一种具有微纳米结构的支架制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有微纳米结构的支架制备方法，这种支架是一种同时具有微米和纳米结构的多级梯度结构支架。它是由直径微米级和纳米级的纤维共同培养获得，主要步骤为将直径微米级的纤维与直径纳米级的细菌纤维素共培养一定时间后，获得具有微纳米结构的支架材料。本发明提供的支架材料具有良好的力学性能、吸湿性能和梯度的微纳米多级结构，在微观结构上和宏观性能上更满足组织工程对支架材料的要求。本支架制备方法在常压下可顺利完成，工艺简单，未使用任何有毒药品，安全无毒性。
【专利说明】一种具有微纳米结构的支架制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有微纳米梯度结构的组织工程复合材料支架及其制备方法。
【背景技术】 [0002]组织工程学是近年来迅速发展的一门新兴交叉学科，是材料学、工程学和生命科学共同发展并相互融合的产物，其基本原理为选取捐赠者或病患的种子细胞接种到人工制备合成的具有一定空间结构和力能的支架上培养，经过细胞的增殖生长最终获得具有一定结构和功能的组织和器官。组织工程包括人工细胞外基质-支架、细胞以及信息因子三大要素。支架材料作为组织工程的重要组成部分，是组织工程研究的一个重要内容，它为细胞的黏附、生长、增殖、分化和新组织的形成提供空间支持。通过对人体内细胞外基质(ECM)的分析发现，从结构角度考虑，体内ECM是梯度的纤维结构，它不仅包含微米纤维，同时存在纳米纤维，换言之，体内ECM是纳米和微米的最佳集合体。
[0003]最近几年，木醋杆菌的分泌物-细菌纤维素(BC)因其独特的纳米纤维结构，受到人们的广泛关注，具有成为仿生组织工程支架的潜力。BC具有来源广泛，制备简单，无交叉感染，无免疫反应，力学性能优异，结构与体内ECM存在相似性，自身呈三维网状结构等显著特点。因此，BC众多的优异特点已经使之成为近几年生物材料领域新的研究热点，在骨、软骨和血管组织工程显示出很好的前景。BC其显著特点为纳米纤维结构，但是体内ECM是梯度的纤维结构，是纳米纤维和微米纤维的集合体。因此，为了使BC在组织工程领域具有更广泛的应用，改善其纤维结构，与微米纤维复合，获得具有梯度纤维结构的BC复合材料。基于这一思想，许多研究报道了在BC内部构造微米孔隙的方法及应用情况，经结构改善的BC复合材料支架在支撑细胞生长、增殖以及粘附能力等方面都有显著的提高。
[0004]基于对体内ECM的深入研究以及BC的自身特点，本发明制备了具有微纳米梯度结构的BC支架材料。相比于现有的BC支架材料，该方法可以改善BC的空间结构，同时具有合成效率高、产量大以及性能优势等特点，此外，加入微米纤维没有影响木醋杆菌的分泌生长，保持了支架材料的生物相容性。因此，这种在材料微观结构、力学性能以及生物相容性等方面都具有一定优势的支架材料，可以在组织工程领域具有一定的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是制备一种具有微纳米梯度结构的支架材料用于组织工程领域，其关键技术是将微米纤维置于木醋杆菌的培养基中，采用共培养的方法，将木醋杆菌分泌的BC纳米纤维与培养基中的微米纤维相互缠绕，最终获得微纳米结构的BC /某微米纤维复合材料支架。制备的BC /某微米纤维复合材料支架具有微纳米梯度的微观结构，同时保持BC的多孔纳米网络结构，微米纤维的引入可以在支架内部构造微米孔隙，因此，支架不仅具有微纳米梯度结构，又具有多级孔隙结构。这一支架材料的制备，有利于细胞的粘附、迁移、生长与繁殖，符合组织工程对支架结构仿生的要求，可以更好地应用于组织工程领域。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明一种具有微纳米结构的支架材料的制备予以实现的技术方案是:将灭菌的微米纤维加入木醋杆菌的液体培养基中，采用静态培养或动态培养方式，共培养一定时间，获得具有微纳米结构的支架，其中纳米纤维的重量含量为5% -85%。
