修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法

专利名称：修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法。本发明还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶，也称作丝氨酸内肽酶，是在活性位点包含丝氨酸残基的蛋白消化酶。这些酶在自然界是广泛的，并且在多种生物学功能、包括消化、血液凝固、免疫系统和炎症中发挥作用。由于丝氨酸蛋白酶的广泛分布和功能，这些酶的抑制剂是常见的。在自然界可以发现很多蛋白性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且已经开发了用于研究和治疗的很多合成的、 化学的丝氨酸蛋白酶抑制剂。凝血酶是在血液凝固中发挥重要作用的丝氨酸蛋白酶家族的成员；通过该过程， 响应于血管损伤，丝氨酸蛋白酶的循环酶原通过有限蛋白水解被依次激活以产生纤维蛋白凝块。凝血酶与多数酶原和它们的辅因子相互作用，在血液凝固中发挥多种促凝剂和抗凝剂作用(Huntington000 ，和Di Cera(2003))。作为促凝剂蛋白酶，在起始期产生的最初的痕量凝血酶激活因子V(FV)和因子VIII (FVIII)以提供阳性回馈，引起凝血酶的爆发。 凝血酶也可以激活因子XI，激发内在途径。凝血酶将纤维蛋白原切割为纤维蛋白，形成不可溶的凝块。通过凝血酶激活的因子XIII驱动的共价交联，纤维蛋白聚合物被进一步加固和稳定化。凝血酶还促成血小板栓的产生，可能是通过两个机制(a)其通过与蛋白酶激活的受体(PAR)和糖蛋白V相互作用而激活血小板；和(b)通过灭活ADAMTS13，其防止血小板栓的脱稳定化，ADAMTS13是具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解离素和金属蛋白酶，其切割von Willebrand因子(VWF)。作为抗凝剂蛋白酶，凝血酶在存在辅因子血栓调节蛋白的情况下激活蛋白C(APC)。APC灭活因子Va(FVa)和因子VlIIa(FVIIIa)，下调凝血酶的产生(Huntington Q005)，Di Cera (2003)，Davie 等人(1991)，Davie (2003)和 Lane 等人 (2005))ο由于凝血酶的重要作用，其是抑制以控制凝结级联的主要靶标，很多凝血酶抑制剂已经被用于治疗和研究很多年了。肝素是原型的凝血酶抑制剂，其作为凝血酶的间接抑制剂发挥作用，意思是其通过抗凝血酶复合物作用，不与凝血酶的活性位点直接相互作用。 凝血酶的间接抑制剂仅能与可溶性凝血酶相互作用，因此，一旦形成凝块，则不能抑制凝血酶。更近期以来，已经分离和/或开发了多种凝血酶直接抑制剂，包括蛭素 (hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和达比加群酯(dabigatran etexilate)。这些具有能够抑制可溶形式和与纤维蛋白结合的形式的凝血酶的治疗性优点。然而，此类直接抑制剂具有某些性质，远远达不到最佳。例如，蛭素引起出血风险、依赖于肾功能的药代动力学、缺乏解毒药、有免疫原性和反跳性高凝性。比伐卢定被蛋白水解和肾途径的组合清除，其具有可忽略的免疫原性潜能，但仍具有亚适治疗性质。
鉴于丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗上的重要性，需要鉴定显示出改进的性质的另外的丝氨酸蛋白酶抑制剂。特别地，需要鉴定这样的凝血酶直接抑制剂具有抑制可溶形式和与纤维蛋白结合形式的凝血酶的能力但不具有与目前可获得的凝血酶直接抑制剂相关的缺点。

发明内容
本发明提供了修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂，产生修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，以及使用修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂例如抑制受试者中的靶丝氨酸蛋白酶的方法。因此，在第一方面，本发明提供了产生显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，包括修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP 的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。在该方面的一个实施方式中，该方法包括将能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基导入 SPI0在另一个实施方式中，方法产生修饰的SPI，其显示出延长的抑制持续时间。在一个实施方式中，所述的一个或多个导入的氨基酸残基是通过置换或插入导入的。在该方面的另一个实施方式中，所述的能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个残基包括催化性丝氨酸残基。在该方面的另一个实施方式中，该方法进一步包括修饰SPI使其能被中和的步骤，包括将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，将所述导入的离子电荷区域导向SPI的羧基末端。 在另一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域是阴离子电荷区域。在一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。在另一个实施方式中，所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。在另一个实施方式中，所述中和试剂是硫酸精蛋白。在前述方法的示例性实施方式中，SPI是凝血酶抑制剂。在另一个示例性实施方式中，SPI选自由SEQ ID NO 14和17-153中的任一项组成的组。在另一个方面，本发明提供了通过任意前述方法可获得的或获得的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在一个实施方式中，所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。在示例性实施方式中，修饰的SPI包含下列共有序列N-末端肽PX1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽) (SEQ ID NO 771)。在另一个方面，本发明提供了显示出靶SP的增强的抑制的修饰的SPI，其中SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。在该方面的一个实施方式中，修饰的SPI包括能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方式中，修饰的SPI显示出延长的抑制持续时间。在该方面的另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶 SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在另一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个氨基酸残基包括催化性丝氨酸残基。在该方面的另一个实施方式中，修饰的SPI进一步包括离子电荷区域，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，离子电荷区域向SPI的羧基末端放置。在另一个实施方式中，离子电荷区域是阴离子电荷区域。 在一个实施方式中，离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。在另一个实施方式中，所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。在示例性实施方式中，所述中和试剂是硫酸精蛋白。在另一个示例性实施方式中，前述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。在一个实施方式中，修饰的SPI含有下列共有序列N-末端肽)-X1-H-X2- (G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO 771)。在另一个方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO :158-770任一项的序列的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在另一个方面，本发明提供了由选自SEQ ID NO :158-770 任一项的序列组成的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在另一个方面，本发明提供了编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子。在另一个方面，本发明提供了在高度严格杂交条件下与编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。在一个实施方式中，本发明包括载体，其包含编码本文描述的修饰的SPI的核酸序列，或在高度严格杂交条件下与编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。在另一个实施方式中，本发明提供了包含前述载体和/或前述核酸分子的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了抑制靶SP的方法，包括施用如本文描述的修饰的 SPL·在另一个方面，本发明提供了治疗患有凝血病的受试者或预防患者患上凝血病的方法，包括施用如本文描述的修饰的SPI，例如凝血酶抑制剂。在另一个实施方式中，本发明提供了在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括施用如本文描述的修饰的凝血酶抑制剂，然后向所述受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。本发明的其它特征和优点将通过如下的详细描述和权利要求变得明显。
