H9n2亚型禽流感与鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒的制作方法

H9n2亚型禽流感与鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒的制作方法
【专利摘要】本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE-HA9的构建。本发明的构建方法是：在鸭肠炎病毒人工染色体的质粒pBAC-C-KCE中插入H9N2亚型禽流感病毒ha基因的片段，该质粒的基因结构组成如图15所示。将表达H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE-HA9的大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M2013740。
CCTCC NO：M2013377
2013.08.20

CCTCC NO：M2013740
2013.12.31

CCTCC NO：V201404
2014.01.02

CCTCC NO：V201403
2014.01.02

CCTCC NO：M2013378
2013.08.20
【专利说明】H9N2亚型禽流感与鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒

【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠 炎病毒细菌人工染色体质粒及构建。

【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肠炎（Duck Virus Enteritis, DEV)又名鸭瘟（Duck Plague, DP)，是由鸭 肠炎病毒（Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、接触性传 染病，各年龄的禽类均可发病。鸭病毒性肠炎在很多国家都有该病的报道，在我国也广泛流 行。由于其传播迅速，发病和死亡率高，达50-100%，成鸭甚至在90%以上，已经成为危害养 鸭业的主要疫病之一。近几年，陆续有关于鸭肠炎病毒基因组的研究报道；2009年，鸭肠炎 病毒基因组序列已经公布并登陆在Genbank(Li Y et al.，2009)，为研究DEV的基因和蛋白 功能提供了有力的参考数据。其基因组大小约为150kb，编码78个蛋白质，其中有67个蛋 白与α-疱疫病毒有同源性，1个蛋白与γ-疱疫病毒同源，5个与禽疱疫病毒同源。将疱 疹病毒的整个基因组克隆到BAC质粒中，然后在细菌中重组其他病毒的具有免疫源性的外 源基因，从而构建二价疫苗。
[0003] 对于疱疹病毒这样的大基因组病毒（大于lOOkb)，体外操作的难度很大，常规 的体外酶切和连接的方法不适合。构建重组病毒的经典方法是将带有目的基因的转移 载体与病毒基因组共转染哺乳动物细胞，经细胞内同源重组获得重组病毒。由于存在野 生型病毒的干扰，一般需要经过多轮空斑纯化才能筛选得到纯的重组病毒（Domi A et al.，2005;Horsburgh B C et al.，1999)，这是一项极为繁琐的工作，有时还会遇到重组病 毒传代不稳定的问题。为了克服这种方法的局限，研究人员尝试在大肠杆菌中直接对病毒 基因组进行修饰。首先尝试的是大肠杆菌Cosmid载体。由于病毒基因很大，而此载体容量 有限(约40kb)，必须将病毒基因组分成几段，构成一套重叠的载体，经细胞内的多次同源重 组组装成完整的病毒基因组，产生重组毒。Cosmid载体在大肠杆菌中不稳定，共转染的效率 低，此外，这些载体在细胞内要经过多次同源重组，其精确性很难保证，发生缺失突变的较 高，因而对分离到的重组病毒尚需进一步分析鉴定，不是一种很好的方法。
[0004] 在基因组学研究工作的需要下，研究人员开发了一系列适用于大片段克隆的载体 和宿主系统，如酵母人工染色体载体（YAC)、大肠杆菌的F因子衍生的细菌人工染色体载 体（BAC)和以噬菌体复制子为基础的载体（PAC)。BAC载体可以克隆大至300kb的片段， 而且可以在大肠杆菌中稳定的复制（McGeoch D J et al.，1994)。近年来，一系列大的双 链病毒基因组陆续被 BAC 化（Adler H et al.，2000;Borst E M et al.，1999;Azab W et al.，2002; Smith B N et al.，2000)。这些BAC化的病毒基因组转染细胞后，在细胞中能产 生感染性病毒粒子，这使得利用细菌的遗传工具操作病毒成为可能。但是，由于某些未知 原因，位于基因组中BAC载体部分不太稳定，BAC化的病毒基因组转染细胞后，载体及其两 侧病毒基因组序列会发生不同程度的缺失。为了解决这个问题，BAC载体两侧各引入了一 个IoxP位点,该载体转入表达Cre重组酶的动物细胞中,Cre酶会催化在两个位点之间的 重组反应，从而使原核来源的载体骨架部分从病毒基因组上去除，仅留下34bp的IoxP的序 列，保证了基因组的保真性和完整性，尽可能的避免了原核来源对插入位置邻近的病毒基 因表达的影响，这样利用BAC克隆的细菌遗传工具操作大基因组病毒更趋完善，该方法成 功的用于伪狂犬病毒的BAC克隆（Smith G A et al.，2000)。同源重组和位点特异性重组 是广泛被用于修饰BAC克隆的方法。RecA同源重组系统是最早为人们熟知的大肠杆菌同源 重组系统。