[0007] 本发明所述BC的分泌菌种为木醋杆菌(Acetobacter xylinus),木醋杆菌为革兰氏阴性(少数可变)，宽0.6-0.8 μ m，长1.0-4.0ym,淡棕色，呈圆形，以单个、成对或链状存在，不透明，严格好氧，呼吸代谢从不发酵，接触酶阳性，氧化酶阴性，最适生长温度25-300C，最适pH5.4-6.3，常被作为BC研究的标准微生物。本发明中采用的木醋杆菌的液体培养基组成为:每IL去离子水中包含葡萄糖30g，蛋白胨7.5g，酵母粉10g，磷酸氢二钠
7.5g，醋酸调节pH为5左右，然后高温灭菌待用。
[0008]本发明介绍一种具有微纳米结构的细菌纤维素/某微米纤维支架材料的制备方法，其具体过程包括如下步骤:
[0009]I)将1-10克一种或几种微米纤维混合物加入木醋杆菌100-300ml液体培养基，将
上述培养基经高温灭菌处理；
[0010]2)将扩增后的木醋杆菌种子溶液按照5-10%的比例(体积比)接种到I)中所述的培养液中，在25-30°C的恒温培养箱中采用静态培养或者动态培养的方式培养3-10天。
[0011]3)取出2)中共培养得到的物质，分别采用去离子水和质量分数5-10%的氢氧化钠溶液交替煮沸清洗干净，最后用去离子水反复冲洗直至该物质呈现中性，即得微纳米结构BC /某微米纤维复合材料支架。
[0012]本发明首次将一种或几种微米纤维加入木醋杆菌液体培养基中共培养，制备具有微纳米结构的复合材料支架。微米纤维的加入，没有影响木醋杆菌对BC的分泌，保持了 BC的生物相容性，同时引入的微米纤维在支架内部构建了微米孔隙，使支架成为具有微纳米梯度结构和多级孔隙结构，有利于细胞的粘附、迁移和生长，符合组织工程对支架材料结构仿生的要求。
[0013]本发明使用的试剂均安全无毒，保证了制备材料的安全性和生物活性，同时所用原料易得，在安全环境下即可完成支架材料的制备，工艺简单，具备大量生产的条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1实施例1所得样品的扫描电镜照片。
[0015]图2实施例1所得样品中BC的红外光谱图。
[0016]图3实施例2所得样品的扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0018]实施例1:
[0019]将30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氢二钠依次加入IL的去离子水中，充分溶解后用醋酸调节pH值至4.5-6.0范围。
[0020]称量棉纤维10克，加入上述300ml液体培养基中，115°C高温灭菌，保温保压半小时，自然冷却至30°C以下后取出，作为木醋杆菌生长的培养基待用。
[0021]将扩增好的木醋杆菌种子溶液按照10%的接种比例(体积比)，接种到上述培养基中，充分摇动使菌种分布均匀，30°C恒温静态培养7天，得到湿态的BC /棉纤维复合材料支架，用去离子水和质量分数5%的氢氧化钠溶液交替煮沸清洗至乳白色，最终用去离子水清洗至中性。
[0022]将上述中性的乳白色物质采用液氮迅速冷冻，然后用冷冻干燥机冷冻干燥48小时，得到乳白色类似泡沫的支架材料，储藏，备用。
[0023]实施例2:
[0024]将30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氢二钠依次加入IL的去离子水中，充分溶解后用醋酸调节pH值至4.5-6.0范围。
