一种内源性洋地黄样因子抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种内源性洋地黄样因子抑制剂，本发明开发了一种名为“酮康唑”的临床常见药物作为内源性洋地黄样因子的抑制剂，为早痫的治疗开辟了一条新的道路，本发明更深远的意义在于，酮康唑对内源性洋地黄样因子抑制作用的确定，为进一步研究该因子在体内的合成途径，进而对其化学结构的测定奠定了基础。
【专利说明】—种内源性洋地黄样因子抑制剂
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗器械【技术领域】，尤其是一种内源性洋地黄样因子抑制剂。
【背景技术】
[0002]孕期先兆子痫(孕期早痫)是一种病发原因复杂的综合征，如果不及时治疗，可发展为子痫，危及生命。主要症状有高血压、蛋白尿，水肿，惊厥，肾功能损伤等，已成为世界上孕妇致死率最高的一种疾病，目前具体病因不明。有研究证明，胎盘产生的一种导致易感妇女母体血管内皮功能障碍的物质可能是早痫病发的其中一个原因。血压升高是该疾病最明显的标志，同时造成对产妇内皮，肾脏和肝脏的损害。
[0003]先兆子痫(早痫)在全球孕妇中发病率为6_8%，通常发病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后发病(32周前发病被认为是早期发病)，极少数孕妇会在孕期20周发病。初次怀孕的孕妇发病率最高，并且随着妊娠次数的增加，该疾病发病率大幅度降低。早痫多发于具有高血压史，糖尿病史，肥胖症史，自身免疫性疾病史如狼疮，和多胎妊娠(双胞胎或多胞胎)的孕妇中，其发病过程因人而异，大多数病例可以在分娩前被确诊，少数病例在分娩后六周才被确诊，称为“产后早痫”。早痫确诊后，可以采用静脉点滴硫酸镁防止发生抽搐，和服用降压药降血压等方式缓解症状，但除了剖腹产或引产手术，没有其他的根治方式。早痫是最常见的的妊娠综合症，同时影响母亲和胎儿，导致早产儿甚至对母婴造成生命危险。
[0004]在早痫病人的症状中，一种钠钾泵抑制因子-内源性洋地黄样因子(endogenousdigitalis-like factor, EDLF)水平的升高,是早痫的重要标志。这种因子含量过高能够导致血压升高和肾功能损伤。该因子存在于人体和动物组织及体液中，其化学结构和生物活性与植物洋地黄中提取的类固醇强心剂相似，故名“洋地黄样因子”，该因子能够以与地高辛等强心剂类似的机制结合到钠钾泵上，并抑制其活性，但目前为止，此类因子的具体化学结构仍然未知。许多高 血压病症均发现伴随内源性洋地黄样因子水平的升高，因此，该因子很可能是造成高血压的原因。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种方便易得有效的该因子抑制剂，为后续治疗提供有利依托。
[0006]本发明实现目的的技术方案如下:
[0007]酮康唑作为抑制内源性洋地黄样因子的应用。
[0008]酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子药物的应用。
[0009]酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子引起相关疾病的药物的应用。
[0010]而且，所述相关疾病包括孕期先兆子痫和高血压。
[0011]酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子药物的应用。
[0012]本发明的优点和积极效果是:[0013]1、本发明提供了一种方便有效易得的内源性洋地黄样因子抑制剂，能很大程度降低内源性洋地黄样因子在早痫患者体内的浓度，解决了长期以来早痫治疗的重大困难。
[0014]2、本发明提供了一种研究内源性洋地黄样因子化学结构的新角度，为进一步对该因子的致病机制、体内合成途径、调节机制的研究打下良好基础，并使孕期早痫的病理研究工作向前迈进了一大步。
[0015]3、本发明开发了一种名为“酮康唑”的临床常见药物作为内源性洋地黄样因子的抑制剂，为早痫的治疗开辟了一条新的道路，本发明更深远的意义在于，酮康唑对内源性洋地黄样因子抑制作用的确定，为进一步研究该因子在体内的合成途径，进而对其化学结构的测定奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为随着组织培养时间的累积，测出人胎盘分泌的内源性洋地黄样因子含量逐步增加。其中，横坐标代表培养时间，单位小时；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位10_8摩/升。
[0017]图2为加入酮康唑的人体胎盘分泌的内源性洋地黄样因子含量随培养时间的增长而逐渐降低。其中，横坐标代表培养时间，单位小时；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位10_8摩/升。
[0018]图3为经过24小时培养时间，酮康唑对胎盘分泌的内源性洋地黄样因子浓度的抑制作用。其中，横坐标代表胎盘组织培养液中加入的酮康唑溶液浓度，单位微摩/升，纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。
[0019]图4为经过48小时培养时间，酮康唑对胎盘分泌的内源性洋地黄样因子浓度的抑制作用。其中，横坐标代表胎盘组织培养液中加入的酮康唑溶液浓度，单位微摩/升，纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0021]酮康唑是一种已知的体内类固醇合成抑制剂，它通过广泛抑制类固醇合成途径中几种酶(细胞色素P-450-依赖酶家族)的活性来抑制该途径，因此，通过其对内源性洋地黄样因子合成的抑制作用，可以推断出该因子在体内的合成途径与类固醇合成途径相似，该因子与类固醇有相似结构，这个发现对于解决长期以来研究该因子的最大困难，即由于其在体内含量非常低而无法将其分离，进而确定其结构有突破性的帮助。
[0022]本发明所述的一抗地高辛抗体购自GlaxoSmithKline (又名抗地高辛抗体)、二抗鼠抗羊 IgG 均购自 JacksonlmmunoResearchLaboratories, Inc、3H 标记乌本苷购自PerkinElmer、聚乙二醇4000购自Calbiochem、pH=7.4的憐酸缓冲液(PBS缓冲液)自配、3H闪烁液购自NationalDiagnostics、乌本苷购自Sigma、pH=7.4的三轻甲基氨基甲烧缓冲液(Tris缓冲液)购自Sigma, DMEM培养液购自Gibson,酮康唑购自Sigma。