具体实施例方式本发明提供了产生显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，包括修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。如上文所讨论，丝氨酸蛋白酶是切割肽的酶。本领域中接受这些酶通过催化三联体发挥作用，所述催化三联体存在于酶的活性位点中并且包括丝氨酸残基、组氨酸残基和天冬氨酸残基。组氨酸和天冬氨酸残基的功能是通过电荷中继系统激活丝氨酸残基，使其变为亲核性的并能够切割底物的裂解键(scissile bond)。典型的丝氨酸蛋白酶中的催化三联体的残基之间的相互作用显示于图1。本发明人已经令人惊奇地证明除了通过常规竞争性抑制剂的方式空间阻断活性位点之外，variegin，一种丝氨酸蛋白酶凝血酶的直接抑制剂，也通过打乱凝血酶的催化三联体的残基之间的相互作用而发挥作用，从而抑制其催化活性。Variegin是具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的蛋白质。其是源自蜱的蛋白，最早描述于W003/09U84。 在TO08/155658中描述了 variegin与凝血酶结合的能力。然而，这两篇文献都没有暗示variegin打乱凝血酶的催化三联体中的氨基酸之间的相互作用。W003/091284和 W008/155658的内容通过引用方式全文并入本文。图9A显示了凝血酶的催化三联体的残基的位置和这些残基之间的相互作用，它们发挥激活催化性丝氨酸残基的功能。图9B显示了 variegin的与催化三联体相互作用的残基，以及该相互作用对于催化三联体的残基的定位的影响。该示性地显示了预料不到的发现^ariegin的组氨酸残基发挥使丝氨酸的Y 0移位l.lA的功能，打乱催化三联体的丝氨酸与组氨酸残基之间的相互作用，并显著降低凝血酶的活性。据本发明人所知， variegin是已发现的通过移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子而发挥作用的第一个SPI。本发明人意识到，variegin的有力的抗凝血酶活性至少部分是由于凝血酶的活性位点中的催化三联体的打乱，并且，实现这一点的机理可以适用于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括凝血酶抑制剂。特别地，可以通过修饰来改善已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂的性质， 从而它们打乱靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体的残基之间的相互作用。此类修饰发挥了改善丝氨酸蛋白酶抑制剂性质的功能，并且克服了现有的丝氨酸蛋白酶抑制剂、尤其是已知的凝血酶直接抑制剂的很多缺点。术语“靶丝氨酸蛋白酶”或“靶SP，，涉及通常被给定的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制的丝氨酸蛋白酶。靶SP的一个实例是凝血酶。根据本发明的靶SP的其它实例包括凝固因子 FXa、FVIIa、FXIIa、FXIa 和 FIXa。通过本发明的方法修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂或SPI可以是直接SPI或间接SPI。 术语“直接SPI ”意思是SPI在SP的活性位点与其靶SP相互作用，不以抗-SP复合物的一部分存在或通过中间体发挥作用。术语“间接SPI，，意思是SPI不与靶SP的活性位点直接相互作用。间接SPI可以与靶SP上的不同于活性位点的位点相互作用，或者间接SPI可以通过包含间接SPI的抗-SP复合物而与靶SP上的活性位点或另一个位点相互作用。可以通过本发明的方法修饰的SPI的实例包括蛭素类似物(hirulog) (SEQ ID NO 14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO :776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α 1-抗胰蛋白酶样serpins、kazal型直接抑制剂和kimitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂。可以通过本发明的方法修饰的 SPI的另外的实例显示于SEQ ID N0:17-153。“移位的”意思是，靶SP中的氨基酸残基或所述氨基酸残基内的一个或多个原子占据的空间构象不同于在不存在任何外部影响的情况下其通常采纳的空间构象。应该认识到，此类移位可以是任何方向的。
在一个方面，移位可以使靶SP的催化三联体的氨基酸残基之间的相互作用被打乱。此类打乱可以是完全的，即，催化三联体的残基不再相互作用；或者其可以是部分的， 即，残基之间的相互作用仅为催化三联体的一个或多个残基不被移位时的相互作用强度的 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %或更低。催化三联体的氨基酸残基之间的相互作用的存在可以通过本领域已知的任何方法来测定，例如结晶学或NMR，计算性方法，包括但不限于分子力学、分子动力学和对接、氢/氘交换和质谱法。靶SP的催化三联体的一个或多个残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的移位可以打乱靶SP的催化三联体的电荷中继系统。在本发明的一个方面，靶SP的催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的丝氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的YO原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的β C可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的αC可以被移位。在一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三联体的丝氨酸残基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。在本发明的一个方面，催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的组氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的组氨酸残基的YC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的S C原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的ε N2原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的ζ C原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的S N1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的S N1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的β C可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的α C可以被移位。在一个方面，催化三联体的组氨酸残基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三联体的组氨酸残基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。在本发明的一个方面，催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的天冬氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的YO原子可以被移位。 在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的β C原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的α C原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的YC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的SO1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的S O2原子可以被移位。在一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三联体的天冬氨酸残基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。靶SP的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的移位可以通过本领域已知的任何方法来测定，例如结晶学或NMR，计算性方法，包括但不限于分子力学、分子动力学和对接、氢/氘交换和质谱法。在本发明的一个方面，SPI是蛋白质并且修饰包括将能够移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基导入SPI。这些氨基酸残基可以通过与催化三联体中的氨基酸残基相互作用而使它们移位。导入的氨基酸残基可以包括组氨酸残基。此组氨酸残基可以作为除了该组氨酸残基之外的可导入SPI中的任何其它序列的一部分而存在。在一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸(MH)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸(MHK)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸(MHR)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸(MHKT)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸-苏氨酸(MHRT)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸(MHKTA)序列。在另一个实施方式中， 导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸(MHRTA)序列。也可以导入备选的氨基酸残基，只要它们能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子。当考虑MHKT序列时，可以使用例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸替代甲硫氨酸和/或赖氨酸，可以使用精氨酸或酪氨酸替代组氨酸，和/或，可以使用丝氨酸或丙氨酸替代苏氨酸。在另一个方面，导入的一个或多个氨基酸残基可以包括连接区域。在另一个方面， 连接区域可以包括一个或多个氨基酸，例如甘氨酸或丙氨酸。在另一个方面，接头区域可以包括1、2、3、4、或5个甘氨酸残基。在另一个方面，接头区域可以由1、2、3、4或5个甘氨酸残基组成。在本发明的涉及靶SP是凝血酶的方面，产生修饰的SPI的方法可以包括导入或维持能够与凝血酶的外部位点I相互作用的肽序列。“维持此类肽序列”意指所述肽序列在修饰之前已经存在于SPI序列中，并且该序列不通过修饰被打乱或除掉。在一个方面，能够与凝血酶的外部位点I相互作用的肽序列可以包括下列序列FEEIPEEYL ；YEPIPEEA ；NGDFEEIPEEYL ；或APPFDFEAIPEEYL。相对于未修饰的SPI，通过本发明的任何方法产生的修饰的SPI显示出其靶SP的增强的抑制。对于本领域技术人员明显的是，可以使用多种测定法中的任一个来测定SP的抑制程度，并确认该修饰增强靶SP的抑制。举例而言，当SP是凝血酶时，此类测定法可以是胺裂解测定，其中检测在存在S2238的情况下，将凝血酶与修饰的凝血酶抑制剂一起温育之后，对硝基苯胺的形成。本发明的修饰的SPI可以具有下列IC50 小于30nM,小于25nM，小于20nM,小于 15nM,小于14nM，小于13nM，小于12nM，小于llnM，小于ΙΟηΜ，小于9nM，小于8nM，小于7nM， 小于6nM，小于5nM，小于^M，小于3nM，小于2nM或小于InM。通过本发明的方法产生的SPI可以具有下歹Ij Ki小于15nM,小于IOnM,小于5nM,小于InM,小于750pM,小于500pM,小于 400pM,小于 300pM,小于 250pM,小于 200pM,小于 150pM,小于 IOOpM,小于 50pM,小于 30pM, 小于25pM,小于20pM,小于15pM,小于IOpM,小于5pM,小于IpM,或小于IOOpMo已经证明常规的直接SPI通过与靶SP的至少活性位点结合而发挥作用，其中它们可能被靶SP切割，从而与靶SP的底物竞争结合，并竞争性抑制靶SP。通过这种方式作用的SPI的实例是蛭素类似物-1。虽然此类竞争性抑制可以是有效的抑制性机制，但其具有某些缺点，尤其是就抑制的短暂性和SPI的迅速消除而言。