组0.039 ±0.009 ApHi/分钟)，表明乙酰胆碱对胃底胃酸排出的直接作用(图9)。
[0232]五肽胃泌素对Fl区的作用
[0233]为了确定是否胃泌素也可激活胃底(fundic)的H+，K+-ATP酶，我们进行了使用五肽胃泌素的研究，所述五肽胃泌素是合成的肽，包含胃泌素的全部5个末端氨基酸，已知胃泌素可导致胃体腺中的强胃酸分泌。在剂量为100 μ M的五肽胃泌素存在下，我们观察了碱化速率，为0.062±0.0OTApHi/分钟，这与乙酰胆碱在增强胃底细胞的质子排出速率方面相似(图9)。
[0234]胃酸分泌抑制剂
[0235]在下面的研究中，我们试图确定是否胃底腺有与胃体中所观察到的相似的H+，K+-ATP酶抑制剂情况。我们选择了典型的胃H+，K+-ATP酶抑制剂奥美拉唑和P-CAB(钾竞争性的酸阻断剂)AZD086526’27。
[0236]奥美拉唑对Fl区和胃体的作用
[0237]如图1OA中所示，使用与在胃体中可完全抑制促分泌素诱导的胃酸分泌的相同浓度的奥美拉唑不抑制胃底中的胃酸分泌(图10B)。即使使用比在胃体中通常抑制胃酸分泌的剂量更高的剂量，胃底持续排出质子。使用200 μ M奥美拉唑和100 μ M组胺预孵育胃底腺，并且随后使用奥美拉唑和组胺在整个实验中灌注。碱化速率是0.045±0.002 ApHi/分钟，与仅组胺刺激的对照组0.042±0.007 Δ PHi/分钟的速率比较。相反，在胃体腺中的胃酸分泌被200 μ mol奥美拉唑消除(0.014±0.002 ApHi/分钟)，(图10B)。
[0238]与胃体比较AZD0865对Fl区的作用
[0239]图10 (C、D)也表明，10 μ M浓度的P-CAB AZD0865有效地抑制胃体中的胃酸分泌；然而在相同浓度，Fl区仍然有钾依赖的恢复。在胃底，细胞内pH值增加至0.031±0.0OeApHi/分钟的速率。在胃体，在相同浓度IOyM下，恢复速率为
0.021 ± 0.008 ApHi/ 分钟。
[0240]表1
[0241]用于检测单个大鼠胃腺中细胞内pH的溶液组合物
[0242]所有浓度以Mm给出。NMDG为N-甲基-D-氨基葡萄糖，所有溶液在37° C用NaOH或KOH滴定至ρΗ7.4。NMDG用HCl滴定。
[0243]表1
[0244]
【权利要求】
1.增加患者胃中胃液PH的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
2.权利要求1的方法，其中向所述患者给药至少两种锌盐的混合物。
3.权利要求1的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌及其混合物。
4.权利要求2的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、丁酸锌、碳酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、碘化锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘油酸锌、羟乙酸锌、甲酸锌、乳酸锌、吡啶甲酸锌、水杨酸锌、酒石酸锌、十一碳烯酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
5.权利要求1的方法，其中所述锌盐选自:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌或其混合物。
6.权利要求1的方法，其中所述锌盐选自至少两种选自下述的锌盐:醋酸锌、抗坏血酸锌、柠檬酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌、氨基酸螯合锌。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述锌盐或至少一种所述锌盐为氨基酸螯合锌。
8.权利要求7的方法，其中所述氨基酸螯合锌选自:L-或D-氨基酸的单螯合物和二螯合物。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述锌盐或所述锌盐混合物与至少一种质子泵抑制剂共给药。
10.降低溃疡可能性的方法，所述方法包括向由于胃中酸释放提高而有溃疡风险的患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
11.治疗患有选自下述疾病状态或病症的患者的方法:胃食管反流疾病(GERD)、非侵蚀性反流疾病(NERD)、卓林格-艾丽逊综合征(ZE综合征)、溃疡病和胃癌，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
12.权利要求11的方法,其中所述锌盐或锌盐混合物与至少一种选自下述的药物共给药:质子泵抑制剂、H2阻断剂、细胞保护剂或两种或多种这些药物的混合物。
13.抑制患者胃中小泡H+-ATP酶、H+/K+-ATP酶或同时抑制H+-ATP酶和H+/K+-ATP酶二者的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐。
14.药物组合物，其包含有效量的至少一种药学可接受锌盐与有效量的质子泵抑制剂、H2阻断剂、抗-幽门螺旋杆菌剂、细胞保护剂，或其混合物的组合，任选与药学可接受载体、添加剂或赋形剂组合。
15.治疗患者幽门螺旋杆菌感染的方法,所述方法包括向所述患者给药有效量的至少一种药学可接受锌盐，任选与抗-幽门螺旋杆菌剂组合。
16.有效量的至少一种药学可接受锌盐在制备用于提高患者胃中胃液pH的药物中的用途。
17.至少一种药学可接受锌盐，任选与抗-幽门螺旋杆菌剂组合，在制备用于治疗患者幽门螺旋杆菌感染的药物中的用途。
18.至少一种药学可接受锌盐在制备用于抑制患者胃中小泡H+-ATP酶、H+/K+-ATP酶或同时抑制H+-ATP酶和H +/K+-ATP酶的药物中的用途。
【文档编号】A61K31/555GK103463096SQ201310174056
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2007年1月25日 优先权日:2006年1月27日
【发明者】约翰.P.盖布尔, 菲利普.柯克霍夫 申请人:耶鲁大学