一种调控stat3磷酸化的融合肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种调控磷酸化STAT3表达的融合肽。所述的融合肽，是基于穿膜肽TAT序列和细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区(KIR)序列的融合肽，并以异硫氰酸荧光素(FITC)对融合肽进行氨基端标记。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。SEQ.ID.NO.3所示的融合肽对调控磷酸化的STAT3表达的应用或者作为抑制炎症反应、促进损伤修复的治疗新靶点的应用。
【专利说明】一种调控STAT3磷酸化的融合肽及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及具有生物活性的多肽的人工设计和合成，特别涉及一种调控STAT3磷酸化的融合肽及其应用。
【背景技术】:
[0002]1、细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区(KIR)研究进展
[0003]细胞因子信号转导抑制因子3(S0CS3)作为细胞因子信号转导通路的重要抑制物，可以特异性地抑制炎症因子介导的JAK/STAT3信号通路，形成对JAK/STAT3通路的负反馈调节，在遏制炎性反应中起关键作用，因此被认为是最有潜力提高炎性损伤修复效果的治疗祀点。[0004]S0CS3通常通过以下3种途径完成对JAK/STAT3信号通路的负性调控:⑴与STAT相似的SH2结构域竞争性结合细胞因子受体的磷酸化酪氨酸位点，阻止转录因子STAT3的活化(磷酸化)；(2) S0CS3的SH2结构域与通路中的JAK结合，竞争性抑制JAK与底物的结合；(3)利用其C端的SOCS盒与延伸蛋白BC复合体结合，将与S0CS3结合的信号蛋白通过泛素化途径降解，从而阻断细胞因子的信号传递。除此之外，S0CS3和SOCS家族中的另一个成员SOCSl的N端存在其独特的激酶抑制区(KIR)，可作为假底物与JAK的催化位点结合，抑制酪氨酸激酶的活性，从而阻止转录因子STAT3的活化。S0CS3通过负性调节炎性因子介导的JAK/STAT3信号转导通路的活化从而发挥对抗炎症反应的作用，但内源性的S0CS3被诱导后很快降解，不足以遏制病理情况下的炎症信号。
[0005]因此，利用外源性添加S0CS3蛋白来抑制急性炎症反应成为近年来的研究热点。已有研究证实SOCSl的KIR与SOCSl的作用相似，可以完成对JAK/STAT信号通路的调控作用。
[0006]2、穿膜肽的研究进展
[0007]生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要作用，而由于细胞膜的天然屏障作用，使得这类有治疗价值但无细胞膜穿透性的大分子在细胞生物学，药学及临床治疗中的应用大大受到限制。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是近年来相继发现的一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度为几个至几十个氨基酸不等，多数小于20个氨基酸。其可以有效地将蛋白、多肽等生物大分子通过无受体介导、无耗能的方式，导入细胞内，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。CPPs的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光。将它们作为生物活性分子的细胞内转运工具，应用于细胞生物学、药物体内转运、临床药物治疗等领域，具有诱人的前景。
【发明内容】
[0008]本发明解决的问题在于提供一种调控STAT3磷酸化的融合肽及其应用，该融合肽是基于穿膜肽(TAT)和细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区(KIR)融合，可用于制备提高炎性损伤修复效果的药物。[0009]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0010]一种调控STAT3磷酸化的融合肽，通过连接蛋白将穿膜肽TAT的C端与细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区KIR的N端连接。
[0011]所述穿膜肽TAT的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区KIR的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]所述的连接蛋白为Leu-Arg。