如在生物化学杂志，2007，沘2(40) 29101-29113 (Cho Yeow Koh, Maria Kazimirova, Adama Trimnell, Peter Takac, Milan Labuda, Patricia A. Nuttal1, 禾口 R. Manjunatha Kini)中所描述，variegin通过与其它直接SPI相同的方式以竞争性抑制剂发挥作用。然而，在variegin被凝血酶切割之后，variegin的片段被称作MH22的片段(显示为SEQ ID NO :3)仍然保持与凝血酶结合，并作为凝血酶的非竞争性抑制剂发挥功能。这增加了 variegin的抑制潜力，并克服了其它直接SPI的一些缺点。在分析了与凝血酶结合的variegin的晶体结构之后，本发明人惊奇地发现:MH22与凝血酶的活性位点结合。这是不寻常的，因为非竞争性抑制剂一般结合于与酶活性位点不同的位点。此外，晶体结构揭示负责移位凝血酶的催化三联体的一个或多个残基的variegin的组氨酸残基是MH22序列的一部分，因此，在variegin被切割之后，该variegin片段打乱凝血酶的催化三联体，导致增加的抑制持续时间。因此，本发明的方法可以产生修饰的SPI，在修饰的SPI被靶SP切割之后，所述修饰的SPI保持与靶SP结合。此类修饰的SPI显示出增加的抑制持续时间。术语“延长的作用持续时间”意指靶SP的抑制持续时间相对于使用非修饰的SPI 时的抑制持续时间增加。在一个方面，作用持续时间可以增加至少2倍。在另一方面，相对于使用非修饰的SPI时的抑制持续时间，作用持续时间可以增加至少3倍，至少4倍，至少5 倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或更多。修饰的SPI的抑制持续时间可以大于 5分钟，大于10分钟，大于15分钟，大于20分钟，大于25分钟，大于30分钟，大于1小时， 大于2小时，大于3小时，大于4小时，大于5小时，大于6小时，大于12小时，大于1天，大于2天，大于3天或更多。上文已经描述了用于测定靶SP的抑制程度的方法。在本发明的一些方面，上文描述的一个或多个导入的氨基酸残基可以向被靶SP切割之后保留在活性位点中的修饰的SPI的部分的氨基末端放置。“向氨基酸末端”意指一个或多个导入的残基在被靶SP切割之后的SPI的保留部分的氨基末端的5个氨基酸之内。在一些方面，一个或多个导入的残基可以在被靶SP切割之后保留在活性位点中的修饰的直接SPI的部分的氨基末端的1个残基之内、2个残基之内、3个残基之内、4个残基之内或5个残基之内。对本领域技术人员明显的是，为了使一个或多个导入的残基“向被靶SP切割之后保留在活性位点中修饰的直接SPI的部分的氨基末端”，一个或多个导入的残基必须在修饰的直接SPI的切割位点的5个残基之内。在一个方面，本发明的方法可以包括修饰SPI以使其能够被中和的另外的或备选的步骤，包括将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用，从而修饰的SPI与中和试剂之间的所产生的离子相互作用中和修饰的SPI抑制活性，从而，修饰的SPI不再使靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。基于variegin的序列和从结合于凝血酶的variegin的晶体结构获得的数据，本发明人惊奇地发现variegin的抑制活性可以被中和。该中和机理是基于发现了 variegin 的羧基末端上的离子电荷区域与中和试剂上的相反离子电荷区域之间的离子相互作用。 variegin与中和试剂之间的离子相互作用似乎通过打乱variegin上的离子电荷区域与凝血酶上的相反离子电荷区域之间的离子相互作用而中和variegin的抑制活性。从结合于凝血酶的variegin的结构的分析认为凝血酶上的离子电荷区域在外部位点_1内。该信息允许对其它SPI进行修饰，从而使它们能够被中和。鉴于SPI的治疗用途 (上文已讨论)，能够被中和的修饰的SPI将具有重要的治疗益处。“能够被中和”意思是 能够通过加入中和试剂全部或部分解除SPI的活性，即，在加入中和试剂之后能够恢复SP 的活性。在该定义下，可以恢复 10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,95%, 99%或100%的SP活性。换言之，在打乱了修饰的SPI与靶SP之间的离子相互作用之后， 可以保留 90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,5%,1%W SPI 抑制活性。对本领域技术人员明显的是由于在结合的与未结合的抑制剂之间建立的内在平衡，多数通过与其靶标结合而发挥作用的抑制剂(包括但不限于竞争性抑制剂)的作用可以在一定程度上被中和。在加入某些物质之后，该平衡位置被改变；所述物质在本文中被称作“中和试剂”，其使所述平衡偏向有利于未结合的抑制剂；因此，解除抑制剂的抑制效应。 然而，在“非可中和”抑制剂的情况下，该平衡严重偏向结合的抑制剂，中和试剂的加入不扰乱平衡。图8显示了 variegin与凝血酶结合的平衡示意图。该示意图仅以举例方式提供。在本发明的上下文中，术语“中和”意指仅涉及通过加入中和试剂而引起的中和， 其打乱平衡；不指作为内在平衡的副产物的内在中和。中和试剂可以通过拥有与导入到修饰的SPI上的离子电和区域相反的离子电荷区域而发挥中和修饰的SPI的抑制活性的功能。修饰的SPI与中和试剂之间的离子相互作用的形成可能导致修饰的SPI上的离子电荷区域与靶SP上的相反离子电荷区域之间的相互作用被打乱。靶SP上的离子电荷区域可以在外部位点之一以内。在另一个方面，离子电荷区域可以在外部位点-I以内。在本发明的一个方面，中和试剂上的离子电荷区域可以是阳离子电荷区域。因此，在本发明的该方面，通过本发明的方法导入到SPI中的离子电荷区域可以是阴离子电荷区域。在本发明的另一方面，靶SP上的离子电荷区域可以是阳离子电荷区域。导入到SPI中的离子电荷区域可以导向SPI的羧基末端。“向羧基末端”意指导入的离子电荷区域位于修饰的SPI的羧基末端的10个氨基酸之内。导入的离子电荷区域可以在修饰的SPI的羧基末端的1个残基之内、2个残基之内、3个残基之内、4个残基之内、5 个残基之内、6个残基之内、7个残基之内、8个残基之内、9个残基之内或10个残基之内。中和试剂可以是阳离子物质。此类阳离子物质可以与SP竞争与靶SPI上的阴离子电荷区域的结合，引起修饰的SPI的移位，和靶SP的抑制的丧失。中和试剂可以是阳离子肽，例如硫酸精蛋白。导入到SPI中的离子电荷区域可以包括一个或多个酸性残基。一个或多个酸性残基可以包括1、2、3、4、5或更多个酸性残基。术语“酸性残基”可以包括天冬氨酸和谷氨酸。一个或多个酸性残基可以包括谷氨酸残基和/或天冬氨酸残基。可以导入的离子电荷区域的具体实例包括两个谷氨酸氨基酸残基和两个天冬氨酸氨基酸残基。在另一个具体实例中，可以导入的离子电荷区域包括序列 glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意氨基酸残基。在另一个实例中，可以导入的离子电荷区域包括·歹ll glu-glu-tyr-lys-asp-asp。一般内容现在将描述本发明的一些一般性方面。该部分中包括的特征和方法适用于上文描述的本发明的任何方法。 如在前面的部分中所描述，本发明的方法可以包括将一个或多个残基导入SPI。在一个方面，此类导入的残基可以通过插入导入。在另一个方面，可以通过置换导入残基。置换或插入的方法对于本领域技术人员将是明显的。举例而言，但不限于此这些可以包括定点诱变、PCR诱变、转位子诱变、定向诱变、插入诱变、靶向诱变和化学蛋白合成 (Sambrook 等人(2000))。在本发明的一些方面，修饰SPI的方法可以包括一个或多个另外的步骤。在一些实施方式中，一个或多个另外的步骤可以是最初的另外步骤，意思是这些步骤发生在修饰方法的其它步骤之前。在一个方面，本发明的方法可以包括下列的另外步骤分析SPI的结构以确定要对SPI进行的修饰。分析可以包括分析SPI的氨基酸序列和/或SPI的结构的计算机模拟。另外或备选地，方法可以包括分析SP的结构或与SP结合的SPI的结构。此类结构可以是晶体结构、红外谱、圆形二色性数据、紫外谱、NMR光谱的形式，计算性方法包括但不限于分子力学、分子动力学和对接、或氢/氘交换和质谱法。分析可以包括确定负责SP与SPI之间的相互作用(该相互作用将通过修饰SPI 的方法被改变)的SPI的区域。例如，修饰SPI以增强如上文描述的靶SP的抑制的方法可以包括鉴定SPI中的与靶SP的催化三联体相互作用的残基的最初步骤。然后，可以修饰与催化三联体相互作用的氨基酸残基以移位催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子，例如，通过在该位置导入MHKT序列。本发明可以包括下列的另外步骤分析靶SP的结构以确定要对SPI进行的修饰。 分析可以包括确定负责靶SP与SPI之间的相互作用(该相互作用将通过修饰SPI的方法被改变)的靶SP的区域和/或残基。分析可以包括SP的结构分析，其可以是晶体结构、红外谱、圆形二色性数据、紫外谱、NMR光谱的形式，或来自计算性方法的数据。上述分析可以包括将SPI的结构与另一个结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI的结构进行比较。此类分析可以在关于待修饰的SPI与另一 SP所产生的任何数据上进行。特别地，此类数据可以源自晶体结构、红外谱、圆形二色性数据或紫外谱和NMR光谱或来自计算性方法的数据。在本发明的另一个方面，结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI可以是凝血酶抑制剂。在本发明的另一个方面，结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI可以是 Variegin0在本发明的一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以是凝血酶抑制剂。根据本发明的另一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以选自蛭素类似物(SEQ ID NO 14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO :776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α 1-抗胰蛋白酶样serpins、kazal型直接抑制剂和kimitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂。在另一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以是SEQ ID NO :17-153的任一项。修饰的SPI本发明还包括通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI。在另一个方面，本发明涉及通过任何方法获得的修饰的SPI。例如，通过本发明的方法可获得的修饰的SPI也可以通过本领域已知的任何方法来产生。用于产生本文描述的修饰的SPI的示例性技术包括化学肽合成、固相或溶液相肽合成、从编码修饰的SPI的核酸分子进行体外翻译，或基于细胞的生产方法，其利用原核或真核重组表达系统。在示例性实施方式中，修饰的SPI是包含如SEQ ID NO :158-770所示的任意序列的多肽。此类修饰的 SPI成分可用于本发明的方法，包括抑制SP的方法，如下文所描述。在本发明的一个方面， 通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI可以是修饰的凝血酶抑制剂。