然而，由RecA介导的同源重组所需同源区长达IOOObp左右，操作的难度大，相 对耗时费力，从而使其应用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重组系统可以催化同源 反应在20_25bp的同源区间发生，同源重组效率较高（Muyrers J P et al.，2000;Muyrers J P et al·，2000a)。Red-gam 系统与 RecE/RecT 类似，且重组效率更高（Muyrers J P et al.，2000b;Jamsai D et al.，2003)。至此，人们把这两种重组技术结合起来（Red/ET)实 现了直接以PCR产物作为供体分子对目的序列的打靶修饰，可以有效地对BAC克隆上的任 意基因进行点突变、插入和缺失等修饰。位点特异性重组是由位点特异性重组酶介导特定 位点间的发生位点特异性重组。通用的系统有Pl噬菌体的Cre-IoxP系统（Smith G A et al·，2000)，入噬菌体的 Int-att 系统（Suzuki Y et al·，2005)，和酵母的 Flp-FRT 系统 (Cherepanov P P et al·，1995)。位点特异性重组技术祀向性强、重组效率高，也是修饰 BAC克隆的有效工具。这整个过程都是在细菌体内进行的，在很大程度上能避免了离体操作 对大分子的损伤。2005年，Li M Z et al.开发了一个有效的方法，用于同源重组方法在体 内构建重组DNA分子一交配辅助遗传整合克隆（MAGIC) (Li M Z et al.，2005)。
[0005]禽流感（Avian influenza, Al)是由 A型流感病毒（Avian influenza virus, AIV) 引起的病毒性烈性传染病，是目前危害世界及我国养禽业最重要的疫病之一。禽流感 (Avian influenza，Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种急性传染病，又称真性鸡 瘟或欧洲鸡瘟。1878年该病首次在意大利出现并不断蔓延；2003年末至2004年初又在亚 洲地区发生大规模流行：而1997年和2004年分别发生在香港和越南的禽流感，突破了种 间障碍直接感染人并引起死亡。近年来禽流感频繁爆发，给世界养禽业造成毁灭性打击。仅 东南亚国家因销毁感染家禽的损失就超过1000亿美元，我国销毁家禽数千万羽，损失达几 百亿元。2005年爆发于青海湖的高致病性禽流感，已经严重威胁到野生迁徙鸟类的安全，并 迅速传遍了欧洲，造成了巨大的危害。H5N1禽流感病毒造成全球553人感染，323人死亡， 死亡率达58. 4%，我国40人感染，26人死亡。高致病性禽流感已突破种间屏障可直接传染 给人，严重危害着人类健康。H9亚型禽流感病毒最早由Hommee and Easterday(1970)从火 鸡体内分离到。1994年，陈伯伦等从病蛋鸡体内分离到H9亚型AIV。此后，H9亚型AIV在 我国广泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势。至1997年，H9亚型AIV广泛分布 于各大洲。韩国、爱尔兰、意大利等国都有H9禽流感暴发的报道，说明其已在家禽中建立 了稳定的种系。1998年从香港的家猪体内分离到2株H9亚型流感病毒，这是首次从哺乳动 物体内分离到H9亚型流感病毒。1999从香港患流感的女孩体内分离到两株H9流感病毒， 对这两株病毒的分析表明其所有的基因片段与AIV-A/Quail/Hong Kong/Gl/97(H9)高度同 源，是典型的禽源流感病毒，该毒株是香港人感染H5N1和H9亚型密切相关的分支代表株。 2000-2001年，对中国南方地区的水禽（主要是家鸭）进行流感病毒监测发现约10%水禽 被H9感染，感染率是20世纪70年代的4倍。尽管还没有充分的证据表明H9亚型流感病 毒能在人与人之间传播，但其已经成为目前严重危害人类健康的重要传染病之一。
[0006] 当前，疫苗免疫接种可能是防止禽流感疫情和鸭病毒性肠炎大范围流行的最经济 的方法。但是采用传统方法构建H5与H9亚型禽流感疫苗株的操作比较困难，利用细菌人 工染色体技术等基因操作手段，构建含有流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗， 为禽类疫苗的研制提供了新的技术手段。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠 炎病毒细菌人工染色体质粒的构建。首先我们构建得到鸭肠炎病毒细菌人工染色体的质 粒，即鸭肠炎病毒（DEV)疫苗株（C-KCE)的细菌人工染色体质粒，在此基础上提供一种表达 H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE-HA9的构 建。本发明利用大肠杆(例如DH10B)以及鸡胚成纤维细胞（CEF细胞)重新快速拯救出DEV。 进一步地，本发明利用质粒pRTHGAl，插入H9N2亚型禽流感病毒ha基因，利用交配辅助遗传 整合克隆（即MAGIC方法）重组，即可获得含有H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎 病毒细菌人工染色体质粒PBAC-C-KCE-HA9。
[0008] 实现本发明的主要技术方案和步骤如下所述：