[0025]称量棉纤维8克，加入上述200ml液体培养基中，115°C高温灭菌，保温保压半小时，自然冷却至30°C以下后取出，作为木醋杆菌生长的培养基待用。
[0026]将扩增好的木醋杆菌种子溶液按照8 %的接种比例(体积比)，接种到上述培养基中，充分摇动使菌种分布均匀，30C恒温动态培养5天，得到湿态的BC /棉纤维复合材料支架，取出培养基中悬浮的乳白色物质，用去离子水和质量分数5%的氢氧化钠溶液交替煮沸清洗至乳白色，最终用去离子水清洗至中性。
[0027]将上述中性的乳白色物质_50°C冷冻24小时，然后用冷冻干燥机冷冻干燥48小时，得到乳白色类似泡沫的支架材料，储藏，备用。
[0028]实施例3:
[0029]将30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氢二钠依次加入IL的去离子水中，充分溶解后用醋酸调节pH值至4.5-6.0范围。
[0030]称量麻纤维5克、碳纤维5克，加入300ml液体培养基中，按照实施例1中灭菌处理后，按照10%的比例(体积比)接种木醋杆菌种子溶液于上述培养基中，30°C恒温动态培养7天，采用实施例2中的方法清洗干净。将得到的湿态支架，采用酒精梯度处理(分别置于酒精体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%酒精/水溶液中各30分钟)后，置于烘箱中60°C恒温干燥，得到干燥的支架材料，储藏，备用。
[0031]实施例4:
[0032]称量5克麻纤维、3克棉纤维加入200ml的液体培养基中，按照实施例1中做灭菌处理，按照6%的接种比例(体积比)接种木醋杆菌种子溶液到培养基中，在30°C恒温静态培养5天，得到湿态的BC /麻纤维/棉纤维复合材料支架，用去离子水和质量分数10%的氢氧化钠溶液交替煮沸清洗至乳白色，最终用去离子水清洗至中性。将上述中性的乳白色物质采用液氮迅速冷冻，然后用冷冻干燥机冷冻干燥48小时，得到类似泡沫的支架材料，储减，备用。
【权利要求】
1.一种具有微纳米梯度结构的复合材料支架，其特征为支架本身由直径微米和纳米的纤维共同组成，在以下论述中，直径微米的纤维称为微米纤维，直径纳米的纤维称为纳米纤维，其中纳米纤维的重量含量为5% -85%。
2.权利要求1中所述的复合材料支架，其特征在于所述支架是由微米纤维加入木醋杆菌的培养基中发酵培养获得，木醋杆菌在培养发酵的过程中分泌产生纳米纤维，与加入的微米纤维相混合，形成所述支架。培养后得到的支架需用去离子水和5-10wt%氢氧化钠溶液反复交替冲洗，最终用去离子水清洗直至中性即得。
3.权利要求1中所述的复合材料支架，其特征在于微米纤维为植物纤维、无机纤维或有机纤维中的一种或两种以上的混合物。
4.权利要求1中所述的复合材料支架，其特征在于所述支架在使用过程中可以根据需要选用湿态或干态。
5.—种权利要求1所述的具有微纳米梯度结构的复合材料支架的制备方法，其特征在于经过如下步骤: 1)将1-10克微米纤维加入木醋杆菌100-300ml培养液里，把带有微米纤维的培养液经高温灭菌处理待用。 2)将木醋杆菌菌种接种到I)中所述培养液中，在30°C恒温培养箱中培养3-10天。 3)将2)中共培养得到物质采用去离子水和5-1(^七％氢氧化钠溶液反复交替冲洗干净，最终采用去离子水清洗至中性，即得具有微纳米梯度结构的复合材料支架。
6.权利要求5所述支架的制备步骤，其中步骤2)所述的培养方法可以为静态培养或动态培养。
7.权利要求1中所述的复合材料支架的用途，其特征在于所述支架的应用领域为组织工程支架材料。
【文档编号】A61L27/50GK103638560SQ201310654053
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】王静, 刘娇, 吴宁, 张国利 申请人:天津工业大学