在本发明的一个方面，通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI可以是蛭素类似物(SEQ ID NO :14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO :776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α -抗胰蛋白酶样 serpins, kazal型直接抑制剂和kunitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂的修饰的形式。在另一个方面，通过本发明的方法修饰的SPI可以是SEQ ID NO :17-153的任一项。通过本发明的方法可获得或获得的修饰的蛭素类似物的修饰的形式可以具有下列共有序列(N-末端肽)-X1-H-X2- (G)n_ (外部位点 I 结合肽)(SEQ ID NO :771)。在一个方面，N-末端肽可以包括序列苯丙氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸，或苯丙氨酸-脯氨酸，赖氨酸。在另一个方面，氨基末端苯丙氨酸残基可以是修饰的苯丙氨酸残基。在一个实例中，该修饰的残基可以是D-苯丙氨酸残基。在一个方面，X1可以是任意氨基酸。在另一个方面，X1可以是甲硫氨酸残基。在一个方面，X2可以是任意氨基酸。在另一个方面，&可以是赖氨酸或精氨酸残基。在一个方面，η可以是一个或多个甘氨酸氨基酸残基。在另一个方面，η可以是2、 3、4、5或更多个甘氨酸氨基酸残基。在一个方面，修饰的SPI可以包括一个或多个硫酸化氨基酸残基。在另一个方面， SPI可以包括一个或多个硫酸化酪氨酸残基。在一个方面，外部位点I结合肽可以包括下列序列之一FEEIPEEYL(SEQ ID NO :772)；YEPIPEEA(SEQ ID NO :773)；NGDFEEIPEEYL(SEQ ID NO :774)；或APPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO :775)。外部位点I结合肽还可以包括含有一个或多个酸性残基的离子电荷区域。所述一个或多个酸性残基可以包括1、2、3、4、5或更多个酸性残基。术语“酸性残基”可以包括天冬氨酸和谷氨酸。一个或多个酸性残基可以包括谷氨酰胺残基和/或天冬氨酸残基。离子电荷区域可以包括两个谷氨酸氨基酸残基和两个天冬氨酸氨基酸残基。离子电荷区域可以包括序列glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意氨基酸残基。在另一个实例中，离子电荷区域可以包括·歹ll glu-glu-tyr-lys-asp-asp。在一个方面，修饰的SPI可以包括选自SEQ ID NO :158-770的序列。在另一个方面，修饰的SPI由SEQ ID NO :158-770的一个或多个序列组成。本发明的修饰的SPI可以通过化学肽合成、通过重组肽合成或使用宿主细胞细胞
来产生。本发明还包括根据本发明的修饰的SPI的功能等同物，其保留抑制SP的增强的能力，如上文所述。在一个方面，术语“功能等同物”意在包括与根据本发明的方法产生的修饰的SPI具有至少50%序列同一性的肽分子。在另一个方面，功能等同物可以与根据本发明的方法产生的修饰的SPI具有60 %，70 %，85 %，90 %，95 %，98 %，99 %或更高的序列同一性。此类功能等同物保留抑制靶SP的增强的能力，如上文所述。术语“功能等同物”还包括与本发明的修饰的SPI相比，包含一个或多个保守性置换的任意多肽。在一个方面，多肽包含一个或多个保守性置换。在另一个方面，与本发明的修饰的SPI相比，多肽包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，或五个或更多个保守性置换。保守性置换是这样的氨基酸置换其中被置换的氨基酸的性质相对于在该位置通常存在的氨基酸而言不发生实质上的变化。保守性置换包括酸性氨基酸置换为另一酸性氨基酸，碱性氨基酸置换为另一碱性氨基酸，不带电荷的氨基酸置换为另一不带电荷的氨基酸，非极性氨基酸置换为另一非极性氨基酸，小氨基酸置换为另一小氨基酸，或大氨基酸置换为另一大氨基酸。酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸是精氨酸、组氨酸和赖氨酸。不带电荷的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。非极性侧链是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。在非极性氨基酸的类别内，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸被认为是小氨基酸，脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸被认为是大氨基酸。在另一个方面，本发明包括通过本发明的方法产生的SPI的片段。在另一个方面， 片段可以包括2个或更多个氨基酸。在另一个方面，片段可以包括3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45 或 50 个氨基酸。在另一个方面，片段可以由2个或更多个氨基酸组成。在另一个方面，片段可以由2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1， 14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45或50个氨基酸组成。此类片段保留抑制靶SP的增强的能力，如上文所述。在另一个方面，功能等同物可以是融合蛋白，其通过例如将编码本发明的修饰的 SPI或其变体或片段的多核苷酸在框内克隆于异源蛋白序列的编码序列而获得。如本文使用的术语“异源的”意指除了修饰的SPI或其功能等同物之外的任意多肽。构成融合蛋白的异源序列(在N-末端或在C-末端)的实例是下列与膜结合的蛋白的细胞外结构域、人免疫球蛋白恒定区(Fe区)、多聚体结构域、细胞外蛋白的结构域、信号序列、输出序列，或允许通过亲和色谱纯化的序列。很多这些异源序列可通过商业途径获得(在表达质粒中)， 因为这些序列通常包括在融合蛋白中以提供另外的性质而不显著破坏融合于它们的蛋白的特定生物活性(Terpe 000；3))。此类另外的性质的实例是体液中的持续较长的半衰期、 细胞外定位，或由于标签例如组氨酸或HA标签而允许更容易地纯化程序。
异源蛋白也可以是标记物结构域。在一个方面，标记物结构域可以是荧光标签、允许通过亲和结合纯化的表位标签、允许组织化学或荧光标记的酶标签，或放射性化学标签。 在另一实施方式中，标记物结构域可以是放射性化学标签。此类融合蛋白可用作诊断工具。用于产生融合蛋白的方法是本领域中的标准技术，是本领域技术人员已知的。例如，多数一般性的分子生物学、微生物、重组DNA技术和免疫技术可以见于Sambrook等人 (2000)。一般地，融合蛋白可以最方便地从核酸分子重组产生，在所述核酸分子中两个核酸序列在框内融合在一起。这些融合蛋白将由含有所讨论的融合蛋白的相关编码序列的核酸分子编码。在一个方面，根据本发明的修饰的SP的功能等同物可以包括包含适合移位靶SP 的催化三联体的残基的之一的部分的任意分子。在一个方面，该分子可以是蛋白分子，适合移位催化三联体的残基之一的部分可以是氨基酸残基。对本领域技术人员明显的是，该定义不包括单独的任何残基，因为残基将需要另外的残基的存在以使适合移位靶SP的催化三联体的残基之一的残基定位于适合于移位催化三联体的残基之一的方向和位置。在一个方面，功能等同物可以包括蛋白分子内的组氨酸残基，其以适合移位靶SP的催化三联体的残基之一的方式定位和定向。本发明还包括如上所述的修饰的SPI的合成类似物。通过本发明的方法产生的修饰的SPI的片段或功能等同物能够作为SPI发挥作用。“能够作为SPI发挥作用”意思是该片段或功能等同物能够抑制SP的SP活性。在另一个方面，片段或功能等同物能够抑制靶SP的SP活性。对本领域技术人员明显的是，可以使用多种测定法来测定片段或功能等同物是否能够作为SPI发挥作用。举例而言，但不限于此，此类测定法可以是SP胺裂解测定，如上文所述，其中检测在存在S2238的情况下，将靶SP与修饰的SPI —起温育之后，对硝基苯胺的形成。当在此类SP胺裂解测定法中测定时，本发明的修饰的SPI可以具有下列IC5tl 小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小于14nM，小于13nM，小于12nM，小于llnM，小于ΙΟηΜ，小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM或小于InM。当在此类SP胺裂解测定法中测定时，通过本发明的方法产生的SPI可以具有下列Ki 小于15nM,小于IOnM,小于5nM,小于InM,小于750pM,小于500pM,小于400pM,小于 300pM,小于250pM,小于200pM,小于150pM,小于IOOpM,小于50pM,小于30pM,小于25pM,小于20pM,小于15pM,小于IOpM,小于5pM,小于IpM或小于IOOpMo在一个方面，本发明包括编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子。 在另一个方面，本发明包括与编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子具有至少50%序列同一性的核酸分子。在另一个方面，本发明包括与编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%、至少99%或更高的序列同一性的核酸分子。本发明还包括编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子的片段。在一个方面，所述片段可以包括10个或更多个核苷酸。在另一个方面，所述片段可以包括12个或更多个、14个或更多个、16个或更多个、18个或更多个、10个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、90个或更多个，或100个或更多个核苷酸。根据本发明的核酸分子可以是任意形式，包括双链和单链RNA、DNA和cDNA。在另一个方面，本发明包括在高度严格杂交条件下与根据本发明的核酸分子杂交的反义核酸分子。高度严格杂交条件在本文中定义为在42°C在包含50%甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7. 6)、5X Denhardts 溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml变性的、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中过夜温育，然后在0. IX SSC中在大约65 °C洗涤滤液。本发明还包括含有本发明的核酸分子的克隆和表达载体。此类表达载体可以包含与本发明的核酸分子在框内连接的适当的转录和翻译控制序列，包括但不限于增强子元件、启动子-操纵子区域、终止序列、mRNA稳定性序列、起始和终止密码子或核糖体结合位点。另外，使本发明的修饰的SPI从某些宿主中分泌出来可能是方便的。因此，此类载体的另外的成分可以包括编码分泌、信号和处理序列的核酸序列。根据本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，以及其它的线性或环形DNA载体，例如利用可转位元件或同源重组技术的那些。很多此类载体和表达系统对于本领域技术人员将是明显的。特别适宜的病毒载体包括基于杆状病毒、腺病毒和牛痘病毒的载体。用于重组表达的适宜的宿主包括通常使用的原核物种，例如大肠杆菌，或者可以被操作以表达高水平的重组蛋白并且可以容易地大量生长的真核酵母。在体外生长的哺乳动物细胞系也是适宜的，尤其是当使用病毒驱动的表达系统时。另一个适宜的表达系统是杆状病毒表达系统，其包括使用昆虫细胞作为宿主。表达系统也可以包括在其基因组中导入了 DNA的宿主细胞。