采用mdck细胞系生产禽流感病毒二价灭活疫苗的方法
【专利摘要】本发明提供一种采用MDCK细胞系生产禽流感病毒（H5亚型+H9亚型）二价灭活疫苗的方法。包括如下步骤：（1）MDCK细胞系的传代与培养；（2）病毒接种与繁殖；（3）病毒液的灭活与收获；（4）配制疫苗。利用MDCK细胞系生产禽流感病毒灭活疫苗具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。
【专利说明】采用MDCK细胞系生产禽流感病毒二价灭活疫苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制品【技术领域】，具体地说，涉及一种采用MDCK细胞系生产禽流感病毒(H5亚型和H9亚型)二价灭活疫苗的方法。
【背景技术】
[0002]目前，我国生产禽流感病毒灭活疫苗的方式主要是利用9-11日龄健康鸡胚进行培养。该培养方法是通过将病毒接种到鸡胚尿囊腔中进行病毒繁殖，这种生产方式不能满足未来我国对禽流感疫病的预防与控制需求，主要表现在以下几个方面:(1)生产周期长，难以在短时间内实现大规模疫苗生产；(2)受鸡胚等原辅材料的限制；(3)生产工艺落后，劳动力密集，生产成本高。禽流感病毒(H5亚型+H9亚型)二价灭活疫苗在我国禽流感疫病防控过程中具有举足轻重的作用，采用MDCK细胞的生产方式具有无外源因子污染，易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，并具备突发疫情中疫苗供应应急的能力，是未来禽流感疫苗生产的发展趋势。
【发明内容】
[0003]本发明旨在克服现有技术中存在的缺陷，提供一种采用MDCK细胞系生产禽流感病毒(H5亚型和H9亚型)二价灭活疫苗的方法。
[0004]为了实现本发明目的，本发明的一种采用MDCK细胞系生产禽流感病毒二价灭活疫苗的方法，包括以下步骤:
[0005](I)MDCK细胞系的传代与培养:MDCK细胞系经胰酶-EDTA消化分散，用细胞生长液稀释成一定浓度后，接种至合适的容器内，待细胞长满后进行传代或接种病毒；
[0006](2)病毒接种与繁殖:用病毒生长液分别将H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒进行适当稀释后，分别接种用PBS清洗(清洗3次)的MDCK细胞，待MDCK细胞完全病变
后，停止培养；
[0007](3)病毒液的灭活与收获:向上述细胞培养液中加入甲醛溶液灭活后，分别收获H5亚型禽流感病毒抗原和H9亚型禽流感病毒抗原；
[0008](4)配制疫苗:将H5亚型禽流感病毒抗原和H9亚型禽流感病毒抗原混入吐温_80后制成水相，与油相一同乳化，分装后制成成品疫苗。
[0009]优选地，步骤(2)中所述的H5亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株或重组禽流感病毒H5N1亚型Re-6株，H9亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H9N2亚型Re_2 株。
[0010]优选地，步骤(2)中所述的MDCK细胞为平面贴壁培养的细胞或采用生物反应器进行悬浮培养的细胞。
[0011]优选地，步骤(1)中所述的细胞生长液中含有90-95%体积的DMEM液和5_10%体积的胎牛血清组成，PH值7.0-7.4。
[0012]优选的，步骤(4)中所述的水相包含46.5份H5亚型禽流感病毒抗原、46.5份H9亚型禽流感病毒抗原和7份吐温-80 ;油相包含93份白油、5份司盘-80和2份硬脂酸铝。进行乳化时水相1份，油相2份(所述份数为质量比重)。
[0013]优选地，步骤(1)中细胞培养条件为37°C，5%C02。
[0014]优选地，步骤(2)中所述的病毒生长液为含有5 μ g/mL TPCK处理胰酶和0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4。
[0015]优选地，步骤(2)中细胞培养条件为34°C，5%C02。
[0016]优选地，步骤(2)中接种时H5亚型禽流感病毒接种量为M0I10-4-10_6，H9亚型禽流感病毒接种量为MOIKT5-1O'
[0017]优选地，步骤(3)中所述甲醛溶液的浓度为0.1%。
[0018]优选地，步骤(3)中灭活条件为37°C，灭活24h。[0019]本发明至少具有下列优点及有益效果:
[0020]本发明首次采用MDCK细胞系生产禽流感病毒(H5亚型+H9亚型)二价灭活疫苗，为禽流感疫病的防控提供了新的技术。禽流感病毒(H5亚型+H9亚型)二价灭活疫苗长期占据我国禽流感疫苗市场巨大的份额，在我国禽流感疫病的防控过程中起到了重要的直至关重要的作用。采用MDCK细胞进行禽流感病毒(H5亚型+H9亚型)二价灭活疫苗的生产，极大的提高了疫苗的生产工艺。具体表现为无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，并具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0022]本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分t匕，除另有规定外，是指IOOmL溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20°C时容量的比例。
[0023]实施例1重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株的平面贴壁培养
[0024]包括以下步骤:
[0025](I)采用850cm2的转瓶培养MDCK细胞，选择细胞形态良好的单层MDCK细胞作为
病毒培养用细胞。
[0026](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 细胞 3 遍。
[0027](3)用病毒生长液(含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)将重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株稀释至含病毒MOIKT4-1O'
[0028](4)将稀释好的病毒液接种至步骤(2)中清洗后的MDCK细胞中，置于34°C，5%C02中培养2-4天，测定病毒HA效价，加入0.1%甲醛溶液于37°C灭活24小时，收获病毒抗原。