[0009] (1)将鸭肠炎病毒（C-KCE)的全基因组（GenBank ID:KF263690)通过同源重组的 方法插入到BAC质粒上得到一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE。含有该质粒 的大肠杆菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE，Escherichia coli DH10B-1S2/BAC-C-KCE，于 2013 年 8 月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M2013377 ；
[0010] (2)将质粒PRThGA改造为pRTHGAl，即在pRTHGAl质粒上分别插入H5N1亚型禽流 感病毒 ha 基因 （temporary GenBank accession NO:KJ003987)和 H9N2 亚型禽流感病毒 ha 基因 （GenBank ID:DQ465400. 1)得到重组质粒pRTHGA-HA5 (其结构如图11所示)和重组质 粒PRTHGA-HA9 (其结构如图12所示）；
[0011] (3)运用MAGIC的方法分别将质粒PRTHGA-HA5和PRTHGA-HA9中的禽流感病毒 ha基因快速稳定的插入鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE中，从而得到含有 禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA5和pBAC-C-KCE-HA9 (其中PBAC-C-KCE-HA5质粒的结构见图16所示，其核苷酸序列全长为169, 784bp ; PBAC-C-KCE-HA9质粒的结构见图17,其核苷酸序列全长为169,766bp)。含有重组质粒 PBAC-C-KCE-HA5 的大肠杆菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA，Escherichia coli DHlOB-IS2/ BAC-C-KCE-HA，于2013年8月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中 心保藏，保藏编号为CCTCC N0:M2013378。含有重组质粒pBAC-C-KCE-HA9的大肠杆菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9, Escherichia coli DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9,于 2013 年 12 月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M2013740。
[0012] (4)分别将重组质粒 pBAC-C-KCE-HA5 和 pBAC-C-KCE-HA9 转染 CEF 细胞剔除 BAC 骨架后，即可分别获得表达H5N1亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗株 rDEV-HA5 (于2014年1月2日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为CCTCC NO :V201404)和表达H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载 体疫苗株rDEV-HA9 (于2014年1月2日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏 中心保藏，保藏号为CCTCC NO :V201403)。
[0013] (5)利用步骤（4)所得的疫苗株分别制备H5N1亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载 体疫苗和H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗。
[0014] 本发明制备的H5N1亚型和H9N2亚型禽流感病毒的重组的鸭肠炎病毒活载体疫苗 可以用在控制鸭群中H5N1亚型和H9N2亚型禽流感和鸭病毒性肠炎上，可以有效的控制鸭 群中H5N1亚型和H9N2亚型禽流感和鸭病毒性肠炎的问题。
[0015] 更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] 1、利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体大大缩短了获得重组病毒的周期。
[0018] 2、本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体重组外源基因后对载体进行了剔除，无 功能性外源序列插入，对基因组亦无影响，不存在遗传物质发生跨物种转移的可能。
