一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明“一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用”，涉及生物制药技术。本发明的肽具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列，经细胞试验验证，其具有对乙肝病毒的明显抑制作用，经动物试验验证，其还有全面改善动物健康状态的作用；本发明还提供了基因工程方法制备该多肽的方案，能制备得到克级以上的肽产物。本发明的肽在抗病毒、全面改善动物健康状态等方面的作用，使其能够作为制备人和动物都可以使用的治疗药物和保健产品的主要成分，应用于治疗药物、健康产品和饲料添加剂中。
【专利说明】一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用 第一部分：【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种肽(Mytilin B)及其在制备治疗药物、 健康产品和饲料添加剂中的应用、制备方法。 第二部分：【背景技术】
[0002] 防御素是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，天然免疫物 质，分子量在3000?7000左右，由20?60个氨基酸残基组成，多个二硫键。这类活性多 肽多数具有强碱性、热稳定性、以及广谱抗菌等特点。天然的防御素分布在从植物、低等动 物到哺乳动物等几乎所有的生物类群中，是生物自身防御体系的重要组成部分。
[0003] 多数防御素能有效杀灭革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。在体外浓度为10? IOOmg / L的防御素即对多种细菌具有杀伤作用，而防御素在中性粒细胞中的浓度为g / L 级，远远超过上述数值，这表明在体内防御素可能具有更强的杀菌活性，目前研究发现防御 素对革兰阳性细菌的杀伤能力明显要强于革兰阴性细菌。在体外，HBD-2对大肠杆菌的半数 致死量（LD50)为0. 46nmol / ml，最小抑菌浓度（MIC)为15yg / ml，而对绿脓杆菌、金黄 色葡萄球菌的MIC为62yg / mi。体外实验证明大多数防御素的MIC范围为0. 5-ΙΟμπιοΙ / L〇
[0004] 防御素还能杀灭一些被膜病毒,如HIV、疱疹病毒、水泡型口炎病毒，但对无衣壳病 毒却无效。Θ-防御素还具有抗滤过性病原体和抗毒素作用。防御素主要通过与病毒外壳 蛋白结合从而导致病毒丧失生物活性，这一特殊作用机理也使得微生物不易对其产生抵抗 性。防御素可直接抑制病毒，对病毒的抑制程度依赖于防御素浓度以及分子内二硫键的紧 密程度，其抗病毒功效同样受时间、PH值、离子强度和温度等因素的影响，在中性及低离子 强度条件下，防御素具有较强的抗病毒活性。
[0005] 防御素不仅可以直接抵抗病原微生物，而且还具有免疫调节作用。防御素通过细 胞信号传递的作用，增强非特异性免疫细胞，尤其是巨噬细胞的活性和趋化性。防御素还可 以促进机体T细胞的趋化和增殖，增强机体免疫应答能力，调节特异性免疫，增强生物机体 主动防御功能。防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表 面受体从而启动获得性免疫系统，并将先天性免疫和获得性免疫有机连接。现已证明一些 α -防御素 、β -防御素对T细胞、单核细胞以及未成熟的DC具有趋化活性，可诱导单核细 胞和上皮细胞产生细胞因子。人、鼠、猪、兔的中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒 并释放组胺。β-防御素还能通过与人趋化因子受体6 (CCR6)结合，从而吸引不成熟的树突 状细胞（DC)和记忆T细胞（Tm)至炎症部位，激活细胞免疫和体液免疫。此外，防御素还可 以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚。
[0006] 抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡，药物残留也影响了畜产 品的品质和人类健康，而来源于贝类、哺乳动物的防御素相对分子质量较小，热稳定性和水 溶性均较奸，可以在肠道内吸收。由于防御素属于多肽成分，在体内容易被蛋白酶降解为 氨基酸，动物采食后在体内一般无残留。利用基因工程方法生产环保型防御素饲料添加剂 或通过日粮添加，都可有效提高免疫、防止疾病和促进生长，如减少死胎、木乃伊及残疾；提 高初生重及仔猪出生均匀度；提高仔猪断奶重、断奶成活率，降低哺乳期仔猪发病率；降低 哺乳母猪发病率，减少母、仔猪各种应激；改善母猪亚健康和繁殖障碍，延长母猪使用年限； 提高保育猪成活率，降低发病率；提高保育猪日增重、降低料肉比；改善免疫抑制，提高免 疫应答能力，抗体水平更整齐。
