氯化锂作为Hedgehog信号通路抑制剂在制备抗胰腺癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了氯化锂在胰腺癌靶向治疗中的新用途。揭示了胰腺癌高表达的核转录因子Gli1和E3泛素连接酶ITCH的相互调节机制，Gli1可以作为胰腺癌治疗的药物靶点，ITCH对其的调节机制在抗胰腺癌药物开发中起作用。
【专利说明】氯化裡作为Hedgehog信号通路抑制剂在制备抗胰腺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药应用领域，涉及一种经典的情绪稳定剂氯化锂的医药新用途一作为Glil信号抑制剂在制备抗胰腺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一,来源于胰腺组织中的转化细胞，具有发病隐匿、恶性程度高、病程进展快、高致死等特点。美国国家癌症研究中心估计(http://www.seer, cancer, gov), 2012年全美有43，920人被诊断为胰腺癌,其中37，390人将死于此病。人群中的发病率是12.1/100，000/年，死亡率是10.8/100，000/年。该病总体患者的I年相对生存率小于25%，而5年相对生存率小于6%，其中原位癌的5年生存率约为20%，局部晚期和转移性癌的中位生存期分别约是10个月和6个月。有些患者在确诊时就已经病入膏肓，只有数天或数周生存时间。在癌症导致的相关死亡人数中，胰腺癌在美国名列第四，全球第八，并且在主要临床癌症中其死亡率是最高的。胰腺癌的发病风险包括年龄、吸烟、酗酒、糖尿病、肥胖、遗传等因素。
[0003]氯化锂是一种经典的情绪稳定剂，用于双相情感障碍和其他精神疾病的临床治疗已有50年的历史。而锂治疗精神疾病的靶点是锂能通过多种途径抑制GSK3 β。Gupta等认为锂的抗肿瘤效应也主要是通过抑制GSK3 0而实现的。此外，锂离子通过调节许多癌症相关基因或信号的生物活性，例如，STAT3[139]、^-catenin/WNT[128, 129]、P53 [140]、TNF[132, 141]、FASL[141]和TRAIL[142]，抑制了肿瘤细胞的生长和致瘤性。
[0004]Gli蛋白家族是锌指结构的转录因子。在脊椎动物中鉴定出的成员有Glil、Glil2和Glil3。其中Glil主要起转录激活作用，它既是Hedgehog(Hh)通路下游的效应分子，也是该通路调节的靶蛋白，其表达也是Hh/Gl i I信号通路激活的标志。
[0005]Hh/Glil信号通路在多细胞动物胚胎形态发生、组织分化、干细胞维持过程中发挥着重要的作用。在人的胰腺癌组织和细胞系中，Hh信号通路中的成员均过度表达并且在胰腺癌形成的早期和后期都扮演着非常重要的媒介作用，Hh信号通路的异常活跃会促进了癌细胞的生长、增殖、迁移、侵染及进一步的癌变。
[0006]泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，蛋白质的泛素化修饰涉及到泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应，其中E3连接酶具有底物特异性。Glil降解调节途径主要是HECT型-E3连接酶依赖性途径:其中ITCH是属于E3连接酶HECT家族的成员，其含有保守的两个色氨酸残基和C末端HECT连接酶结构域。ITCH能够与Gli I结合并促进其多聚泛素化，随后Gli I则通过蛋白水解酶体被降解，下调了细胞内的水平。LiCl可以上调ITCH的表达，从而促进Glil的降解，这是本发明人首先发现的，这对于发现新的抗胰腺癌药物具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明的发明目的是提供一种情绪稳定剂氯化锂的医药新用途——氯化锂作为Hedgehog信号通路抑制剂在制备抗胰腺癌药物中的应用。
[0008]下面通过细胞实验和动物实验来说明氯化锂对Hedgehog信号通路的抑制作用及对转录因子Glil的促泛素化降解作用。
[0009]仪器:Thermo酶标仪，Biorad蛋白质电泳及转印系统，ABi Stepone plus突光定量PCR分析仪。
[0010]试剂:RNA反转录试剂盒购自Thermo公司；DMEM(高糖)及胎牛血清购自Gibco公司；各种抗体购自Cell Singaling Technology公司，用于突光定量PCR的Cyber Green购自Roche ;总RNA提取试剂购自捷瑞公司；MTT购自上海生工。
[0011]方法及结果:
Uffestern-Blot检测氯化锂对Hedgehog信号活性的抑制