[0019] 3、利用本发明中的重组病毒疫苗rDEV-HA5和rDEV-HA9可以达到同时预防鸭病毒 性肠炎和H5亚型流感或H9亚型流感的效果。由此类推，利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌 人工染色体重组外源基因可以达到一针同时防两病甚至多种疾病的目的。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 序列表SEQ ID NO :1是重组质粒pBlue-UL26-UL27的核苷酸序列，长度12545bp， 其中下划线标记的序列分别为限制性内切酶SalI、PacI、NotI的核苷酸序列。其中，1-6401 位碱基是PBlue-lox载体的部分核苷酸序列，长度为6401bp ;6394-6401位碱基是限制性 内切酶NotI的核苷酸序列，长度为8bp ;6402-6435位碱基是LoxP的部分核苷酸序列，长 度为34bp ;6436-7679位碱基是UL26的核苷酸序列，长度为1244bp，7680-7687位碱基是 限制性内切酶PacI的核苷酸序列，长度为8bp ;7688-9519位碱基是amp复制子的核苷酸 序列，长度为1832bp ;9520-9527位碱基是限制性内切酶PacI的核苷酸序列，长度为8bp ; 9528-10694为碱基是UL27的核苷酸序列，长度为1167bp ; 10695-12503位碱基是红色荧光 基因的核苷酸序列，长度为1809bp ;12504-12511位碱基是限制性内切酶Sail的核苷酸序 列，长度为8bp ;12512-12545位碱基是LoxP的部分核苷酸序列，长度为34bp。
[0021] 序列表 SEQ ID NO :2 是质粒 pCAGGS 的 chicken β-actin promotor 和 rabbit β-globin ployA的表达框和同源臂的核苷酸序列，长度为2380bp。
[0022] 序列表SEQ ID N0:3是Loxp序列，长度为644bp，从第485-518bp是切除BAC骨 架后仅留下一个34bpLoxp位点的序列。
[0023] 序列表SEQ ID NO :4是序列表SEQ ID NO :3中切除BAC骨架后仅留下一个Loxp 位点的序列，序列长度为34bp。
[0024] 序列表SEQ ID NO :5是pRTHGAl的序列，序列长度为4263bp，斜线部分分别为限 制性内切酶位点Small和Xhol。其中，在酶切位点Small和XhoI之间插入禽流感病毒毒 株A/Duck/Hubei/xn/2007 (H5N1)的HA序列（核苷酸长度为1704bp)即可得到重组质粒 PRTHGA-HA5 (核苷酸序列长度为5961bp);在酶切位点Small和XhoI之间插入禽流感病毒 毒株A/Duck/HuBei/Wl/2004(H9N2)的HA序列（核苷酸长度为1685bp)即可得到重组质粒 PRTHGA-HA5 (核苷酸序列长度为5943bp)。
[0025] 图I :是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26的构建流程图。
[0026] 图2:是本发明的构建转移载体pBlue-UL27-UL26过程中pcDNA3. 1+质粒示意图。
[0027] 图3 :是本发明的转移载体pBlue-UL27_UL26的基因结构组成示意图。
[0028] 图4 :是本发明的构建转移载体pBlue-UL27_UL26过程中载体pBlue-lox示意图。 图中的CMV Promoter是CMV启动子。
[0029] 图5 :是本发明的转移载体pBlue-UL27_UL26质粒示意图。
[0030] 图6 :是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡的成纤维 细胞上增殖的示意图。其中：图6A为转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡 的成纤维细胞上单独形成空斑的照片；
[0031] 图6B为转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上，并且经过多次空斑纯化 后在鸡的成纤维细胞增殖的示意图。
[0032] 图7 :是本发明的鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE的基因组成示意 图，是通过用鸭肠炎病毒C-KCE的全长核苷酸序列DEV替换转移载体pBlue-UL27-UL26中 的 DNA 片段（126+127+311?/)得到。
[0033] 图8 :是本发明鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE的示意图，其中CMV. P是CMV启动子，RFP是红色荧光蛋白基因。
[0034] 图9 :是本发明pRThGA载体改造成重组质粒pRTHGAl的示意图。其中：图9中左 上图中的CMVPromoter是CMV启动子；图9中右上图及下中图中的Chicken beta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 启动子，CMV. IE enhancer 是 CMV. IE 增强子。
[0035] 图10 :是本发明构建重组质粒PRTHGA-HA5和pRTHGA-HA9的流程图。其是在质粒 pRTHGAl的限制性内切酶位点Small和XhoI之间分别插入H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽 流感病毒的ha基因获得。
[0036] 图11 :是本发明构建的重组质粒pRTHGA-HA5的示意图。其中，图中的Chicken beta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 的启动子，CMV. IE enhancer 是 CMV. IE 增强 子；质粒带有Amp (氨节青霉素）抗性。
[0037] 图12 :是本发明构建的重组质粒pRTHGA-HA9的示意图。