[0023]本发明所述的方法 需要可以测量3H放射性的仪器设备进行测量。(设备名为scintiIIationcounterο任何做放射性实验的实验室都有,操作过程为把样品放进去,运行操作软件，直接出结果。)
[0024]实施例1:
[0025]测量胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量随时间变化
[0026]⑴采集分娩时间少于6小时的新鲜人胎盘；
[0027]⑵拨开羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的组织块4_5块，放入PBS中洗掉残留血液；
[0028]⑶将组织块剪成微粒，去除肉眼可见血块和血管，用PBS洗至无血液残留，在无菌滤纸上吸干PBS，放入DMEM培养液中，37°C、5%C02培养箱中培养；
[0029]⑷经过12，24，36，48小时，分别收集培养液，离心去除残留组织块，4°C保存；
[0030](5)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、3H标记乌本苷，分别取100微升，与100微升待测样品充分混合，室温孵育；
[0031](6)再加入400微升PEG4000溶液，离心，得到沉淀物；
[0032](7)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入4毫升3H闪烁液；
[0033](8)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
[0034]结果如图1所示，胎盘分泌的内源性洋地黄样因子浓度随培养时间的增长而升闻。
[0035]实施例2:.
[0036]测量酮康唑对胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量随时间的影响
[0037]⑴采集分娩时间少于6小时的新鲜人胎盘；
[0038]⑵拨开羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的组织块4_5块，放入PBS中洗掉残留血液；
[0039]⑶将组织块剪成微粒，去除肉眼可见血块和血管，用PBS洗至无血液残留，在无菌滤纸上吸干PBS，放入DMEM培养液中，
[0040]⑷在组织培养液中加入20微摩/升的酮康唑溶液，混合均匀，放入37°C、5%C02培养箱中培养；
[0041](5)经过12，24，36，48小时，分别收集培养液，离心去除残留组织块，4°C保存；
[0042](6)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、3H标记乌本苷，分别取100微升，与100微升待测样品充分混合，室温孵育；
[0043](7)再加入400微升PEG4000溶液，离心，得到沉淀物；
[0044](8)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入4毫升3H闪烁液；
[0045]⑶测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
[0046]结果如图2所示，酮康唑的加入抑制了图1所示胎盘分泌内源性洋地黄样因子含量随时间的累积。
[0047]实施例3:
[0048]测量酮康唑对胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量的影响
[0049]⑴采集分娩时间少于6小时的新鲜人胎盘；
[0050]⑵拨开羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的组织块4_5块，放入PBS中洗掉残留血液；[0051 ] ⑶将组织块剪成微粒，去除肉眼可见血块和血管，用PBS洗至无血液残留，在无菌滤纸上吸干PBS，放入DMEM培养液中，
[0052] ⑷在组织培养液中分别加入I微摩/升，2微摩/升，5微摩/升，10微摩/升和20微摩/升的酮康唑溶液，混合均匀，放入37°C、5%C02培养箱中培养24或48小时；[0053](5)收集培养液，离心去除残留组织块，4°C保存；
[0054](6)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、3H标记乌本苷，分别取100微升，与100微升待测样品充分混合，室温孵育；
[0055](7)再加入400微升PEG4000溶液，离心，得到沉淀物；
[0056](8)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入4毫升3H闪烁液；
[0057](9)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。
[0058]结果如图3，4所示，酮康唑可以极大减少内源性洋地黄样因子在胎盘中的分泌量，这种抑制作用随着酮康唑用量的增加而变大，并且48小时培养时间的抑制率比24小时培养时间的抑制率要高，充分 说明酮康唑在胎盘中抑制了该因子的合成分泌。
【权利要求】
1.酮康唑作为抑制内源性洋地黄样因子的应用。
2.酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子药物的应用。
3.酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子引起相关疾病的药物的应用。
4.根据权利要求3所述的酮康唑作为制备抑制内源性洋地黄样因子引起相关疾病的药物的应用，其特征在于:所述相关疾病包括孕期先兆子痫和高血压。
5.酮康唑作为制备抑 制内源性洋地黄样因子药物的应用。
【文档编号】A61K31/496GK103432135SQ201310404027
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】马洁, 刘小兵, 张慕军 申请人:天津市康婷生物工程有限公司