[0007] 源自地中海贻贝的防御素 Mytilin B氨基酸序列如Seq ID No. 3所示，其由34个 氨基酸残基组成，4个二硫键，复合螺旋和β结构。Mytilin B防御素具有广谱活性，能抑 制革兰氏阳性和阴性菌，同时具有抗病毒的活性。Mytilin B防御素利用N端所带的正电荷 与原核细胞的细胞的细胞膜磷脂双分子层密集的负电荷静电相吸，C端柔性的插入疏水区， 在两亲性α -螺旋作用下，在原核细胞膜上形成4nm的离子通道，离子通道的形成改变了细 胞膜内外的渗透压，细胞膜内物质大量外渗，致细菌细胞死亡，起到杀菌作用。Mytilin B防 御素的抗病毒机理是与病毒的衣壳特异性结合，从而抑制病毒的复制。
[0008] 法国科学家在贻贝的防御素 Mytilin研究方面做了大量的工作，天然的贻贝防 御素有 MytiIin A (Seq ID No. 3)，Mytilin B (Seq ID No. 1)，Mytilin C (Seq ID No. 4)， Mytilin D(Seq ID No. 5)和 Mytilin G(Seq ID No. 6)等。由于防御素 Mytilin 分子小，分 离提纯存在一定的困难，且天然资源有限，很难产业化；因为防御素的二硫键和多肽空间结 构决定了其基本的特性，化学合成不可能得到具有良好活性的产品，多方研究表明，化学合 成的活性产品只有天然产物的百分之一或更低；只有基因工程途径才能获得具有良好活性 的防御素，由于高浓度Mytilin防御素多肽可杀灭绝大多数宿主细胞，同时在分泌表达过 程中，防御素容易被宿主菌的酶系统所降解，从而产生两败俱伤的情形而无法真正获得足 量的表达产物。所以，目前还没有Mytilin防御素多肽的工程菌表达产业化生产技术，也未 见到准确表达和获得足量的该多肽以供试验用的报道，更未见到其在乙肝治疗、免疫药物、 饲料添加剂等方面的应用报道。 第三部分：
【发明内容】
[0009] 本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种源自地中海贻贝防御素的的生物工 程制备方法及其在制备治疗药物、健康产品和饲料添加剂中的应用。
[0010] 一种肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
[0011] 编码上述肽的基因。
[0012] 所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0013] 含有上述基因的表达载体。
[0014] 所述表达载体的骨架载体为pKLACl。
[0015] 上述肽的制备方法，其特征在于将上述表达载体转入到酵母细胞中，发酵培养。
[0016] 所述酵母细胞为蛋白酶缺陷型K. Iactis YCT389, YCT390、YCT569与YCT598。
[0017] 上述肽在制备治疗药物、健康产品和饲料添加剂中的应用、制备方法。
[0018] 所述药物和产品为口服制剂。
[0019] 本发明根据源自地中海贻贝的防御素 Mytilin B，由34个氨基酸组成，分子量为 3981. 7Da，等电点9. 58,疏水比率41%，净电荷+9。由于绝大多数多肽，包括Mytilin B在 酵母分泌表达异源蛋白时候会被降解，其主要原因是由于分泌途径中天冬氨酰蛋白酶作用 引起的，在许多情况下，仅天冬氨酰蛋白酶就可导致大多数蛋白被破坏性地降解。K. Iactis YCT389、YCT390、YCT569与YCT598菌株均为特异性分泌途径天冬氨酰蛋白酶基因无选择标 记删除型，我们选择了其作为Mytilin B的宿主菌，获得了经济和稳定的表达，实现产业化 制造。发酵过程我们全程采用了液质联用监测分泌表达出的多肽的降解情况。
[0020] 本发明提供了 Mytilin B肽的制备方法，本发明将构建得到的表达载体转入到酵 母表达系统中，使其表达Mytilin B肽，通过后续的分离纯化干燥步骤的得到Mytilin B肽 纯品。本发明优选采用的酵母感受态细胞K. Iactis YCT389,蛋白酶缺失型，特异性分泌途 径天冬氨酰蛋白酶基因无选择标记删除型，没有遗传标记，适用于线性化PKLAC或pKLMF为 基础的表达载体的转化。使用该表达系统，可确保分泌表达的Mytilin B肽不会被降解，同 时具备活性，该表达系统也可以工业化表达Mytilin A(Seq ID No. 3)，Mytilin C(Seq ID No. 4)，Mytilin D(Seq ID No. 5)和 Mytilin G(Seq ID No. 6)，使其可用于药物制造、健康 产品和饲料添加剂。
[0021] 试验证明，本发明采用基因工程方法制备的Mytilin B肽的产率为0. 2%以上（指 纯化得到的表达产物与折干的培养基质量相比的比例）。
[0022] 本发明根据上述Seq ID No. 1所示的氨基酸序列，设计了编码该氨基酸序列的基 因序列，利用密码子的兼并性，调整了核苷酸序列使其符合酵母表达系统对密码子的偏好 性而得到Seq ID No. 2所示的核苷酸序列，有利于稳定高效表达防御素。