将相同数量的PDA细胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接种于6孔板至80~90%，更换新鲜培养基，加入20mM氯化锂处理18h，加入相同浓度氯化钠处理相同时间作为对照，提取总蛋白，结果见图1和图2。图1的结果表明，使用氯化锂处理PDA细胞18h后，能够有效抑制PDA细胞中H edgehog信号通路的转录因子Glil的水平，图2的结果表明，氯化锂对于Hedgehog信号通路中其他蛋白的抑制作用。
[0012]2、氯化锂对Hedgehog信号持续活化细胞的抑制增殖作用
将相同数量的PDA细胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接种于96孔板至25%，加入氯化锂(lmM-40mM 处理 24h、20mM 处理 0_72h)处理，加入 20 μ 15mg/ml MTT 母液，37°C 孵育 4h 测定吸光值。检测结果见图3。图3显示，用氯化锂处理PDA细胞，发现氯化锂能够有效抑制PDA细胞的生长和增殖。
[0013]3、氯化锂对Hedgehog信号持续活化细胞的抑制迁移作用
将相同数量的PDA细胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接种于6孔板至80~90%，垂直细胞划痕，PBS清理后加入含有相应浓度氯化锂的DMEM全血清培养基培养，结果见图4。图4显示，用氯化锂处理后的PDA细胞迁移能力下降，氯化锂能够抑制PDA细胞的迁移。
[0014]用含BSA的无血清培养基重悬细胞，将100 μ I无血清细胞悬液加入transwell上室，500 μ I全血清细胞培养液加入下室及不同浓度的氯化锂，然后细胞培养12~24小时后，取出小室，用棉签将上室中的细胞擦除，4%多聚甲醛固定20min，下室细胞用结晶紫染色20min后，用PBS将未与细胞结合的结晶紫洗去，测吸光值，结果见图5。图5显示，氯化锂能够显著抑制PDA细胞的迁移。
[0015]4、荧光定量PCR检测氯化锂对Glil所调控下游基因的转录活性
荧光定量PCR中PDA细胞与6孔板中生长至80~90%，加入含有20mM氯化锂的DMEM全血清培养基，处理24h后，提取总RNA，反转录后，做荧光定量PCR分析。结果见图6，图6的结果表明，氯化锂处理后，PDA细胞中Hedgehog信号通路的成员(SHH、SM0和Glil)以及Hh信号通路的下游靶基因(HHIP、CCND1和PTCH1)的mRNA水平都有显著的降低，证明氯化锂可以抑制Glil调控的下游靶基因的转录水平。
[0016]5、动物裸鼠实验检测氯化锂对胰腺癌移植瘤的抑制作用
BALB/c裸鼠皮下注射PANC-1和BxPC_3细胞，造胰腺癌荷瘤小鼠，然后通过口服给氯化锂的给药途径，在第7天，所有裸鼠均出现肉眼可见、绿豆大小且均一的BxPC-3细胞移植瘤，即全部裸鼠接种成功，但裸鼠的PANC-1细胞移植瘤形成缓慢，且成瘤率仅为60%。在第7天，将BxPC-3细胞荷瘤鼠随机分3组，即阴性对照组、锂实验组、阳性对照组(尾静脉注射吉西他滨)，每组7只小鼠。氯化锂实验组裸鼠通过饮用水口服给锂，阳性对照组由尾静脉注射吉西他滨及饮用正常水，阴性对照组只饮用正常水。各组裸鼠每3~4天(一周二次)记录体重和测量肿瘤体积。结果见图8，图8结果说明，氯化锂可以抑制瘤体积的增长。
[0017]6、RT-qPCR和Western-Blot检测氯化锂促Glil泛素化降解作用
荧光定量PCR中PDA细胞与6孔板中生长至80~90%，liposome2000转染ITCH进入PDA细胞，加入含有IOmM氯化锂的DMEM全血清培养基处理24h后，提取总RNA，反转录后，做荧光定量PCR分析。结果见图9。图9结果表明，氯化锂处理后，ITCH可以显著促进Glil的降解。
[0018]将相同数量的PDA细胞接种于6孔板至80~90 %，更换新鲜培养基，liposome2000转染ITCH进入PDA细胞，再加入IOmM氯化锂处理24h，提取总蛋白，结果见图8。图8结果表明，氯化锂通过ITCH处理Glil的泛素化降解。
[0019]综上所述，结合对Glil的激活与降解途径的综合分析，本发明首次公开提出LiCl对胰腺癌细胞中Hh/Gl i I的下调模式为“LiCl处理促进了 HECT型-E3连接酶依赖性的Gli I的泛素化降解途径”。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是氯化锂抑制Hedgehog信号通路转录因子的水平。
[0021]图2是氯化锂抑制Hedgehog信号活性。
[0022]图3是MTT检测氯化锂抑制PDA细胞存活率。
[0023]图4是细胞划痕实验结果图
[0024]图5是transwell实验验证氯化锂抑制PDA细胞的迁移。
