沉默DNMT基因的双链siRNA分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及沉默DNMT基因的双链siRNA分子及其应用，更具体地，本发明针对人肿瘤细胞DNMT基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入肝癌细胞后能明显促进免疫原性相关蛋白的表达。
【专利说明】沉默DNMT基因的双链siRNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及双链siRNA分子及其应用，更具体地，本发明针对人肿瘤细胞DNMT基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入肝癌细胞后能明显促进免疫原性相关蛋白的表达。
【背景技术】
[0002]DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)是催化DNA甲基化修饰的酶。具有催化甲基化功能的DNMTs有3种，分别为DNMTl、DNMT3a及DNMT3b [Plass, C.Cancerepigenomics.Human Molecular Genetics, 2002 ;11:2479-2488]。DNA 甲基化是调控免疫细胞的分化及功能表达。甲基化调节免疫分子和肿瘤抗原的表达与肿瘤的免疫原性和免疫反应性有明确的关系，因此，合理的去甲基化是克服免疫耐受和免疫逃逸的有效手段[Teitella, M., et al.DNA methylation in immune system.Clinical immunology, 2003 ；109:2-5]。
[0003]癌/睾丸抗原(cancer / testis antigen, CTA)是一种肿瘤相关抗原，目前已确定19个CTA家族的基因产物，均具有较强的免疫原性(如CT10(cancer / testislO)，有多个HLA-1 (human leukocyte antigen) I类抗原限制的免疫表位,体内外实验证实能够诱导功能性的淋巴细胞毒性反应，促进肿瘤的消退，在HCC患者的肝癌组织中，CTA表达非常高[Zhao L, et al.Progress and prospects in hepatocellular carcinoma surgery.Ann Chir, 1988 ；52:558-563]，因此针对CTA的抗肿瘤免疫治疗符合肝癌及其其他肿瘤病人进行免疫的理想选择[Chen YT., et al.A testicular antigen aberrant lye expressedin human cancers detected by autologous antibody screening.Proc Natl Acard SciUSA, 1997 ；94:1914-1918Korangy F., et al.Spontaneous tumor-specific humoral andcellular immune responses to `NY-ES0-1 in Hepatocellular carcinoma.Clin CancerRes, 2004；10:4332-43410h BK., et al.DNA me thyItransferase expression and DNAmethylation in human hepatocellular carcinoma and their clinicopathologicalcorrelation]。虽然已有报道称，CTA和HLA基因的表达均受甲基化调控，通过抑制DNMT，可促进其表达[Guo ZS., et al.De novo induction of a Cancer / Testis Antigenby5_Aza-2’-Deoxycytidine Augments Adoptive Immunotherapy in a Murine TumorMode.Cancer Res.，2006 ；66:1105-1113]。但是在肝癌细胞中CTA,HLA是否受甲基化调控还不太清楚。
[0004]近来研究已经表明，在哺乳动物中小干扰RNA RNA(SiRNA)能通过对生物学上保守结构的RNA进行干扰，从而抑制靶基因表达。RNA干扰作用(RNAi)技术被认为是一种最有效特异性下调祀基因表达的方法之一 [Noor1-Daloii MR., et al.Use of siRNA in knockingdown of dopamine receptors, a possible therapeutic option in neuropsychiatricdisorders.Molecular biology reports2012 ;39:2003-2010]。干扰小 RNA (siRNA)是 RNA干扰作用(RNAi)赖以发生的重要中间效应分子。siRNA是一类长约21~25个核苷酸(nt)的特殊双链RNA (dsRNA)分子，具有特征性结构，即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5’端磷酸和3’端羟基。siRNA可作为一种特殊引物，RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA。新生的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，呈现基因沉默现象。