[0038] 图13 :是本发明的rDEV-HA5疫苗株与rDEV-HA9疫苗株的构建流程图。
[0039] 图14 :是本发明构建的含有H5亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组 质粒PBAC-C-KCE-HA5的基因组成示意图。是将质粒pBAC-C-KCE的红色荧光蛋白基因（RFP) 替换为H5亚型禽流感病毒的ha基因而获得。
[0040] 图15 :是本发明构建的含有H9亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组 质粒PBAC-C-KCE-HA9的基因组成示意图。是将质粒pBAC-C-KCE的红色荧光蛋白基因（RFP) 替换为H9亚型禽流感病毒的ha基因而获得。
[0041] 图16 :是本发明构建的含有H5亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组 质粒PBAC-C-KCE-HA5的示意图，其核苷酸序列全长为169,784bp。
[0042] 图17 :是本发明构建的含有H9亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组 质粒PBAC-C-KCE-HA9的示意图，其核苷酸序列全长为169,766bp。
[0043] 图18中的上图中rDEV-HA5重组毒株与抗HA的单抗发生反应产生明显的条带呈 阳性，而DEV毒株则呈阴性，证明rDEV-HA5重组毒株构建成功。图18的中图中rDEV-HA9 重组毒株与抗HA的单抗发生反应产生明显的条带呈阳性，而DEV毒株则呈阴性，证明 rDEV-HA9重组毒株构建成功。图18的下图中rDEV-HA重组毒株与DEV毒株与内参GAPDH 的单抗都发生反应产生明显的条带呈阳性，证明该实验有效。
[0044] 图19 :是本发明中雏鸭免疫rDEV_HA5疫苗前后对高致病性禽流感病毒H5N1 (XN) 的HI抗体效价的监测示意图。
[0045] 图20 :是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA5疫苗前后对鸭肠炎病毒血清抗体的ELISA 监测示意图。
[0046] 图21 :是本发明中rDEV-HA5疫苗对H5亚型高致病性禽流感病毒的保护率示意 图。
[0047] 图22 :是本发明中rDEV-HA5疫苗对鸭肠炎病毒的保护率示意图。
[0048] 图23 :是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA9疫苗前后对禽流感病毒H9N2 (Wl)的HI抗 体效价的监测示意图。
[0049] 图24 :是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA9疫苗前后对鸭肠炎病毒血清抗体的ELISA 监测示意图。
[0050] 图25 :是本发明中rDEV-HA9疫苗对H9亚型禽流感病毒的保护率示意图。
[0051] 图26 :是本发明中rDEV-HA9疫苗对鸭肠炎病毒的保护率示意图。

【具体实施方式】
[0052] 实施例IBAC同源臂的构建和多拷贝的形成
[0053] 1、鸭病毒性肠炎（DEV)病毒基因组的提取
[0054] 将冻存的鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE (该生物材料已经发表，参见文献16 (Chen et al. Wei Zou et al.Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain. Virology Journal2013, 10:328)其基因组DNA序列已提交，见GenBank ID:KF263690。该毒株是华中 农业大学农业微生物学国家重点实验室于2010年在中国湖北省咸宁市某鸭场采集病料。
[0055] 该毒株的分离、制备方法如下：将从湖北省咸宁市某鸭场采集到的鸭场病料鸭场 病料加入0. 9%的生理盐水后进行匀浆并将离心后的上清接种鸡胚，盲传三代后收集鸡胚 尿囊液得到鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE)的病变细胞连续冻融3次，4°C 8000rpm离心20min 沉淀细胞碎片。收集上清，30% (w/w)鹿糖溶液垫底，4? 16000rpm离心60min沉淀病毒粒 子。弃掉上清，加入双蒸水将病毒粒子悬浮。加入蛋白酶K至终浓度500 μ g/rnL，十二烷基 硫酸钠（SDS)至终浓度1%。置56°C水浴I h。将消化后产物用等体积的V(苯酚）：V(氯 仿）=体积比为1 :1和氯仿各抽提一次，16000rpm离心15min。取上清液向其中加入有加 入等体积的异丙醇轻轻混匀，-20°C沉淀核酸2h。4°C 16000rpm离心20min沉淀DNA，70% 冷乙醇洗涤一次，回收核酸沉淀，重悬于TER(含有RNA酶的TE)室温作用10min，充分消化 RNA，消化完毕后用作模板使用。