[0025]图6利用Western-blot和RT-qPCR对PDA细胞中Hh通路的成员如SHH、SMO和Glil以及Hh信号通路的下游靶基因HHIP、CCND1和PTCHl等的mRNA水平和蛋白水平的分析。
[0026]图7是裸鼠体内实验给药方式的确定。
[0027]图8 口服给氯化锂后，荷瘤裸鼠胰腺癌移植瘤变化检测。
[0028]图9ITCH调控Glil表达的蛋白水平和mRNA水平分析。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明进一步阐述:
实施例一:氯化锂抑制胰腺癌细胞增殖
1、材料
LiCl购自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的储液，0.22 μ m的滤器过滤除菌，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释成lmM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同浓度的溶液备用。
2、肿瘤细胞AsPC-1细胞、PANC-1细胞、BxPC-3细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
3、其他试剂及仪器
DMEM高糖购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；C02培养箱(Thermo)；酶标仪(Thermo) ;CCK_8检测试剂(日本同仁化学)。
4、方法
取5000个/孔细胞于96孔板中，将培养板在37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱预培养过夜，然后向96孔板加入不同浓度的Li+，将培养板在培养箱孵育相应的时间，再去除每孔中的培养基，加入含10% CCK8的新鲜培养基(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)，放回培养箱内孵育I~4小后，取出培养板并冷却到室温后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μ 10.1M的HCl溶液或者I %w/v SDS溶液，并在室温条件下遮盖培养板避光保存。24小时内测定，吸光值不会发生变化。每孔样品的吸光值需扣除培养基的空白吸收值。活力计算:细胞活力*(%) = [A(加药)-A(空白/A(不加药)-A(空白)X 100% )
A (加药):具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A(空白):具有 培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A(不加药):具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力
5、结果
结果见图1，由图1可知，LiCl处理后，以剂量和时间依赖性的方式降低了胰腺癌细胞系AsPC-l、PANC-l和BxPC-3细胞的活力。结果显示20mM和40mMLi+处理24h后对PANC-1细胞抑制率达到75%和68%，而20mM和40mMLi+处理24h后对BxPC-3细胞抑制率达到70%和 65%。
[0030]实施例二:氯化锂抑制PDA细胞迁移
1、材料
LiCl购自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的储液，0.22 μ m的滤器过滤除菌，用含有10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释成ImM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同浓度的溶液备用。
2、肿瘤细胞
AsPC-1细胞、PANC-1细胞、BxPC-3细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
3、其他试剂及仪器
DMEM高糖购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司
4、方法
(1)在6孔板中加入约5X105个细胞，过夜培养至细胞融合度达90%~100%，用20 μ I枪头比着直尺，尽量垂直于细胞中划痕。然后用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入含相应药物浓度的培养基。再放入37°C ,5% C02及饱和湿度的培养箱培养，按时取样拍照。