[0023] 本发明还提供了含有上述基因的表达载体，所采用的骨架载体为pKLACl或 PKLAC2, pKLAC2的结构见说明书附图1，通过pKLACl或pKLAC2,其中的重组蛋白可在细胞 内表达，也可分泌表达。有利于获得高产量和纯度的防御素。
[0024] 本发明提供的Mytilin B肽可以作为治疗药物、保健产品和饲料添加剂的主要成 分，制备成各种剂型的药物和产品。如乙肝药物、抗病毒药物、免疫增强产品、睡眠改善产 品、饲料添加剂、功能食品、兽药、生长促进剂等。体外药物试验表明，Mytilin B肽对乙型 肝炎病毒活性有明显的抑制作用，见实施例2。动物试验表明，其还有全面改善动物健康状 态的作用，见实施例3。本发明优先制备成口服制剂。 第四部分：【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1.骨架载体pKLACl结构图
[0026] New England Biolabs，Inc 提供
[0027] 图2.本发明制备的Mytilin B肽的质粒测序报告
[0028] 将酶切鉴定正确的重组质粒PMD19-T的克隆，测序结果显示克隆完全正确。 第五部分：【具体实施方式】
[0029] 实施例I. Mytilin B肽的制备
[0030] 步骤1.外源DNA合成
[0031] 利用DNA化学合成仪制备外源基因，得到编码Mytilin B肽的外源DNA片段，如 Sequence ID No. 2 所不。
[0032] 验证：将酶切鉴定正确的克隆送至北京诺赛基因组研究中心进行序列测定，测序 报告见（图2)。
[0033] 步骤2.表达载体的构建
[0034] 表达载体为K. Iactis蛋白质表达试剂盒所提供的pKLACl (购于New England Biolabs，Inc)在 pKLACl(9097bp)上，Lac4 启动子（PUC4_PB1)的 5'和 3'端被编码 β -内 酰胺酶的基因（ApR)和pMBl的复制原点所隔开。Κ. Iactis α -结合因子分泌引导序列 (a -MF)、多克隆位点（MCS)和Lac4转录终止子（TT)位于3' PUC4_PB1的下游；酵母的Padh2 调控乙酰胺酶标记基因（amdS)的表达。
[0035] 用Sac II或Bst XI酶切载体pKLACl使其线性化，将外源DNA片段Sequence ID No. 2插入到酵母K. Iactis基因组自身的Lac4启动子位点，获得重组载体。该重组载体中， 目的基因被克隆到pKLACl上的K. Iactis α结合因子（a Mating Factor，α-MF)的下游， 见图1，在酵母K. Iactis的细胞核中，编码a-MF结构域和外源重组蛋白的DNA与酵母基因 组整合，编码的a -MF最终将在高尔基体上被剪切以使目的蛋白质分泌表达。
[0036] Puc^pbi启动子调控表达：一旦融合蛋白质开始表达，位于a-MF上的信号肽就会 指导融合蛋白质转运到内质网（ER)膜上，在此信号肽酶（SP)将信号肽切除。分泌小泡（环 形）将融合蛋白质转运至高尔基体，Kex蛋白酶在此将α-MF结构域切除，释放成熟的目的 蛋白质。随后，目的蛋白质通过分泌小泡运输到质膜（PM)，从质膜分泌到胞外.
[0037] 步骤2.转化
[0038] 使用 K. Iactis YCT389, YCT390、YCT569 与 YCT598 (购于 New England Biolabs， Inc)感受态细胞。
[0039] 将步骤1构建得到的重组载体置于感受态细胞溶液中，使重组质粒吸附于感受态 细胞的表面，冰浴一段时间，细胞膜处于收缩状态。然后迅速将感受态细胞置于42°C，使细 胞在热环境中膜通道开放，重组质粒由膜外高浓度区向膜内扩散，经过45秒时间后，再将 感受态细胞放回冰浴中，膜通道关闭，重组质粒转入酵母菌。
[0040] 酵母转化子用乙酰胺进行筛选，将细胞转化混合物（含有大量被pKLACl转化或 未转化的细胞）涂于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源（YCB)培养基上。YCB培养基含有 K. Iactis细胞生长所需的所有营养物质和碳源，但缺少氮源。只有当乙酰胺被乙酰胺酶 (由pKLACl上的amdS基因表达）降解为氨时，才能作为氮源而被利用。因此，只有转化的 细胞才能长成菌落。
[0041] 验证：
[0042] 挑取菌落，用摇瓶培养，培养基为含38mM硫酸铵的YPGal培养基（1 %酵母提取物， 2%蛋白胨，2%半乳糖），28°C?30°C，培养时间70小时。离心3000rpm，取上清液，琼脂糖 凝胶电泳分析。
[0043] 步骤3.转化体的培养
[0044] 含38mM硫酸铵的YPGal培养基（2%酵母提取物，4%蛋白胨，6%半乳糖），标准发 酵罐深层通气培养，120°C湿热蒸汽灭菌30分钟，冷却到28°C，接种，28°C?30°C，发酵过程 中再流补半乳糖6%，培养时间70小时。
[0045] 步骤4Mytilin B肽的分离纯化