[0005]为了探究肝癌细胞中CTA和HLA基因表达是否受甲基化的调控，我们利用siRNA干扰技术，沉默DNMT基因，检测CTA和HLA在肝癌细胞中的表达情况，从而为恢复肝癌细胞的免疫原性提供新的治疗手段。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于公开一种高效的针对DNMT基因的广谱小分子干扰RNA(siRNA),序列如下:
[0007]siRNAl:
[0008]正义链:5’-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’ (SEQ ID NO:1)，
[0009]反义链:5’-UUUCAGUGCGCGUUCCMGAtt-3’(SEQ ID NO:2)。
[0010]本发明的另一目的在于公开一种双链siRNA分子组合物，该组合物包括上述siRNAl,还包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中siRNA2包括正义链和反义链，siRNA2正义链的序列为:5’-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’ (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反义链的序列为:5’-UAUUAGCGAAGAACAU CUGtt-3’(SEQ ID NO:4);其中 siRNA3 包括正义链和反义链，siRNA3正义链的序列为:5’-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’ (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反义链的序列为:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’ (SEQ ID NO:6)。
[0011]本发明提供了双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备降低细胞DNMT基因表达试剂中的应用，优选地，DNMT是DNMT1、DNMT3a或DNMT3b。
[0012]本发明提供了双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备促进细胞CTA蛋白表达试剂中的应用，优选地，CTA蛋白是CT10。
[0013]本发明提供了双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备促进细胞HLA-1类蛋白表达试剂中的应用，优选地，HLA-1类蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
[0014]优选地，本发明使用的细胞是肿瘤细胞。
[0015]体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与DNMT基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后的翻译过程，进而促进DNMT蛋白调控的CTA和HLA蛋白的表达，增强免疫细胞的毒性反应，诱导肿瘤细胞的消退，达到治疗肿瘤的目的。
[0016]本发明的有益效果是:本发明的siRNA分子可以应用于制备调节细胞中DNMT基因的药物中发挥RNA干扰的作用，增强免疫细胞的毒性反应，诱导肿瘤细胞消退，达到治疗肿瘤的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1显示了化学合成的siRNA对DNMT基因沉默效果的检测结果，其中
[0018]图1a显示了利用QPCR检测siRNA对DNMT基因的沉默效果，
[0019]图1b显示了利用免疫印迹检测siRNA对DNMT基因的沉默效果，[0020]图2显示了利用免疫印迹检测化学合成的siRNA对CTA基因表达的影响，
[0021]图3显示了化学合成的siRNA对HLA基因表达的影响，其中
[0022]图3a显示了利用QPCR检测siRNA对HLA基因表达的影响，
[0023]图3b显示了利用免疫印迹检测siRNA对HLA基因表达的影响，
【具体实施方式】
[0024]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025]实施例1:化学合成的siRNA对DNMT基因沉默效果的检测实验
[0026]1.主要仪器、试剂和材料.[0027]1.1仪器:PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad);细胞培养箱(Thermo)，凝胶成像仪(Alpha Innothech)等。
[0028]1.2材料和试剂:mRNA提取纯化试剂盒(QIAGEN)，脂质体2000转染试剂(Invitrogen), DMEM 培养基(Gibco), Oligo (dT) (Promega), M-MLV(Promega), Tap 酶(Takara)等。
[0029]2.合成 siRNA
[0030]在Genebank 中找到 DNMTl，DNMT3a, DNMT3b 的基因序列(NO:NM-001379, NO:NM-175629, NO:NM_006892)。由上海基凯生物公司设计及化学合成，每个基因设计一对siRNA序列，2.0OD (5nmol) *2只，并有阳性对照β-actin的干扰序列和阴性对照，如下:
[0031]siRNAl:
[0032]正义链:5，-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’(SEQ ID NO:1)，
[0033]反义链:5’-UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3’(SEQ ID NO:2)。
[0034]siRNA2:
[0035]正义链:5，-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’(SEQ ID NO:3)，
[0036]反义链:5，-UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3’(SEQ ID NO:4)。
[0037]siRNA3:
[0038]正义链:5，-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’(SEQ ID NO:5)，
[0039]反义链:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’(SEQ ID NO:6)。
[0040]β -actin siRNA:
[0041 ]正义链:5’ -ACCAGGUGCUACGCUCAGAAAtt-3 ’，
[0042]反义链:5’-UCUGACUACUGUGAG⑶CUtt-3，。
[0043]阴性对照(NC-siRNA)
[0044]正义链:5’-UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3，，
[0045]反义链:5’-UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3 ’。
[0046]3.沉默效率验证
[0047]3.1细胞培养:肝癌细胞H印G2在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5 % CO2培
养箱培养。
[0048]3.2细胞铺板并转染:将细胞按IXlO4 /孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为未转染组、阴性对照组和实验组(80nM)，其中阴性对照组siRNA为通用对照siRNA，即NC-siRNA，与DNMT基因的序列无同源性，浓度为SOnM /孔。同时分别转染。
[0049]3.3RT-PCR检测DNMT基因mRNA水平:用mRNA提取纯化试剂盒(TurboCapturemRNA kit)提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μ L无RNA酶水/孔溶解RNA，取 2 μ gRNA加入 0.6 μ LOligo (dT)，无菌DEPC水补充体积至 20 μ L, 70°C变性 IOmin。迅速插入冰冷至少5min ;冰上操作，加入以下试剂:6.Ομ L5*buffer,5.Ομ L2.5μΜ dNTPs,l.0yL RNasin (40U / μ L)和 1.0 μ L M-MLV，混匀后，短暂离心，37°C 孵育 lh，70°C 15min 中止反应，用基因特异性引物检测样本中DNMT mRNA表达水平，同时扩增看家基因β-actin作为内参对照(引物序列如表1所示)。每个反应做3个平行。建立如下25yL反应体系:1“14莫板。0嫩，0.54 1^ Tap E，各I μ L5’正反向引物(0.5 μ M)，2.5 μ L10*反应缓冲液，
2.5μ L dNTP(0.2mM)，用无RNA酶水补足体系至25yL。反应条件:95°C预变性lOmin，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，循环36次，充分延伸72°C IOmin0同等体积的各PCR样品进行琼脂糖胶电泳(胶浓度:1% )。其中DNMT基因的
[0050]结果分析--从RT-PCR电泳结果来看:经过RNA干扰的H印G2细胞，在相应的组内，均有所降低，未处理组和模拟对照组的DNMT变化无明显差异，数据未显示。
[0051]3.4荧光实时定量PCR(QPCR)检测DNMT基因mRNA水平:用基因特异性引物检测样本中DNMT mRNA表达水平(引物序列如表1所示)，同时扩增看家基因β -actin作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系:1.0 μ L模板eDNA，各I μ L5’正反向引物(0.5yM)，1.0yL20XEver Green 1,0.5μ L Hotstar TapE(5U / μ L)，用无RNA酶水补足体系至25 μ L。反应条件:40°C反转录30min，95°C预变性5min，94°C变性20s，60°C退火45s，72。。延伸45s，循环40次，充分延伸72°C IOmin0
[0052]结果分析:以β-actin内参，用实时定量PCR2_""et法确定DNMT mRNA表达量，并作出柱状图，结果见图la。如图所示，纵坐标表示DNMT相对于β-actin的mRNA表达水平；横坐标表示3个处理实验组，其中“模拟转染组”表示转染浓度80nM NC-siRNA的阴性对照，其他两组为siRNAl转染实验组，“siRNAl”表示单独转染一种DNMT干扰RNA实验组，“siRNAl+2+3”表示共转染三种DNMT干扰RNA实验组，结果显示本发明的siRNA对DNMT基因的沉默效果明显。