蛋白或蛋白片段也可以在体内表达，例如在昆虫幼虫或哺乳动物组织中。可以使用多种技术将载体导入原核或真核细胞中。适宜的转化或转染技术在文献中有完备的描述(Sambrook等人QOOO))。在真核细胞中，表达系统可以是短暂的(例如，游离体)或永久的(染色体整合)，视系统的需要而定。治疗方法本发明还包括根据本发明可获得的或获得的修饰的SPI在治疗中的用途。也可以使用通过任何方法获得的修饰的SPI来执行用途和方法。本发明包括抑制SP的方法，包括向受试者施用本发明的分子。“本发明的分子”意思是根据本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI分子，编码根据本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸，包含编码通过本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸的载体，和包含含有编码通过本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸的载体的宿主细胞。“本发明的分子”还包括通过本发明的方法可获得的、但通过任何方法产生的修饰的SPI。因此，本发明的修饰的SPI分子可以使用本领域已知的任何方法产生，例如，化学肽合成、固相或溶液相肽合成、从编码修饰的SPI的核酸分子进行体外翻译，或基于细胞的生产方法，其利用原核或真核重组表达系统。在示例性实施方式中，“本发明的分子”包括含有如SEQ ID NO :158-770所示的任意序列的多肽。此类修饰的SPI分子可用于本发明的方法，包括本文所述的任意治疗方法。受试者一般是动物。术语“动物”包括分类为动物界的成员的任意生物。一般地， 动物是哺乳动物，例如人、母牛、绵羊、猪、骆驼、马、狗、猫、猴子、小鼠、大鼠、仓鼠和兔子。方法可以包括施用治疗有效量的本发明的分子。术语“治疗有效量”是指治疗或缓解靶疾病或病况所需的化合物的量。如本文使用的术语“预防有效量”是指预防靶疾病或病况所需的化合物的量。精确剂量一般将取决于给药时受试者的状态。当确定剂量时可以考虑的因素包括受试者中的疾病状态的严重性、受试者的一般健康、年龄、体重、性别、膳食、 给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和受试者对于治疗的耐受或应答。精确的量可以通过常规实验确定，但最终可以根据临床医生或兽医的判断。一般地，有效剂量将是0. Olmg/ kg(药物质量比受试者的质量)至50mg/kg，优选0. 05mg/kg至10mg/kg。本发明的分子可以联合药学上可接受的载体以药物组合物的形式提供。如本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、 聚乳酸、聚乙醇酸和无活性的病毒颗粒或事实上任何其它试剂，只要赋形剂本身不诱导毒性效应或引起对接受药物组合物的个体有害的抗体的产生。药学上可接受的载体可以另外包括液体，例如水、盐水、甘油、乙醇，或辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂，PH缓冲物质等。赋形剂能够使药物组合物配制为片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液以辅助受试者摄取之。关于药学上可接受的载体的详细讨论可以见Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)。在一个方面，本发明提供了涉及通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂的治疗方法。本发明包括治疗患有凝血病的受试者或预防患者患上凝血病的方法，包括施用通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂。本发明还包括用于治疗患有凝血病的受试者或预防患者产生凝血病的通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂。“凝血病”意指血液凝固的任意病症。当需要抗凝时的处理包括，为了诊断或治疗原因的涉及经皮、透过血管或透过器官的导管插入的程序。此类程序可以包括但不限于冠状动脉血管成形术；血管内支架程序；通过动脉或静脉导管直接施用血栓溶解剂，例如在中风或冠状动脉血栓症之后；电心律转变法；心脏起搏器导线的放置；血管内和心脏内监控压力、气体饱和或其它诊断参数； 涉及经皮或透过器官的导管插入的放射学和其它程序；以确保长期、留置的、血管内胃肠外营养导管的效能；以确保长期或短期血管接入端口的效能。本发明的方法的另外的体内应用包括血栓栓塞事件之后的紧急抗凝，所述血栓栓塞事件包括但不限于急性心肌梗塞；血栓形成性中风；深度静脉血栓；血栓性静脉炎；肺栓塞；栓和微栓发作，其来源可以是心脏、动脉粥样硬化斑、瓣膜或人造血管或未知的来源； 弥散性血管内凝血(DIC)。本发明的方法也可用于预防在器官灌注程序例如心肺分流术(cardiopulmonary bypass)、肝脏分流术(h印atic bypass)中以及作为器官移植的附属来预防凝固。由于心肺分流术而促成的大量血栓形成反应不能通过间接凝血酶抑制剂例如肝素及其类似物完全拮抗(Edmunds & Colman (2006))。另外的需要抗凝的情况包括血液透析、血液过滤或血浆交换程序。在涉及血管的交叉夹紧的手术程序时也可能需要抗凝，以使末梢循环中的凝固风险最小化。此类程序可以包括但不限于动脉内膜切除术、人造血管的插入、主动脉和其它动脉瘤的修复。另外，方法和根据本发明可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂可用于在肝素抗性受试者中诱导抗凝。方法和根据本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂也可用于治疗或预防肝素诱导的血小板减少症。可以向患有或具有换HIT以及具有或不具有活性血栓的受试者施以此类治疗，并且可以施用直至血小板计数恢复至正常范围内或直至不再有血栓风险(Girolami & Girolami(2006), Lewis & Hursting(2007))。本发明的分子可以通过任意合适途径施用。优选的施用途径包括静脉内、肌肉内或皮下注射，口服施用，舌下施用和经皮施用。可以通过静脉内输注持续给予治疗或作为单一或重复的推注注射进行。本发明的分子可以单独向受试者施用，或者可以与其它试剂、药物或激素组合施用。例如，本发明的分子可以与口服抗凝剂例如香豆素(coumarin)衍生物一起施用，直至受试者变得稳定，然后可以单独以香豆素衍生物治疗该受试者。本发明还提供了 通过本发明的方法产生的修饰的SPI可用于诊断。由于这些方法涉及通过与靶SP的相互作用特异性抑制SP活性，所以它们可用于检测靶SP的存在， 从而诊断由SP的累积而引起的病况，例如纤维蛋白或血小板血栓，其由凝血酶的累积而引起。因此，本发明提供了诊断由SP累积引起的病况的方法，该方法是通过向受试者或分离自受试者的组织施用如上文描述的本发明的修饰的SPI，并检测所述SPI或其片段或功能等同物的存在，其中所述修饰的SPI或其片段或功能等同物与靶SP的结合的检测指示所述疾病或病况。修饰的SPI或功能等同物可以是包含标记物结构域的融合蛋白的形式，如上文更详细地所描述，以促进检测。在一个方面，标记物结构域可以是放射化学标签，从而可以使用已知的成像方法进行检测。根据本发明的另一个方面，本发明的体内方法可用于治疗恶性疾病或与恶性疾病相关的病况。数十年以来已经认识到，恶性疾病经常与血栓栓塞发作的增加的倾向相关，其是由SP凝血酶的增加的水平引起的。例如，Trousseau综合征的特征在于短暂的血栓性静脉炎和潜在的恶性质，凝血酶抑制剂例如肝素已经用于其管理(VarkU2007))。更近期以来， 已经显而易见的是，促凝血因子包括凝血酶的产生可能是恶性疾病的某些方面的诱因而非结果(Nierodzik & Karpatkin Q006))。有很多这样的情况其中需要抑制SP，然后中和此类抑制。举例而言，但不限于此，此类抑制和中和在手术中可能是有利的，其中，当手术正在进行时，需要靶SP抑制以防止凝血酶诱导的凝固；在完成手术之后，撤销抑制是有利的，以允许伤口愈合。当SPI是凝血酶抑制剂时，可以通过施用阳离子肽例如硫酸精蛋白来中和凝血酶活性。因此，涉及如本文描述凝血酶抑制的任何治疗方法可以描述向受试者施用一定量的阳离子肽以引起凝血酶抑制的中和的另外的步骤。在一个方面，所施用的阳离子肽的量可以是0. 01mg/ml至lmg/ml。在另一个方面，所施用的阳离子肽的量可以是0. 01mg/ml或更多，0. 02mg/ml 或更多，0. 03mg. ml 或更多，0. 04mg/ml 或更多，0. 05mg/ml 或更多，0. 06mg/ ml或更多，0. 07mg/ml或更多，0/08mg/ml或更多，0. 09mg/ml或更多，0. lmg/ml或更多， 0. 1 lmg/ml 或更多，0. 12mg/ml 或更多，0. 13mg. ml 或更多，0. 14mg/ml 或更多，0. 15mg. ml 或更多，0. 16mg/ml 或更多，0. 18mg/ml 或更多，0. 19mg/ml 或更多，0. 2mg/ml 或更多，0. 3mg. ml 或更多，0. 4mg. ml或更多,0. 5mg. ml或更多,或lmg/ml。现在将通过举例方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方式。将认识到，可以不脱离本发明的范围进行细节的修饰。


图1显示了典型的SP的催化反应图解。多肽底物与SP结合，从而裂解键被插入到酶的活性位点，并且其羰基碳位于SP的亲核丝氨酸附近。丝氨酸-OH攻击羰基碳，并且 SP的组氨酸的氮接受来自丝氨酸的-OH的氢，从而产生四面体中间体。接下来，肽键中的氮-碳断裂，产生酰基酶中间体，水加入其中，产生另一种四面体中间体。在最后的反应中， 肽的C-末端被射出，SP恢复至其原始状态。图2显示了凝血酶-variegin复合物的结构，与其它凝血酶抑制剂结构相对比。(A)凝血酶-variegin复合物的结构。凝血酶A链骨架显示为浅蓝色带状物，B链显示为白色带状物，s-variegin骨架和侧链原子显示为粉色的棍。(B)凝血酶-蛭素类似物-1复合物的结构(PDB :2HGT)。蛭素类似物_1显示为红色的棍。(C)凝血酶-蛭素类似物-3复合物的结构(PDB :1ABI)。蛭素类似物_3显示为黄色的棍。(D)凝血酶-蛭素原(hirugen)复合物的结构(PDB =IHGT)。蛭素原显示为绿色的棍。(E)凝血酶-PPACK复合物的结构(PDB =IPPB)。PPACK显示为橙色的棍。(F)野生型、不含抑制剂、不含Na+的凝血酶(PDB :2AFQ)。结构代表“慢”形式的凝血酶，并且无抑制剂。图3显示了在37°C和凝血酶对s-variegin的切割的分析。通过积分RP-HPLC 分析中的峰下面积而计算未切割的s-variegin的相对百分比(■)、质量为1045的切割产物的相对百分比(代表N-末端片段SDQGDVAEH( ；SEQ ID NO :2) (□)和质量为2582的切割产物的相对百分比(代表C-末端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES ；MH22 ；SEQ ID NO 3) (■)。切割在37°C比在室温进行得快(η = 2，误差条代表S. D.)。(A)通过在37°C温育s-variegin与凝血酶而获得的结果。完成切割仅需要180 分钟。(B)通过在温育s-variegin与凝血酶而获得的结果。完成 90%的切割需要360分钟。图4显示被凝血酶切割后s-variegin和EP25保留了它们的活性。(A) S-variegin与凝血酶(3. 33nM)在室温温育M小时，在多个时间点测定抑制凝血酶在100 μ M S2238上的胺裂解活性的能力(n = 3，误差条代表S. D.)。(B)以ΕΡ25代替s-variegin进行类型的实验(n = 3，误差条代表S. D.)。图5显示MH22、s-variegin和蛭素类似物_1抑制人血浆凝血酶。使用活性位点定向底物S2238 (100 μ Μ)测定ΜΗ22、s-variegin和蛭素类似物_1抑制源自人血浆的凝血酶的胺裂解活性的能力。当它们以相似的摩尔浓度与凝血酶一起存在时，MH22(〇)、 s-variegin (A )和蛭素类似物_1 ( ■)抑制凝血酶(1. 65nM)的剂量应答曲线均显示出抑制。用于MH22 ( ■)和 s-variegin 的浓度分别是 0. 03nM, 0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, 100nM，300nM 和 ΙΟΟΟηΜ。抑制的 IC5。分别是 11. 46士0. 71nM禾Π 8. 25士0. 45ηΜ(η =3，误差条代表S.D.)。