[0013]所述的调控STAT3磷酸化的融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0014]所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备负性调控STAT3磷酸化的药物中的应用。
[0015]所述的药物为负性调控炎性因子介导STAT3磷酸化的药物。
[0016]所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抑制JAK/STAT3信号通路的活化的药物中的应用。
[0017]所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抑制脑损伤后炎性反应的药物中的应用。
[0018]所述的药物是抑制炎症反应、促进损伤修复的药物。
[0019]所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抗脑损伤的药物中的应用。
[0020]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0021]本发明采用穿膜肽与细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区的融合肽，通过截取了 S0CS3蛋白上截取的一部分序列，一方面减少了目的肽的分子量，增加了穿膜肽的穿膜效率，以保证其能够进入胞内；另一方面在减少分子量的同时，还筛选可能具有抑制活性的KIR序列；结果表明所构建的融合肽既具有较好的穿膜活性，又能够负性调控STAT3的磷酸化，抑制JAK/STAT3信号通路的活化。
[0022]本发明采用穿膜肽与细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区的融合肽，可应用于制备抑制脑损伤后炎性反应的药物中的应用，比如抑制脑损伤后炎症反应、促进损伤修复的药物。而且由于STAT3磷酸化一定程度上加重损伤，而融合肽TAT-KIR抑制STAT3的磷酸化，能够促进损伤修复，用于抗脑损伤的药物中的制备，比如对局灶性脑缺血再灌注损伤的修复。
【专利附图】
【附图说明】:
[0023]图1为荧光显微镜下观察融合肽FITC-TAT-KIR穿膜效果图；
[0024]图2为不同浓度融合肽在30min时的穿膜效率线形图；
[0025]图3为3 μ m/L融合肽在30min时的穿膜效率流式图；
[0026]图4不同浓度的IL-6对PC12细胞活力的影响的柱形图；
[0027]图5为IL-6作用后PC12细胞胞内P-STAT3表达的结果图及柱形图；
[0028]图6为TAT-KIR对STAT3磷酸化的抑制作用的结果图及柱形图；
[0029]图7为原代培养的星形胶质细胞及鉴定图；
[0030]图8为IL-6作用后星形胶质细胞胞内ki67表达图及柱形图；
[0031]图9为IL-6作用对星形胶质细胞细胞活力/增殖的影响的柱形图；
[0032]图10为IL-6作用后星形胶质细胞胞内P-STAT3表达的结果图及柱形图；[0033]图11为KIR作用后星形胶质细胞胞内ki67表达图及柱形图；
[0034]图12为TAT-KIR对星形胶质细胞细胞活力/增殖的影响的柱形图；
[0035]图13为TAT-KIR对STAT3磷酸化的抑制作用的结果图及柱形图。
【具体实施方式】
[0036]1、化学合成融合肽
[0037]融合肽TAT-KIR由上海楚肽生物科技有限公司合成，其中KIR多肽序列为:L-K-T-F-S-S-K-S-E-Y-Q-L，TAT 序列为:R-K_K-R-R-Q-R-R-R，以异硫氰酸荧光素(FITC)对融合肽进行氨基端标记。
[0038]为减少目的肽的分子量、增加了穿膜肽的穿膜效率，选择从S0CS3蛋白上截取的一部分序列作为KIR，所截取的KIR同时还要能够保持较高的抑制JAK/STAT3信号通路的活化，经筛选选择与JAK底物的JAK活化环相似的KIR，可作为一种假底物妨碍JAK底物与JAK结合，从而可以抑制JAK的活性，进而抑制JAK/STAT3信号通路的活化、抑制炎症反应。
[0039]2、融合肽跨膜转运效率检测
[0040]以PC12细 胞(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)为宿主细胞，其细胞培养液为DMEM/高糖完全培养基，即DMEM/高糖基础培养基+10%胎牛血清。基础培养基购自Gibco，胎牛血清购自 Hyclone。