(2)消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗I~2遍，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5X106cells/ml然后向transwell上室加入100 μ I无血清细胞悬液，向其下室加入500 μ I全血清细胞培养液及不同浓度的锂。将细胞培养12~24小时后，取出小室，用棉签将上室中的细胞擦除，4%多聚甲醛固定20min。下室细胞用结晶紫染色20min后，用PBS将未与细胞结合的结晶紫洗去，放到正置显微镜下拍照。
5、结果
结果如图3所示，Li+以时间和剂量依赖性方式降低了 PANC-1和BxPC-3细胞的迁移能力。Transwell migration assay同样验证了 LiCl在24h以剂量依赖性方式显著降低了BxPC-3和PANC-1细胞的迁移能力。
[0031]实施例三:PDA细胞中Hh通路的成员如SHH、SM0和Glil以及Hh信号通路的下游靶基因HHIP、CCNDl和PTCHl等的mRNA水平和蛋白水平的分析
1、材料
LiCl购自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的储液，0.22 μ m的滤器过滤除菌，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释成lmM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同浓度的溶液备用。
2、细胞系
HEK293细胞、AsPC-1细胞、PANC-1细胞、BxPC-3细胞、B16F10细胞(中科院细胞典臧所)。
3、其他试剂和仪器
质粒载体PCDNA3.1-Myc-Glil (2-1 IOOaa)为自己构建；DMEM高糖和胰酶，Gibco ；Trizol,美国 Invitrogen ；RNA 反转录酶、Oligo dT、Random primer、dNTP, TaKaRa 公司；2XSYBR Green PCR master mix,罗氏公司；焦碳酸二乙酯(DEPC), Invitrogen 公司；PCR扩增MIX。天为时代公司；感受态细胞，TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒，TaKaRa公司；0.45 μ mPVDF 膜，Millipore 公司；预染蛋白质 Marker, Thermo 公司产品；Trypton 和Yeast Extraction, OXID公司产品；P1、Annexin V检测试剂盒,南京凯基生物公司产品;Lipofectamine2000, Invitrogen 公司；0pti_MEM 培养基，Invitrogen 公司；
表 IReal-time PCR 引物 Name Forword primer (5-3')Reverse primer (5'-3!)
GlilCTCCCGAAGGACAGGTATGTAACCCCTACTCTTTAGGCACTAGAGTTG~
PTCHl TCGAGACCAACGTGGAGGAG CCGAGTCCAGGTGTTGTAGG HHIP TTCCATACCAAGGAGCAACCTCTTGCCACTGCTTTGTCAC
SHH CGGGAAGAGGAGGCACCCCA GTACTTGCTGCGGTCGCGGT CCNDl AGAAGGAGGTCCTGCCGTCC GGTCCAGGTAGTTCATGGCC FUACTCTGAGCAGACTTTGCGGAG CCATCCAAGACAACCTGCTGTG
SUFU AGAGTGCCGCCGCCTTTACCACGGGCTGCATCTGTGGGTC
SMO CAGGAGGAAGCGCACGGCAA TGCAGCGCAGGAAGTCAGGC GAPDH TGTGGGCATCAATGGATTTGG ACACCATGTATTCCGGGTCAAT
引物合成为南京思普金生物科技有限公司
表 2Western Blot 抗体
【权利要求】
1.氯化锂作为Hedgehog信号通路抑制剂在制备抗胰腺癌药物中的应用。
2.如根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述肿瘤细胞为Hedgehog信号通路持续活化的的胰腺癌细胞。
3.如权利2要求所述，其特征在于:氯化锂促进了Hedgehog信号通路中转录因子Glil的泛素化降解， 下调其细胞内水平。
【文档编号】A61P35/00GK103893206SQ201410166149
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】周伟, 陆美玲, 欧瑜 申请人:中国药科大学