用于蛭素类似物-1(▲)的浓度是 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM, ΙΟΟΟηΜ，3000nM 和 ΙΟΟΟΟηΜ。抑制的 IC5tl 是 72. 6 士 3. 9nM(n = 3 误差条代表 S. D)。图6显示了 MH22的表观抑制常数(Ki，)。由于MH22作为紧密结合抑制剂发挥其作用，所以使用不同浓度的S2238作为底物，检测了不同浓度(0. 195nM,0. 391nM,0. 781nM, 1. 56nM, 3. 12nM, 6. 25nM, 12. 5nM, 25nM, 50nM, IOOnM)的 MH22 对于凝血酶(1. 65nM)的抑制。 加入凝血酶时反应起始。图中显示了以ΙΟΟμΜ S2238进行的实验。将获得的数据拟合入等式以得出表观抑制常数(Ki’)(平均值士 S.D.)是14.31 士 0. 26nM(n = 3，误差条代表 S. D.)。图7显示了 MH22的抑制常数Ki。使用6种不同浓度的底物S2238 (12. 5 μ M，25 μ M， 50 μ Μ，75 μ Μ，100 μ M禾口 150 μ Μ)测定ΜΗ22的表观抑制常数(Ki，)。Ki针对底物浓度的曲线一直保持恒定，这表明MH22非竞争性地(K/ =盼Km)/[(KnAi)+ (S/α Ki)]并且K/ = Ki)抑制凝血酶在S2238上的胺裂解活性。通过线性回归拟合Ki’值，得出抑制常数Ki是 14. 11 士0. 29nM (对于每个S2238浓度，η = 3，误差条代表S. D.)。图8显示了 variegin抑制凝血酶的平衡方案。在不存在variegin的情况下， S2238结合凝血酶(Ks是凝血酶-S2238解离的平衡常数，显示为蓝色箭头)，并且被凝血酶水解以释放有色产物pNA(Kp是形成pNA的正向速率常数，绿色箭头)。在存在variegin的情况下，凝血酶结合variegin (Ki_v是variegin的抑制常数， 显示为棕色箭头)，因此，S2238的水解被完全抑制。结合之后，凝血酶将variegin切割为 MH22(kc是切割的正向速率常数，显示为紫色箭头)。MH22保持与凝血酶结合，作为凝血酶的经典的非竞争性抑制剂(Ki_m是MH22的抑制常数)。MH22以相同的亲和性与游离的凝血酶或结合于S2238的凝血酶结合，α = 1, 因此Ki-m= aKi-m(显示为红色箭头)。类似地，Ks = a Ks，S2238与凝血酶的结合不受 MH22的影响。图9显示了结合于s-variegin和结合于蛭素原的凝血酶的结构中的催化三联体。(A)当在凝血酶-蛭素原结构中未被占据时(绿色)，凝血酶的催化三联体Mis57、 TAspl02*Serl95具有完整的电荷中继氢结合系统。在凝血酶-s-variegin结构中(粉色)，TSerl95 Oy被移位1.10 A (青色箭头)。THis57 N ε与Serl95 Oy之间的距离是 3.77 A，因此不形成氢键，电荷中继系统被破坏。(B)TSerl95 Oy的移位是由于s-variegin (显示为灰色)与凝血酶的催化三联体之间的相互作用。vHisl2骨架N (供体)通过氢键(2.77 Λ)啮合TSerl95的Oy (受体)，而 vHisl2侧链Νδ (受体)仅能与Serl95 0 γ (供体)形成弱的氢键(3.68 A)。vHisl2骨架 N也与％lyl93骨架N*TCys42 Sy通过水分子(浅蓝色)形成氢键。因此，Serl95 Oy 被赋予弱亲核性，并且不能攻击底物的骨架碳。由于TGlyl93骨架N参与该氢键网络，氧负离子孔的形成也被破坏。图10显示了凝血酶与s-variegin之间的首要次位点相互作用。对于s-variegin， 仅显示了残基P2，至P5，(vHisl2至vAlal5)。在结构中不能描绘s-variegin Pl，vMetll的密度。凝血酶 S2’次位点(红色)(由 TCys42,THis57,TTrp60D,TLys60F,TGlul92 和 TSerl95 形成)与蛭素类似物-3中保守的Si’次位点部分重叠。s-variegin P3’ vLysl3侧链与 %lul92侧链靠近且平行，并且其骨架与TLeu41接触，形成S3’次位点(青色)。S-varieginP4’ vThrl4侧链朝向自我裂解环的底部，占据由Mlyl42，TAsnl43, TGlul92, TGlyl93和形成的小袋，形成了 S4’次位点(粉色)。底部的TLeu40沿着凝血酶S5’次位点 (绿色)，这允许s-variegin P5’ vAlal5将其侧链埋于界面处。图11显示=S-Variegin紧密适合凝血酶的峡谷样裂口。(A)凝血酶具有深谷样裂口(加框)，起始于活性位点，延伸至外部位点-I。(B)整个s-variegin(粉色的CPK模型)紧密适合于延伸的构象中峡谷样裂口的底部，覆盖催化袋、首要次位点和外部位点-I。裂口的底部主要由非极性残基组成。裂口的壁由凝血酶活性位点附近的60-环和自我裂解环以及外部位点-I处的34-和70-环形成。(C)根据位置以颜色显示了与s-variegin相互作用的凝血酶残基催化袋—— 蓝色；60-环——红色；自我水解环——青色；34-环——黄色；70-环——绿色；裂口底部——橙色。以粉色显示了 s-variegin的球棍模型。(D) s-variegin通过特定侧链的接触与凝血酶相互作用。除了 5个残基(vPhel8， vAsp 19, vAla22, VG1M6和vTyr27，均以白色显示)之外，s-variegin上的所有残基的侧链都埋于与凝血酶的界面处。图12显示了新的variegin变体的设计。设计了新的variegin变体以改善凝血酶-variegin相互作用。方法为首先优化variegin的长度，然后优选variegin上的数个关键位置。图13显示了 variegin变体EP21对凝血酶的抑制，EP21是慢的紧密结合的竞争性抑制剂。(A)EP21(0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM,IOOOnM,3000nM 禾Π IOOOOnM) 对于凝血酶(1.65nM)胺裂解活性[使用S2238(100yM)]的抑制显示出预温育时间依赖性偏移，这是由于结合缓慢的缘故。无预温育时，IC5tl值是176. 9士6. SnM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是16. 2士2. 9nM(虚线)(n = 3，误差条代表S. D.)。(B)以 ΙΟΟμΜ S2238，不同浓度的 ΕΡ21(18. 8ηΜ，25ηΜ，37. 5ηΜ，50ηΜ，75ηΜ，100ηΜ 和150ηΜ)抑制凝血酶(1. 65ηΜ)的进程曲线(未显示)拟合入等式P = Vft+(Vi-Vf) (l-e_kt)/ k+P。(该等式描述了慢结合抑制剂)，以获得针对所用的每个EP21浓度的k值。k针对EP21 浓度的曲线(实线)是由等式k = K4+K3It/[It+V (1+S/KJ]描述的双曲线，因此，拟合进入等式以得出Kf为1. 66士0. 36nM，其代表了最初的碰撞复合物EI的解离常数。从等式Ki = K广[K4/(K3+K4)]计算得出总体抑制常数(Ki)是0. 315 士0. 024nM(n = 3，误差条代表S. D.)。图14显示了 variegin变体MH18对凝血酶的抑制；MH18是快的紧密结合的非竞争性抑制剂。(A)以 ΙΟΟμΜ S2238,测定了 MH18(0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM，ΙΟΟΟηΜ，3000nM和IOOOOnM)抑制凝血酶(1. 65nM)的胺裂解活性的能力。剂量应答曲线不依赖于预温育时间。无预温育时，IC5tl值是10.9士 1.2nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是11.7士 1.9nM(虚线)(n = 3，误差条代表S. D.)。(B)由于ΜΗ18作为快且紧密结合抑制剂发挥作用，所以在ΙΟΟμΜ ofS2238下，以 0. 39nM,0. 78nM,1. 56nM,3. 13nM,6. 25nM,12. 5nM,25nM,50nM,IOOnM 和 200nM MH18 测定了 对凝血酶(1. 65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合入等式Vs = ^^{[(Κ,'+Ι,-Ε,)2 +4Κ/EJv2-OV+It-EtM而获得的表观抑制常数(Ki’)是14.9±3.5nM。基于等式K/ =(S+Kj/TOVK^S/aig]和 K/ =Ki 计算的抑制常数(Ki)是 14. 9 士 3. 5ηΜ (η = 3，误差条代表S. D.)。图15显示了 variegin变体DVM对凝血酶的抑制；DVM是快的紧密结合的竞争性抑制剂。(A)以 100 μ M S2238, DV24(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)对于凝血酶(1. 65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC5tl值是7. 49士OJSnM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是10. 07士0. 60nM(虚线)(n = 3，误差条代表S. D.)。(B)由于DVM作为快且紧密结合的抑制剂发挥作用，以100yMS2238，测定了 0. 39ηΜ,0. 78nM,1. 56nM,3. 13nM,6. 25nM,12. 5nM,25nM,50nM,IOOnM 和 200nM DV24 对于凝血酶(1. 65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et)2+ 4K/EJv2-OV+It-EtM而获得的表观抑制常数(Ki，)是9.74 士 0.91nM。基于等式K/ = Ml+S/Kj计算的抑制常数(Ki)是0. 306士0.029nM(n = 3，误差条代表S. D.)。图16显示了 variegin变体DVMK10R对凝血酶的抑制；DVMK10R是快的紧密结合的竞争性抑制剂。(A)以100 μ M S2238,DV24K10R(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)对于凝血酶(1. 65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC5tl值是6.98士0.76nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是12.01士0.41碰(虚线)(11 = 3，误差条代表S. D.)。(B)由于DVMK10R作为快且紧密结合的抑制剂发挥作用，以100 μ MS2238，测定了 0. 39ηΜ,0. 78ηΜ,1. 56ηΜ,3. 13ηΜ,6. 25ηΜ,12. 5ηΜ,25ηΜ,50ηΜ,IOOnM 和 200ηΜ DV24K10R 对于凝血酶(1. 