[0046] 发酵液采用陶瓷膜分离掉菌体；然后用纳滤浓缩到蛋白质含量在5%左右；加热 到80度，保持20分钟，冷却到20度，离心分离去杂，转速lOOOOrpm，30min ;加10倍量PH5 盐酸溶液稀释，使蛋白质含量〇. 5 %左右，过DEAE和G50凝胶柱；纳滤浓缩蛋白质含量在 5%左右，冻干，产物纯度为95%，纯化产物与折干的培养基质量相比，Mytilin B肽的产率 为0. 2%左右
[0047] 产率={(发酵液表达产物总质量IX纳滤浓缩收率X去杂收率X凝胶分离收 率X浓缩收率X冻干收率）/折干的培养基总质量} X 100%。
[0048] 步骤5.配制成备用液
[0049] 上步冻干的纯化物，用0. IN盐酸溶解，制成20mg / ml的Mytilin B肽，保存备用。
[0050] 实施例2. Mytilin B肽抑制乙型肝炎病毒复制活性试验
[0051] 步骤1.药物处理
[0052] 取H印G2. 2. 15细胞一瓶，用0. 25 %胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细 胞浓度为5X IO4Cell / ml，Iml /孔加入24孔培养板中，置37°C，5% CO2细胞培养箱中培 养过夜。第二天吸弃上清，加入含有不同药物浓度（50, 25,12. 5,6. 25, 3. 13和0 μ M)的DMEM 培养基，每组4复孔。每次作用4d后换同样药物浓度的细胞培养液，并于第4和8天，收集 各孔上清至I. 5ml离心管中，-20°C冻存备用。
[0053] 步骤2.细胞培养上清中HBV表面抗原和E抗原的检测
[0054] 采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg，具体操作按照试剂盒的使用说明进行。显色反 应结束后，用酶标仪在450nm处检测各孔OD值。
[0055] 步骤3.数据处理
[0056] 数据表不为means 土 SD。
[0057] IC(Inhibition rate,抑制率）= (1_0D 药物处理组 / OD 阴性对照组）X 100%
[0058] 步骤4.实验结果，对乙型肝炎病毒复制的抑制作用
[0059] H印G2. 2. 15细胞在24孔板培养过夜后，加入不同稀释浓度的药物，同时设定细胞 对照组和阳性对照组。在培养4和8d后分别收集细胞上清，采用ELISA法检测HBsAg和 HBeAg的表达。
[0060] 受试物My t i I in B肽和阳性药3TC使培养液中的HBsAg分泌水平不同程度的下降， 在3. 13?50μ g的浓度范围内具有明显的剂量相关性的抑制作用。与同期空白对照组的 OD值比较，Mytilin B肽各浓度组在第4d和第8d细胞上清HBsAg含量明显下降（p〈0. 05 或0. 01)(结果见表1)。Mytilin B肽对细胞上清HBsAg分泌的半数抑制浓度IC50大约为 3. 0 ?12 μ g / ml。
[0061] 表IMytilin B肽对H印G2. 2. 15细胞分泌HBsAg的抑制作用（J 土切）
[0062]
【权利要求】
1. 一种贻贝肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述的肽的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
4. 含有权利要求3所述的基因的表达载体。
5. 根据权利要求4所述的表达载体，其骨架载体为pKLACl或pKLAC2。 6?如 Seq ID No. 1、Seq IDNo. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示的氨 基酸序列多肽采用本专利所述酵母菌K. lactis YCT389、YCT390、YCT569与YCT598制备，及 类似酵母菌K. lactis YCT284、YCT799、酿酒酵母、面包酵母、乳酸克鲁维酵母和啤酒酵母制 备。 7?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示氨基 酸序列多肽的制备方法，其特征在于将骨架载体为pKLACl或pKLAC2的表达载体转入到权 利要求6所述的酵母细胞中进行发酵培养。 8?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示的 氨基酸序列多肽在制备治疗药物、健康产品和饲料添加剂中的应用，如乙肝药物、抗病毒药 物、免疫增强产品、睡眠改善产品、功能食品、饲料添加剂、兽药、生长促进剂等。
9.根据权利要求8所述的应用，所述药物和产品指口服药物、注射药物、固体和液体产 品。
【文档编号】A61P1/16GK104418945SQ201310389379
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】邓立, 丁杰, 刘勇, 邓韵蕾, 陆洋, 陈尚卫 申请人:邓立