[0053]3.5免疫印迹(western blot)检测DNMT基因蛋白表达水平:按照3.2的方法转染细胞后72小时，用细胞裂解液(150mM氯化钠+1 % NP-40 (去垢剂)+0.1 % SDS (去垢剂)+2yg/ ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)+2μ g / ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)或ImM PMSF(蛋白酶抑制剂)+1.5mM EDTA(蛋白酶抑制剂 )+ImMNaVanadate (磷酸脂酶抑制剂))收集细胞，用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白浓度的测定，各实验组取50 μ g蛋白进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入DNMTl抗体、DNMT3a抗体、DNMT3b抗体进行检测，以管家蛋白Tubulin为内参，观察DNMT蛋白的表达情况。
[0054]结果分析:使用western blot的方法检测各实验组DNMT的表达水平，DNMTl为一 190kDa的双带，与抗体说明书的描述一致，在有DNMTl干扰的组中均有明显降低，尤其在DNMTl+3a+3b组中降低的幅度更明显；在模拟转染组中则无降低。DNMT3a和DNMT3b的表达情况与DNMTl类似，在有DNMT干扰的组中，无相应的条带，说明本发明设计的DNMT干扰RNA能明显的降低DNMT蛋白的表达水平，三种DNMT干扰RNA混合效果更明显(图1b)。
[0055]实施例2 =DNMT基因沉默对CTA基因表达的影响
[0056]1.RT-PCR检测CTA基因转录水平的变化
[0057]1.1主要仪器、试剂和耗材同实施例1
[0058]1.2RT-PCR实验步骤同实施例1 (相应的引物序列见表1)
[0059]结果分析:在H印G2细胞中，使用脂质体SiNRA干扰DNMT基因后，可见CTlO和SSXl两个基因在SiRNAl组和混合干扰组(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表达，在为未处理组和模拟转染组则无相应条带(数据未显示)。MAGE-1和MAGE-3在各组中均无明显变化。NY-ES0-1也无明显变化，其余三种CTA、CTpll、SCPl和SSX4未检测到表达(数据未显示)O
[0060]1.3荧光实时定量PCR(QPCR)实验步骤同实施例1 (相应的引物序列见表1)
[0061]结果分析:QPCR检测显示，MAGEl无明显变化。CTlO和SSXl的再表达趋势明显(数据未显示)。
[0062]2.Western blot检测CTA基因蛋白表达水平的变化
[0063]Westernblot的步骤同实施例1，利用抗体为CTA蛋白中的CTlO蛋白抗体。
[0064]结果分析:CT10蛋白的表达和RT-PCR的结果一致，在siRNAl组有明显的再表达，在混合干扰组(siRNAl+2+3)表达的效果更明显(图2)。
[0065]上述结果表明，siRNAl组`促进了 CTA分子中的CTlO蛋白和SSXl的表达，混合干扰组(siRNAl+2+3)效果更明显。
[0066]实施例3 =DNMT基因沉默对HLA基因表达的影响
[0067]1.RT-PCR检测HLA基因转录水平的变化
[0068]1.1主要仪器、试剂和耗材同实施例1
[0069]1.2RT-PCR实验步骤同实施例1 (相应的引物序列见表1)
[0070]结果分析:在H印G2细胞中，使用脂质体siNRA干扰DNMT基因后，可见HLA-1类分子中的HLA-A、HLA-B、HLA-C基因在siRNAl组和混合干扰组(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表达，HLA-1I类分子和CIITA基因均无条带，数据未显示。
[0071]1.3荧光实时定量PCR(QPCR)实验步骤同实施例1 (相应的引物序列见表1)
[0072]结果分析:以模拟转染组三种HLA-1类分子的相对表达为I。在siRNAl组和混合干扰组(siRNAl+2+3)中，HLA-A的相对表达度分别为5和8 ；HLA-B的相对表达度分别为
2.5和6 ；HLA-C的相对表达度分别为30和45 (图3a)。
[0073]2.Western blot检测HLA基因蛋白表达水平的变化
[0074]Western blot的步骤同实施例1，利用抗体为HLA-1类蛋白抗体。
[0075]结果分析=HLA-1类蛋白的表达和RT-PCR的结果一致，在siRNAl组有明显的再表达，在混合干扰组(siRNAl+2+3)再表达的效果更明显(图3b)。
[0076]上述结果表明，siRNAl组促进了 HLA-1类分子表达，混合干扰组(siRNAl+2+3)效果更明显。
[0077]实施例4 =CTA和HLA的启动子甲基化状态的检测
[0078]1.仪器:PCR 仪(ABI 公司)，凝胶成像仪(Alpha Innothech)[0079]2.材料和试剂:DNA提取试剂盒(QIAGEN)，纯化柱(Promega)，Tap酶(Takara)等。
[0080]3.实验步骤
[0081]3.1DNA提取:利用DNA提取试剂盒(QIAGEN)按照说明书上的步骤提取细胞总DNA。
[0082]3.2DNA修饰:取1-10 μ gDNA,溶解于18 μ L无菌水中，95°C水浴变性20min，冰浴；加入3M氢氧化钠2 μ L (混匀，脉冲离心)，42°C水浴变性20min，配制5M亚硫酸氢钠处理液(每份样品0.5ml,以配制4mI为例):取1.9g亚硫酸氢钠加入2.5ml无菌水中，加入2M氢氧化钠0.7ml，加入IM对苯二酚(IlOmg / ml) 0.5ml，50°C水浴，反复倒置直至完全溶解；向上述20 μ L DNA变性液加入新鲜配制的5Μ亚硫酸氢钠处理液380 μ L (混匀，脉冲离心)；加入200 μ L石蜡油以防蒸发，50°C水浴12-16h ；