65ηΜ)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式Vs = (ν。/2Κ){[(ν+Ι「Ε J^Ki'EJ^-(Κ,'+Ι,-Ε,)}而获得的表观抑制常数(Ki，)是8.27士0·85ηΜ。基于等式⑷ 计算的抑制常数(Ki)是0. 259士0.015nM(n = 3，误差条代表S.D.)。图17显示=S-Variegin中的二肽序列vProl6-vftx)17 (黄色)的存在导致其骨架中的纽结。基于它们的凝血酶结构的s-variegin(粉色，仅显示了 Ca的位置)和蛭素类似物-3(绿色，仅显示了 Ca的位置)的覆盖图揭示了 vPhelS和vAspl9从蛭素类似物-3 的它们的对应残基GlylO和Aspll移位3.16 A和1.70 A (通过Ca位置测定)(青色的双箭头)。因此，vAspl9侧链以相反方向指向蛭素类似物-3中的类似的Aspll侧链。蛭素类似物-3中的该Aspll与TArg73形成强离子对(白色)。由于vAsp 19的移位，TArg73NH2与 vAspl9 ODl之间的最接近的可能距离是9.22 A，这使得凝血酶-s-variegin结构中的这种相互作用不可能发生。图18显示了 variegin变体DV23对凝血酶的抑制；DV23是快的紧密结合的竞争性抑制剂。(A)以 100 μ M S2238, DV23(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)对于凝血酶(1. 65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC5tl是45.4士 1.6nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是77. 8士6. InM(虚线)(n = 3，误差条代表S. D.)。(B)以 100 μ M S2238,测定了 3. 91nM, 7. 81ηΜ, 15. 6ηΜ, 31. 3ηΜ, 62. 5ηΜ, 125ηΜ,250nM和500nM DV23对于凝血酶(1. 65nM)的抑制。通过将数据拟合进入等式Vs = (V。/2Et) {[(V+It-Et) MK/Et]"2-(K/+It-EtM 而获得的表观抑制常数(Ki')是 69.6 士 7·8ηΜ。基于等式K/= Ki(HSzKm)计算的抑制常数(Ki)是2. 19士0. 23ηΜ(η = 3，误差条代表S. D.)。图19显示了 variegin变体DV23K10R对凝血酶的抑制；DV23K10R是快的紧密结合的竞争性抑制剂。(A)在存在 100 μ M S2238 的情况下，DV23K10R(0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM, IOOOnM和3000nM)抑制凝血酶(1. 65nM)。切割后活性的丧失是迅速的， 如剂量应答曲线的强烈右移所示。没有温育时，IC5tl值是12. 9士 LOnM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是101.9士1.2碰(虚线)(11 = 3，误差条代表S. D.)。(B)以 100 μ M S2238,测定了 3. 91nM, 7. 81ηΜ, 15. 6ηΜ, 31. 3ηΜ, 62. 5ηΜ, 125ηΜ, 250ηΜ和500ηΜ DV23K10R对于凝血酶(1. 65ηΜ)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式 Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et)2+4Ki，EJ1MKi，+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki')是 19. 1 士 1.9nM。基于等式 K/ = K^I+S/KJ 计算的抑制常数(Ki)是 0. 600士0. OlOnM(n = 3，误差条代表S.D.)。图20显示了注射了不同肽的斑马鱼幼虫的延迟阻塞时间(time-to-occlusion， ΤΤ0)。向斑马鱼4dpf (受精后天数)幼虫中注射10η1500μΜ的不同肽或IOnl PBS作为对照。通过在注射肽或PBS之后激光切除20分钟使幼虫尾静脉损伤。记录激光切除之后的 ΤΤ0，持续150秒，以比较不同肽的抗血栓效应。PBS、蛭素类似物-1、s-variegin、EP25和 MH22 的 TTO 分别是 19. 0士3. 2 秒、45. 0士5. 5 秒、120. 8士7. 4 秒、22. 5士6. 2 秒和 33. 3士2. 9 秒。在150秒内，在注射了 DV24K10RYsulf的幼虫中没有形成血栓。除了慢结合抑制剂EP25 之外，肽的延长TTO的能力大体上与它们的Ki相关(n = 4误差条代表S. D.)。图21显示了硫酸精蛋白的中和肽对于凝血酶胺裂解活性的抑制的能力使用发色底物 S2238 进行测定。将硫酸精蛋白(3mg/ml，lmg/ml，0. 3mg/ml，0. lmg/ml，0. 03mg/ ml，0. 0lmg/ml,0. 003mg/ml和0. 00lmg/ml)与浓度为其IC50的肽一起温育10分钟(实线)-8. 25nM s-variegin ( ■ )，11. 5nMMH22 ( ·)和 1. 4nM DV24K1 ORYsulf ( ▲)，然后加入凝血酶(1.65nM)。以100 μ M S2238测定凝血酶的胺裂解活性。比较了存在和不存在硫酸精蛋白的情况下的抑制百分比，以计算撤销百分比。s-variegin和ΜΗ22可以被撤销至相似程度，但是需要更高浓度的硫酸精蛋白以有效撤销DV24K10RYsulf。以浓度为其IC90的肽进行了类似的实验(虚线)对于s-variegin是 167nM( □)，对于 MH22 是 224nM(〇)，对于 DV24K10RYsulf 是 13. 6ηΜ( Δ )。需要更高浓度的硫酸精蛋白以撤销所有3种肽。s-variegin和MH22仍然被中和至相同的程度，中和 DV24K10RYsulf则更难。因此，肽的酸性C-末端残基最有可能负责与硫酸精蛋白的结合。本发明通过以下实施例进一步诠释，以下实施例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用方式并入本文。
实施例在全部实施例中使用以下参数的实例和定义V= (VfflaxS)/(S+KJ其中V是反应的最初速率，S是底物S2238的浓度，Km是底物对于酶(凝血酶)的Michaelis-Menten 常数。y = A2+(A1-A2)/[l+(x/x0)H]其中y是抑制百分比，A2是右水平渐近线，A1是左水平渐近线，χ是抑制剂浓度的 loglO, X0是拐点，H是曲线的斜率。通过将‘50’代入y计算IC5(1。Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et) ，Ej1/2- (Ki，+It-Et)}其中Vs是在存在抑制剂的情况下的稳态速率，V。在不存在抑制剂的情况下观察到的速率，Et是总酶浓度，It是总抑制剂浓度，K/是表观抑制常数。Ki' = K^I+S/KJ其中K/随着S线性增大，Ki是抑制常数，S是底物浓度，Kffl是对于S2238的 Michaelis-Menten 常数。 V = (S+Km) / [ (VKi) + (S/ α Ki)]其中α是抑制剂对于酶针对酶底物的亲和性的修饰常数，同样地，底物对于酶针对抑制剂的亲和性的效应。当一个的结合支持另一个时，α < 1 ；当一个的结合阻止另一个时，α > 1 ；当α = 1时，一个的结合对于另一个无影响。对于混合类型的非竞争性抑制齐IJ，α < 1或者> 1。Ki' = Ki其中K/随着S增大而保持恒定，Ki是抑制常数，S是底物S2238的浓度，Km是 S2238 的 Michaelis-Menten 常数。P = Vft+ (Vi-Vf) (l_e-kt)/k+P。k = K4+K3It/ [It+lV (1+S/Km)]其中Ki是总体抑制常数。Ki = Ki" [K4/(K3+K4)]其中P是形成的产物的量，P。是产物的最初的量，Vf是最终稳态速率，Vi是初速率， t是时间，k是表观一级速率常数。实施例1-结合于凝血酶的s-variegin的晶体结构的测定材料s4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPEQ、HEPES钠盐和聚乙二醇(PEG) 8000来自 Sigma Aldrich (St. Louis，Missouri，USA)。结晶托盘和油脂购自 Hampton Research (Aliso Vie jo, California, USA)。肽的合成、纯化和质谱使用固相肽合成方法在 Applied Biosystems Pioneer Model 433AP印tide Synthesizer (Foster City, California, USA)上合成本研究中使用的所有肽。在预装载了各个C-末端氨基酸的支持物树脂上组装合成的肽，其切割以释放在C-末端具有游离羧酸的肽。通过DMF中的20% ν/ν哌嗪除掉氨基酸的Fmoc基团，并使用HATU/DIPEA以原位中和化学法偶联。合成的肽从树脂上的切割以及侧链保护基团的切割通常使用TFA/1，2-乙二硫醇/茴香硫醚/水(90 4 4 2% ν/ν)的混合物在室温进行，持续2小时。使用冷的乙醚沉淀合成的肽。将沉淀的肽溶解于水或0. 1% TFA中并冻干，然后纯化。通过RP-HPLC 在AKTATM纯化系统(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上使用 SunFireTM C18(100 Α,δμπι ;250mm χ 10mm) (Waters,MiIford,Massachusetts)柱将合成的粗肽纯化至勻质。通常使用由两种溶剂的组合产生的优化的线性洗脱梯度(溶剂A^K 中的0. 1 % TFA ；溶剂B 水中的0. 1 % TFA和80%乙腈)洗脱肽。要特别注意的是含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MH18Ysulf)，其中硫酸酯基团是酸不稳定的。使用90%含水TFA在冰上进行这些肽的切割，持续5小时，如之前所描述过的(Kitagawa等人，2001)。使用含有0. 1 % FA作为离子配对剂而非TFA的溶剂进行含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MHlSYsulf)和含有磷酸酪氨酸的肽(DV24Yph°s和DVMK10RYph°s)的纯化。在质谱分析的离子化过程中，Tyr27上的硫酸酯部分不稳定的，因此观察到非硫酸化的物质。硫酸化肽的鉴定是基于(1)肽的非硫酸化的物质；(2)与酪氨酸残基在^Onm吸收UV不同，硫代酪氨酸残基不吸收；和(3)硫酸化和非硫酸化肽在RP-HPLC不共同洗脱。凝血酶α -凝血酶的两种不同来源——重组α -凝血酶(基于人α -凝血酶的序列)和源自人血浆的凝血酶，均为 Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (KAKETSUKEN, Japan) ； 贝曾。α -HiTrap Desalting Column(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上以20mM碳酸氢铵(NH4HCO3)脱盐并冻干，然后用于结晶。源自人血浆的凝血酶用于测定肽对于凝血酶的抑制活性。凝血酶-s-variegin复合物的结晶修改并优化了已报道的用于结晶人α -凝血酶的凝血酶-蛭素原和凝血酶-蛭素类似物-I复合物的结晶条件(Skrzypczak-Jankun等人，1991)。将冻干的s-variegin溶解于含有375mM NaCl的5OmM HEPES缓冲液(pH 7.4)中，达到8. ；34 μ M(3mg/ml)的浓度。