[0056] 2.在UL26和UL27 (UL26和UL27是鸭肠炎病毒的部分基因组序列， GenBank:EU082088. 2)之间插入BAC载体：UL26两端引入NotI和PacI的酶切位点（上下游 引物分别为UL26-F和UL26-R，引物具体序列见表1)，UL27上游引入Pac I的酶切位点（上 下游引物分别为UL27-F和UL27-R，引物具体序列见表1)。以C-KCE的基因组为模板将同源 臂用PCR扩增下来。以pcDNA3. 1(如图2所示，该质粒由湖北大学生命科学学院马立新教授 赠送)为模板扩增amp复制子，并且在两端引入Pac I的酶切位点(上下游引物分别为Amp-F 和Amp-R，引物具体序列见表1)。以pRTRA质粒（由湖北大学生命科学学院马立新教授赠送） 为模板扩增RFP基因，并在下游引入Sal I的酶切位点(上下游引物分别为RFP-F和RFP-R， 引物具体序列见表 1)。PCR 扩增体系：Easy-TaqO. 25μ L ;10xbuffer2. 5μ L，dNTP2y L，模 板 2 μ L，上下游引物（UL26-F 和 UL26-R，或 UL27-F 和 UL27-R，或 Amp-F 和 Amp-R，或 RFP-F 和RFP-R)各1 μ L，CldH2O补齐25μ L，混匀后按以下程序进行反应：95°C预变性5min，94°C 变性30s，按各引物退火温度，40s，延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0057] 采用重叠 PCR 方法（PCR 扩增体系：Easy-TaqO. 25 μ L ;10xbuffer2. 5 μ L， dNTP2 μ L，模板 2 μ L，三对上下游引物（UL26-F 和 UL26-R，UL27-F 和 UL27-R，RFP-F 和 RFP-R)各1 μ L，CldH2O补齐25 μ L，混匀后按以下程序进行反应：95°C预变性5min，94°C变性 30s，52°C退火，40s，72°C延伸5min，30个循环，最后72°C延伸IOmin)将三者连接在一起，然 后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue-lox载体(如图4所示，由湖北大学生命科学学院马立 新教授赠送）上，获得重组pBlue质粒。将amp复制子克隆到PacI酶切的重组pBlue质粒 中得到带有amp复制子的转移载体pBlue-UL27-UL26 (长度为12,545bp，构建流程见图1， 其基因结构组成见图3,质粒图见图5)。
[0058] 表IPCR及重叠 PCR引物
[0059]

【权利要求】
1. 一种鸭肠炎病毒人工染色体的重组质粒DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9,其特征在于：在 鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE中插入H9N2亚型禽流感病毒ha基因的片段，得到 重组的质粒DH10B-1S 2/BAC-C-KCE-HA9 ;所述质粒pBAC-C-KCE的基因结构组成如图7所示； 所述质粒PBAC-C-KCE-HA9的基因结构组成如图15所示。
2. -种包含H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒人工染色体的重组质粒 PBAC-C-KCE-HA9的大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9，保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO :M2013740。
3. 权利要求1所述的重组质粒DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9的制备方法，其特征在于该 质粒是通过如下步骤制备得到的： (1) 将登录号为GenBank ID:KF263690的鸭肠炎病毒C-KCE的全基因组，通过同源重组 的方法插入到BAC质粒上得到一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE，含有该质 粒的大肠杆菌DH10B-1S 2/BAC-C-KCE保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO ：M2013377 ； (2) 将质粒？1?11^4改造为？1?1'邪41，即在？1?1'邪41质粒上插入!19吧亚型禽流感病毒11& 基因，其登录号为GenBank ID:DQ465400. 1，得到重组质粒pRTHGA-HA9,其基因结构组成如 图15所示； (3) 运用MAGIC的方法分别将质粒pRTHGA-HA9中的禽流感病毒ha基因插入鸭肠炎病 毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE中，得到含有禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的 重组质粒PBAC-C-KCE-HA9,其结构如图17所示；含有该重组质粒pBAC-C-KCE-HA9的大肠 杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCN0 : M2013740。
4. 权利要求1所述的质粒在制备H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗中的 应用。
【文档编号】A61K39/245GK104293820SQ201410030951
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】金梅林, 邹忠, 李淑云 申请人:华中农业大学