一种抗人cd20嵌合单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗人CD20嵌合单克隆抗体，其轻链和重链氨基酸序列及其编码基因、以及该抗体的生产方法和应用。本发明通过改造抗体分子的重链恒定区氨基酸序列，显著提高了抗体的生物活性。
【专利说明】一种抗人CD20嵌合单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种抗人CD20嵌合单克隆抗体、其轻链和重链的编码基因、及其生产方法和应用。
【背景技术】
[0002]⑶20抗原起源于B细胞发育的前B细胞期，存在于正常和癌变的B淋巴细胞表面，而且并不存在于其他细胞，所以CD20本身就提供了治疗B淋巴瘤或白血病的靶标。抗CD20单克隆抗体一旦与CD20特异结合，其Fe部分则与效应细胞(如具有细胞毒性的T细胞、自然杀伤细胞)结合，引起细胞溶解发应，从而导致细胞死亡，即产生所谓的抗体依赖细胞毒性(ADCC)作用。
[0003]抗CD20抗体可用于与B细胞病变(如数量过多、过度活跃、功能障碍等)相关疾病的治疗，主要是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’ s lymphoma, NHL)等B细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫性疾病，以及慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)等白血病。
[0004]众所周知，抗体分子由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，每条链均可分为可变区和恒定区，抗体特异性由重链可变区和轻链可变区构成的抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab)所决定,而抗体杀死祀细胞的活性则需依靠恒定区,特别是重链恒定区。
[0005]目前由IDEC制药公司研发抗⑶20人鼠嵌合抗体Rituximab (中文名美罗华)已获准治疗低级或滤泡的非霍奇金式B淋巴瘤，中度至重度活动性类风湿性关节炎的治疗，滤泡型B细胞NHL的起始治疗和病情稳定、低度恶性的B细胞淋巴瘤，与化疗药氟达拉滨和环磷酰胺(FC)联用治疗CD20阳性的慢性淋巴细胞性白血病、韦格纳氏肉芽肿(WG)和显微镜下多血管炎。而且随着研究的深入，美罗华的适应症还在不断扩大，其市场前景不可限量。
[0006]2012年美罗华单抗全球销售额达65亿美元以上，而全球需求量则在1000公斤以上，扣除纯化等工艺过程损失，实际生产量需达2000公斤以上才能满足市场需求。目前，美罗华等药用抗体制剂主要是利用哺乳动物细胞系表达生产，但哺乳动物细胞生产成本高导致重组单抗市场价格偏高。例如市场上500毫克Rituximab的售价为2840美元，一个疗程(注射四次)约需1.2万美元，对于大多数患者来说都是沉重的经济负担。可见抗体的生产技术已成为整个治疗性抗体产业发展的瓶颈问题。因此,寻求一种能够大规模、低成本、高活性的表达体系来生产单抗药物已成为满足市场紧迫需求的当务之要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种生物活性更高的抗人CD20嵌合单克隆抗体。
[0008]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种抗人CD20嵌合单克隆抗体，其重链多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其轻链多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。下划线部分为抗人CD20嵌合单克隆抗体引导肽。[0009]该抗体与美罗华的区别在于:
[0010]所述抗体共有4个氨基酸序列不同，其中第237位和238位分别为精氨酸Arg(R)和缬氨酸Val (V)，而美罗华分别为赖氨酸Lys (K)和丙氨酸Ala (A);第379位为谷氨酸Glu(E)，而美罗华为天冬氨酸Asp (D);第380位氨基酸为蛋氨酸Met (M)，而美罗华为亮氨酸 Leu (L)0
[0011]本发明还提供了编码所述重链多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；以及编码所述轻链多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述编码重链多肽的基因或编码轻链多肽的基因。
[0013]作为优选，所述表达载体为乳腺特异表达载体。
[0014]更为优选，所述表达载体为pBCl载体。
[0015]本发明还提供了利用所述表达载体获得的多肽。
[0016]本发明还提供了前述抗人⑶20嵌合单克隆抗体的重组表达方法，具体为:将含有编码重链多肽的基因的表达载体和编码轻链多肽的基因的表达载体，转入动物成纤维细胞，检测共整合的转基因阳性细胞为核供体，通过核移植操作技术制备转基因胚胎，移植到动物子宫中妊娠，获得转基因动物，在转基因动物的乳腺中进行所述抗人CD20嵌合单克隆抗体的重组表达。 [0017]作为优选，所述动物为奶牛。
[0018]本发明还提供了前述抗人CD20嵌合单克隆抗体在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断的药物中的应用。
[0019]本发明通过改造抗体分子的重链恒定区氨基酸序列，提高了抗体的生物活性。并通过细胞结合实验和细胞凋亡实验，对本发明所述抗人CD20嵌合单克隆抗体与美罗华抗人CD20抗体进行活性比较。实验表明，本发明所述抗人CD20嵌合单克隆抗体比美罗华抗人CD20抗体表现出更高的生物学活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明重组抗人⑶20抗体Raja细胞结合试验结果；
[0021]其中:rtx2和rtx3为转基因牛奶样；RTX为商业化美罗华作为阳性对照。
[0022]图2为本发明实施例5所述细胞凋亡实验结果；
[0023]其中:rtx2和rtx3为转基因奶样；RTX为商业化美罗华作为阳性对照；NT为空白对照。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0025]实施例1抗体重链和轻链基因合成