[0029]实施例2重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株的生物反应器悬浮培养
[0030]包括以下步骤:
[0031](I)利用TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:
[0032]TideCell-OlO潮汐式高密度细胞培养系统接种1000OmL适宜浓度的细胞(I X 106-4X 106个细胞/mL)。将细胞培养瓶连接含40000mL细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的胎牛血清，pH值7.2-7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50%-100%、CO2浓度为5%，葡萄糖含量为500-4500mg/L，pH值7.2-7.4，细胞培养温度37 °C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4-6天。
[0033](2)重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株的大规模培养: [0034]将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株MOI为10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培养温度为34°C )，继续培养。
[0035](3)接种后2-4天，测定病毒HA效价，加入终浓度为0.1%的甲醛溶液于37°C灭活24h后，无菌收获病毒抗原。
[0036]实施例3重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株的平面贴壁培养
[0037]包括以下步骤:
[0038](I)采用850cm2的转瓶培养MDCK细胞，选择细胞形态良好的单层MDCK细胞作为
病毒培养用细胞。
[0039](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 细胞 3 遍。
[0040](3)用病毒生长液(含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)将重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株稀释至含病毒MOIKT4-1O'
[0041](4)将稀释好的病毒液接种至步骤(2)中清洗后的MDCK细胞，置34°C，5%C02中培养2-4天，测定病毒HA效价，加入0.1%甲醛溶液于37°C灭活24h，收获病毒抗原。
[0042]实施例4重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株的生物反应器悬浮培养
[0043]包括以下步骤:
[0044](I)利用TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:
[0045]TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统接种1000OmL适宜浓度的细胞(I X 106-4X 106个细胞/mL)。将细胞培养瓶连接含40000mL细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，pH值7.2-7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50%-100%、C02浓度为5%、葡萄糖含量为500-4500mg/L，pH值7.2-7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4~6天。
[0046](2)重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株的大规模培养:
[0047]将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株MOI为10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培养温度为34°C )，继续培养。
[0048](3)接种后2-4天，测定病毒HA效价，加入终浓度为0.1%的甲醛溶液于37°C灭活24h后，无菌收获病毒抗原。
[0049]实施例5重组禽流感病毒H9N2亚型Re_2株的平面贴壁培养[0050]包括以下步骤:
[0051](I)采用850cm2的转瓶培养MDCK细胞，选择细胞形态良好的单层MDCK细胞作为
病毒培养用细胞。
[0052](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 细胞 3 遍。
[0053](3)用病毒生长液(含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)将重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株稀释至含病毒MOIKT5-1O'
[0054](4)将稀释好的病毒液接种至步骤(2)中清洗后的MDCK细胞，置于34°C，5%C02中培养2-4天，测定病毒HA效价，加入0.1%甲醛溶液于37°C灭活24h，收获病毒抗原。
[0055]实施例6重组禽流感病毒H9N2亚型Re_2株的生物反应器悬浮培养
[0056]包括以下步骤:
[0057](I)利用TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:
[0058]TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统接种1000OmL适宜浓度的细胞(I X 106-4X 106个细胞/mL)。将细胞培养瓶连接含40000mL细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，pH值7.2-7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50%-100%、C02浓度为5%，葡萄糖含量为500-4500mg /L，pH值7.2-7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4~6天。