[0083]3.3DNA纯化除盐:安装DNA纯化柱，标记；将上述处理的样本加入纯化柱(Promega)内，真空抽吸；加入80%异丙醇洗漆二次；12000rpm离心,去除残留液体；将0嫩洗脱到50 μ L无菌水中(801:7欠，801:温浴51^11，离心)；加入3Μ氢氧化钠lyL，37°C水浴15min ;加入5M醋酸铵166 μ L ;加入2.5倍体积的无水乙醇，_70°C沉淀0.5_lh ； 1000Orpm离心20min，弃上清；70%乙醇200 μ L洗沉淀，离心20min，弃上清；将DNA溶解于30-50 μ LTE缓冲液中，-20°C保存。
[0084]3.4甲基化PCR反应
[0085]3.4.1引物设计=HLA-1类分子的甲基化引物序列参照Nie等[Nie Y.，et al.DNAhypermethylation is a mechanism for loss of expression of HLA CTAss I genes inhuman esophageal squamous cell carcinomas.Carcinogenesis,2001 ;22:1615-1623]的文献的引物和反应体系。MAGE引物序列参考Honda等[HondaT.，et al.Demethylationof MAGE promotors during gastric cancer progression.British Journal ofcancer, 2004 ；90:838-843]文献。CTlO 的甲基化引物自行设计，从 www.genecards.0rg 网站下载CTlO基因的第一外显子前1000bp序列以及第一外显子本身共计1190bp ;进入www.methprimer.com,,复制这段序列,选择MSP引物，即在线输出5对甲基化和非甲基化引物。选择第一对甲基化和非甲基化引物进行实验(引物序列见表2所示)。
[0086]3.4.2配制反应体系
[0087]向200yL PCR管中加 入以下成分，并混匀。
[0088]
【权利要求】
1.一种双链SiRNA分子，其特征在于，具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成:
正义链:5’-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’ (SEQ ID NO:1),
反义链:5’ -UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.一种双链SiRNA分子组合物，其特征在于，所述的组合物包含权利要求1所述的SiRNA0
3.权利要求2所述的siRNA分子组合物，其特征在于，所述的siRNA分子组合物还包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中所述的siRNA2包括正义链和反义链，siRNA2正义链的序列为:5’ -CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’ (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反义链的序列为:5’ -UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3’ (SEQ ID NO:4);其中所述的 siRNA3 包括正义链和反义链，siRNA3 正义链的序列为:5’ -GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’ (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反义链的序列为:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’ (SEQ ID NO:6)。
4.权利要求1-3中任意一项所述的双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备降低细胞DNMT基因表达试剂中的应用。
5.权利要求1-3中任意一项所述的双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备促进细胞CTA蛋白表达试剂中的应用。
6.权利要求1-3中任意一项所述的双链siRNA或双链siRNA分子组合物在制备促进细胞HLA-1类蛋白表达试剂中的应用。
7.权利要求4中所 述的应用，其特征在于，所述DNMT是DNMTl、DNMT3a或DNMT3b。
8.权利要求5中所述的应用，其特征在于，所述CTA蛋白是CT10。
9.权利要求6中所述的应用，其特征在于，所述HLA-1类蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
10.权利要求2至5中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。
【文档编号】A61K48/00GK103757021SQ201410021188
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】肖文华, 董伟伟 申请人:肖文华