[0026]根据SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示氨基酸序列分别设计出抗人⑶20嵌合抗体的重链基因序列和轻链基因序列，如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，该基因序列还可以根据氨基酸密码子简并性进行设计，如重链第237位氨基酸为精氨酸Arg，其密码子不仅对应SEQ ID N0.3中第709-711位的DNA序列为CGA，还可用CGT (密码子为CGU)，CGC,CGG替代。由于基因合成技术的发展，根据SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的基因序列，既可以合成90bp以下的DNA片段，然后进行拼接，也可以直接委托DNA合成公司进行全基因的DNA合成。在合成过程中可在基因两端加入合适的酶切位点，如Xhol，以便连入表达载体中。
[0027]实施例2嵌合抗体的乳腺特异表达载体构建
[0028]动物乳腺已被证明是理想的重组蛋白或单克隆抗体重组表达体系，设计合适的乳腺特异表达载体是动物乳腺生物反应器的关键。可采用商业化乳腺特异表达载体，如PBCl载体(Invitrogen)，也可以根据相关文献表达自行设计乳腺特异表达载体，主要包括乳腺特异表达基因的上游调控区和下游调控区，如中国专利ZL200610076242.4所示。本发明乳腺特异表达载体构建方法如下:将实施例1合成的抗体重链基因序列和轻链基因序列两端分别加入XhoI酶切位点，分别连入经XhoI酶切的pBCl载体上，构建成pBC-⑶20H和PBC-CD20L两个载体。
[0029]实施例3嵌合抗体重组表达
[0030]动物乳腺生物反应器体系能高水平表达重组蛋白或单克隆抗体。本发明将实施例2构建的乳腺特异表达载体pBC-⑶20H和pBC-⑶20L转入奶牛成纤维细胞，以分子检测pBC-⑶20H和pBC-⑶20L共整合的转基因阳性细胞为核供体，通过核移植操作技术制备转基因胚胎，采用非手术法将转基因胚胎移植到母牛子宫中妊娠，所述非手术法步骤如下:将装有转基因胚胎的胚胎移植器通过代孕母牛阴道送达子宫角，将胚胎推注到子宫角，缓慢移出移植器即可，该过程不会对奶牛产生不利影响。代孕牛产犊后对克隆牛进行分子鉴定，以确定其基因组中同时整合了 pBC-⑶20H和pBC-⑶20L基因结构。转基因奶牛性成熟后进行配种产犊后，收集转基因奶牛所产牛奶进行鉴定，牛奶中含有重组抗⑶20单克隆抗体，表达水平为1-5克/升。经氨基酸测序鉴定，所表达的重组抗CD20单克隆抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2—致，表明实施例2所构建的抗体乳腺表达载体适合在动`物乳腺中进行重组抗体的表达生产。
[0031]实施例4嵌合抗体细胞结合实验
[0032]Raji细胞是一种体外培养的淋巴瘤细胞，细胞表面含有CD20抗原分子，被广泛用于抗CD20抗体的细胞结合活性检测。收集两头转基因牛的乳样进行Raji细胞结合活性试验。收集Raji细胞(购自北京协和医科大学基础医学研究所细胞中心)2xl05，加入PBS离心1200rpmx5min，2次(洗去培养基和血清)，冰上与转基因奶样和美罗华抗人⑶20抗体(购自上海罗氏公司)孵育I小时，PBS离心1200rpmx5min，2次(洗去未结合的奶样)，冰上孵育FITC标记的抗人⑶20抗体(购自上海罗氏公司)45min, PBSs离心1200rpmx5min, 2次，用300 μ I PBS重悬细胞，流式检测仪测荧光值x-mean。如图1所示，利用荧光基团FITC负染色实验证明，转基因克隆牛表达的抗人CD20抗体具有特异结合Raji细胞表面抗原CD20的活性，其Raji细胞结合活性随着抗体浓度升高而提高，并且与商业化美罗华活力相近。
[0033]实施例5嵌合抗体细胞凋亡实验
[0034]48孔板接种Raji细胞1x105，分别加入转基因奶样或美罗华抗人⑶20抗体阳性对照，其中抗人⑶20抗体浓度均为IOy g/ml，细胞培养箱中孵育48h，PBS离心1200rpmx5min, 2次,室温用SYTOX? (购自杭州联科生物技术有限公司)染料孵育15min,直接用流式细胞仪检测死亡细胞百分率。伴随凋亡发生的进程，质膜的破裂使正常情况下无法通过完好质膜的核酸染料得以进入细胞，与核酸发生反应。SYTOX?核酸染料是一种高亲和核酸染料，可轻易地渗入质膜受损的细胞内，但不会透过活细胞的胞膜。因此凋亡的细胞越多，荧光值就越大。如图2所示，所检测的两头转基因克隆牛奶样的Raji细胞凋亡率比美罗华高出一倍，表现出更高的生物学活性，表明本发明所提供的抗CD20嵌合抗体可以用于制备杀死肿瘤细胞活性更强的抗B淋巴瘤药物。[0035]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种抗人CD20嵌合单克隆抗体，其特征在于，其重链多肽的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，其轻链多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一种编码权利要求1所述单克隆抗体的重链多肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.一种编码权利要求1所述单克隆抗体的轻链多肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因或权利要求3所述基因。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为乳腺特异表达载体。
6.利用权利要求4或5所述的表达载体获得的多肽。
7.权利要求1所述抗人⑶20嵌合单克隆抗体的重组表达方法，其特征在于，将含有权利要求2所述基因的表达载体，和含有权利要求3所述基因的表达载体，转入动物成纤维细胞，检测共整合的转基因阳性细胞为核供体，通过核移植操作技术制备转基因胚胎，移植到动物子宫中妊娠，获得转基因动物，在转基因动物的乳腺中进行所述抗人CD20嵌合单克隆抗体的重组表达。
8.根据权利要求7所述重组表达方法，其特征在于，所述动物为奶牛。
9.权利要求1所述的抗人CD20嵌合单克隆抗体在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/395GK103524621SQ201310452817
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】汤波, 张然, 李宁 申请人:北京济福霖生物技术有限公司