[0059](2)重组禽流感病毒H9N2亚型Re_2株的大规模培养:
[0060]将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株MOI为10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK处理胰酶、0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培养温度为34°C )，继续培养。
[0061](3)接种后2-4天，测定病毒HA效价，加入终浓度为0.1%的甲醛溶液于37°C灭活24h后，无菌收获病毒抗原。
[0062]实施例1-6中禽流感病毒培养结果如表1所示。
[0063]表1禽流感病毒培养结果
~重组禽流感病毒~重组禽流感病毒Η5Ν1 ~重组禽流感病毒~
Η5Ν1亚型Re-4株亚型Re-6株H9N2亚型Re-2株
平面贴壁悬浮培养平面贴壁悬浮培养平面贴壁悬浮培养
[0064]-^1-------
70ml/瓶 50L/次 70ml/瓶 50L/次 70ml/瓶 50L/次
收获S_______
~HA
效价 IOlog2 IOlog2 I Olog2 IO1g2 IOlog2 IO1g2
[0065]实施例7禽流感病毒(H5N1亚型Re_4株+H9N2亚型Re_2株)二价灭活疫苗的免疫试验
[0066]包括以下步骤:
[0067](I)疫苗配制:将46.5份重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株抗原和46.5份重组禽流感病毒H9N2亚型Re-2株抗原混入7份无菌的吐温_80后制成水相；将93份白油、5份司盘-80和2份硬脂酸铝充分混匀至透明后高压灭菌制成油相。取2份油相和1份水相进行乳化(所述份数为质量比重)，分装后制成疫苗。
[0068](2)疫苗免疫:疫苗通过胸部肌肉注射3-4周龄SPF鸡10只，接种剂量为每只鸡
0.3mL。5只鸡不注射作为对照。接种21天后，采血分离血清，用禽流感病毒H5亚型抗原和H9亚型抗原检测HI效价。
[0069]实施例8禽流感病毒(H5N1亚型Re_6株+H9N2亚型Re_2株)二价灭活疫苗的免疫试验
[0070]包括以下步骤:
[0071](I)疫苗配制:将46.5份重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株抗原和46.5份重组禽流感病毒H9N2亚型Re-2株抗原混入7份无菌的吐温_80后制成水相；将93份白油、5份司盘-80和2份硬脂酸铝充分混匀至透明后高压灭菌制成油相。取2份油相和1份水相进行乳化(所述份数为质量比重)，分装后制成疫苗。
[0072](2)疫苗免疫:疫苗通过胸部肌肉注射3-4周龄SPF鸡10只，接种剂量为每只鸡
0.3ml。5只鸡不注射作为对照。接种21天后，采血分离血清，用禽流感病毒H5亚型抗原和H9亚型抗原检测HI效价。
[0073]实施例7和8的疫苗免疫试验结果如表2所示。
[0074]表2疫苗免疫试验结果
【权利要求】
1.采用MDCK细胞系生产禽流感病毒二价灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)MDCK细胞系的传代与培养:MDCK细胞系经胰酶-EDTA消化分散，用细胞生长液稀释成一定浓度后，接种至合适的容器内，待细胞长满后进行传代或接种病毒； (2)病毒接种与繁殖:用病毒生长液分别将H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒进行适当稀释后，分别接种用PBS清洗的MDCK细胞，待MDCK细胞完全病变后，停止培养； (3)病毒液的灭活与收获:向上述细胞培养液中加入甲醛溶液灭活后，分别收获H5亚型禽流感病毒抗原和H9亚型禽流感病毒抗原； (4)配制疫苗:将H5亚型禽流感病毒抗原和H9亚型禽流感病毒抗原混入吐温-80后制成水相，与油相一同乳化，分装后制成成品疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的H5亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株或重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株，H9亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H9N2亚型Re-2株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的MDCK细胞为平面贴壁培养的细胞或采用生物反应器进行悬浮培养的细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的细胞生长液中含有90-95%体积的DMEM液和5-10%体积的胎牛血清，pH值7.0-7.4。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的油相包含白油、司盘-80和硬脂酸铝。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中细胞培养条件为37°C，5%C02。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的病毒生长液为含有5 μ g/mL TPCK处理胰酶和0.2%牛血清白蛋白组分V的DMEM液，pH值7.2-7.4。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中细胞培养条件为34°C，5%C02。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中接种时H5亚型禽流感病毒接种量为Μ0Ι10-4-10Λ Η9亚型禽流感病毒接种量为MOIKT5-1O'
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述甲醛溶液的浓度为0.1%，灭活条件为371:，灭活2411。
【文档编号】A61K39/295GK103536913SQ201310452808
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】王贺民, 黄文强, 周蕾蕾, 张翼, 陈秋阁, 严石, 李浩鹏, 李爱君, 万桂清 申请人:乾元浩生物股份有限公司