然后，将脱盐的、冻干的、重组的α -凝血酶溶解于该s-variegin溶液中，达到5. 56yM(20mg/ ml)的终浓度。该混合物中的s-variegin的量相对于凝血酶为1. 5倍过量。使用悬滴气相扩散法进行凝血酶-s-variegin复合物的结晶。通常而言，将1 μ 1蛋白溶液与1 μ 1沉淀剂缓冲液(IOOmM HEPES缓冲液pH 7. 4，其中含有20%-25% (w/v)PEG 8000)混合，然后在 4°C以Iml沉淀剂缓冲液进行平衡。在大约4周之后出现晶体，2周后收获之以进行数据收集。设立、生长和收获晶体的整个过程在冷室中进行，因为晶体在室温是不稳定的。数据收集在数据收集之前，将晶体简单地浸于含有母液的补充了 25% (ν/ν)甘油的冷冻保护溶液中，并闪冷于100Κ的氮(气)冷流(Cryostream cooler, Oxford Cryosystem, Oxford, United Kingdom)。 在 Beamline X29(National Synchrotron Light Source, Brookhaven, USA)中测定同步加速器数据。使用Quantum 4-CCD检测器收集数据集(表 1)。使用程序HKL2000 (Otwinowski and Minor，1997)处理衍射数据。晶体属于单斜晶系空间组C2并衍射最大至2.7 A的分辨率，a = 124.66 A，b = 50.83 A，c= 61.54 A和 V = 385390.59A3 Da-I，并对应于59. 09%的溶剂含量。结构之解决和精修使用MolR印程序(Vagin and Teplyakov, 2000)，通过分子替代法解决凝血酶-s-variegin复合物的结构。使用凝血酶_蛭素类似物_3结构的坐标(PDB代码1ABI) Oiiu等人，199 作为搜索模型。旋转搜索定位了非对称单元中的一个凝血酶-肽复合物分子。确定转换成分之后的刚性体精修给出了 0. 60的相关系数，并且R = O. 48。得到的电子密度图质量很好。傅立叶和差別傅立叶图谱清楚地显示了 s-variegin的电子密度。使用 7. O版本的程序OCJ0nes等人，1991)进行的图谱拟合和使用1. 1版本的程序CNS (Brunger 等人，1998)进行的精修的数个循环产生R值的收敛。結晶学和精修统计显示于表1。使 用PR0CHECK(Laskowsi等人，1993)验证该模型的空间化学的正确性。使用在线服务器 PISA(Krissinel and Henrick, 2007)分析蛋白(图 2)。表1-来自当前模型的结晶学数据和精修统计
結晶学数据和精修统计*
权利要求
1.产生修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，所述修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制，所述方法包括修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP的结合使所述靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括将能够使所述靶SP的催化三元组的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基导入 SPI。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法产生修饰的SPI，其显示出延长的抑制持续时间。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的一个或多个导入的氨基酸残基是通过置换或插入导入的。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述的能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。
6.权利要求5的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸序列。
7.权利要求6的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。
8.权利要求7的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个残基包括催化性丝氨酸残基。
10.权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法进一步包括修饰SPI使其能被中和的步骤，包括将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。
11.权利要求10的方法，其中将所述导入的离子电荷区域导向SPI的羧基末端。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述导入的离子电荷区域是阴离子电荷区域。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中所述导入的离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。
14.权利要求13的方法，其中所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述中和试剂是硫酸精蛋白。
16.根据权利要求1-15任一项的修饰SPI的方法，其中所述SPI是凝血酶抑制剂。
17.根据权利要求16的修饰SPI的方法，其中所述SPI选自由SEQID NO: 14和17-153 中的任一项组成的组。
18.通过前述权利要求任一项的方法可获得的或获得的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。
19.根据权利要求18任一项的修饰的SPI，其中所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。
20.权利要求19的修饰的SPI，其包含下列共有序列N-末端肽PX1-H-X2-(G)n-(外部位点 I 结合肽)(SEQ ID NO 771)。
21.根据权利要求19或权利要求20的修饰的SPI或其片段或功能等同物，其包含选自 SEQ ID NO :158-770任一项的序列或由选自SEQ ID NO 158-770任一项的序列组成。
22.编码根据权利要求18-21任一项的修饰的SPI的核酸分子，或在高度严格杂交条件下与编码权利要求18-21任一项的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。
23.包含权利要求22的核酸序列的载体。
24.包含权利要求23的载体或权利要求22的核酸分子的宿主细胞。
25.抑制靶SP的方法，包括向受试者施用权利要求18-21任一项的修饰的SPI。
26.治疗患有凝血病的受试者或预防受试者患上凝血病的方法，包括施用权利要求19 的修饰的凝血酶抑制剂。
27.在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括a)施用根据权利要求19的修饰的凝血酶抑制剂；和b)然后向受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
28.显示出靶SPI的增强的抑制的修饰的SPI，其中SPI与其靶SP的结合使所述靶SP 的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。
29.权利要求28的修饰的SPI，其包括能够使所述靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基。
30.权利要求四的修饰的SPI，其中所述SPI显示出延长的抑制持续时间。
31.权利要求四的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。
32.权利要求四的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸序列。
33.权利要求32的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。
34.权利要求33的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。
35.权利要求观-34任一项的修饰的SPI，其中所述靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个氨基酸残基包括催化性丝氨酸残基。
36.权利要求观-34任一项的修饰的SPI，其进一步包括离子电荷区域，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。
37.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域向SPI的羧基末端放置。
38.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域是阴离子电荷区域。
39.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。
40.权利要求39的修饰的SPI，其中所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。
41.权利要求36-40任一项的修饰的SPI，其中所述中和试剂是硫酸精蛋白。
42.权利要求观-41任一项的修饰的SPI，其中所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。
43.权利要求42的修饰的SPI，其含有下列共有序列N-末端肽 PX1-H-X2-(G)n-(外部位点 I 结合肽)(SEQ ID NO :771)。
44.修饰的SPI或其片段或功能等同物，其包含选自SEQID NO 158-770任一项的序列或由选自SEQ ID NO :158-770任一项的序列组成。
45.编码根据权利要求观-44任一项的修饰的SPI的核酸分子，或在高度严格杂交条件下与编码根据权利要求观-44任一项的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。
46.包含权利要求45的核酸序列的载体。
47.包含权利要求46的载体或权利要求45的核酸分子的宿主细胞。
48.抑制靶SP的方法，包括施用权利要求观-44的修饰的SPI。
49.治疗患有凝血病的受试者或预防受试者患上凝血病的方法，包括施用权利要求42 的修饰的凝血酶抑制剂。
50.在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括a)施用根据权利要求42的修饰的凝血酶抑制剂；和b)然后向受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
全文摘要
本发明涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法，所述性质包括抑制程度、丝氨酸蛋白酶抑制剂被靶丝氨酸蛋白酶切割之后抑制的维持、与丝氨酸蛋白酶的结合速度、中和以及结合亲和性。本发明还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。
文档编号C07K14/435GK102574909SQ201080030096
公开日2012年7月11日 申请日期2010年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者R·曼朱纳塔·基尼, 库玛·顺德拉墨尔西, 昆奇塔帕丹姆·斯瓦米纳坦, 许祖尧 申请人:自然环境研究会