[0041]将FITC标记的融合肽按不同比例加入PC12细胞培养液中，使其终浓度分别为I μ m/L、3 μ m/L、6 μ m/L, IOmin后取部分细胞于突光显微镜下定性观察跨膜转运效果,并与加入等量FITC、FITC-TAT的细胞进行对比，每隔IOmin观察I次，持续Ih ;其余细胞以流式细胞仪定量检测带有绿色荧光的细胞数量，计算TAT介导的KIR跨膜转运效率。
[0042]参考图1所示，PC12细胞培养体系中加入单纯的FITC组和对照组相同，细胞内无绿色荧光出现，而加入FITC-TAT以及不同浓度融合肽FITC-TAT-KIR后lOmin，荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光出现；以流式细胞仪对融合肽处理组带有绿色荧光细胞数量进行定量检测，参考图2所示，随FITC-TAT-KIR浓度升高，带有绿色荧光细胞比例增加，但当达到一定的浓度，细胞比例不再增加；其中，终浓度3 μ m/L融合肽在30min时穿膜效率最高，约99%的细胞内有融合肽FITC-TAT-KIR的存在，单纯FITC标记的TAT组约有95%细胞有绿色荧光，提示TAT可以成功进入细胞内，并且可以有效的将KIR带入PC12细胞(图3)。
[0043]3、PC12细胞培养以及实验分组
[0044]PC12细胞复苏后以2X 105/ml密度接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基贴壁培养，5d后传代I次。传代后次日，将细胞分为4组:(I)对照组:不做任何处理，继续正常培养；(2) IL-6刺激组:于培养基中加入3个不同浓度(50，100,200ng/ml)的IL-6，模拟炎性细胞因子引起的炎症反应；(3) TAT-KIR组:培养基中加入终浓度为3 μ m/L的TAT-KIR，观察KIR对正常培养的PC12细胞的影响；(4)TAT-KIR+IL-6组:培养液中先加入终浓度
3μ m/L的TAT-KIR，于30min后各孔再加入IL-6进行刺激，观察KIR对IL-6模拟的炎症反应的影响。
[0045]4、MTT检测细胞活力
[0046]将传代培养的PC12细胞以5000个/孔接种于96孔板，每孔加DMEM/高糖完全培养基200 μ 1，培养24h后每孔加入不同终浓度(50，100,200ng/ml)的IL-6，对照组加入等量培养基，继续培养24h，加入MTT溶液(每孔20 μ I)，继续37°C孵育4h后吸弃培养液，每孔加入DMSO溶液150 μ 1，震荡使结晶物溶解，然后于490nm波长以酶联免疫检测仪测定各孔吸光值。
[0047]5、免疫印迹检测蛋白表达
[0048]IL-6刺激及TAT-KIR处理组细胞在分别处理后15min收集细胞，TAT-KIR+IL-6组细胞先经过TAT-KIR预处理30min，然后在IL-6刺激后15min收集细胞，依照全蛋白提取盒说明书提取细胞全蛋白，蛋白定量后经电泳分离，将分离后蛋白转膜，并以BSA封闭，依次分别与第一抗体(P-STAT3，STAT3及β-actin)及第二抗体(HRP标记抗兔和抗小鼠IgG)孵育，化学发光法检测。
[0049]上述实验结果如下:
[0050]I) IL-6对PC12细胞的刺激作用
[0051]参考图4所示，以3个不同浓度(50、100及200ng/ml)的IL-6刺激PC12细胞模拟炎性细胞因子引起的炎症反应。结果显示，IL-6作用后细胞活力/活细胞数量有所增加，尤其是100ng/ml IL-6作用组与对照组差异有统计学意义，而其他2个浓度组并未出现相同现象。提示100ng/ml的IL-6可以增加PC12细胞活力和增殖能力，成功地模拟了炎症反应。
[0052]与此同时，免疫印迹检测IL-6作用后PC12细胞内STAT3磷酸化水平，结果显示，100ng/mlIL-6作用后，细胞内STAT3的磷酸化水平增加，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05，图5)。提示100ng/ml IL-6增高STAT3磷酸化水平，即激活了 PC12细胞内JAK/STAT3信号通路。
[0053]2) TAT-KIR对PC12细胞STAT3磷酸化的影响
[0054]参考图6所示，分别对单纯“TAT-KIR”处理以及“TAT-KIR+IL-6”处理后PC12细胞内STAT3磷酸化水平进行了定量检测(通过免疫印迹检测方法)，单纯“TAT-KIR”处理组细胞内P-STAT3水平与阴性对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05);而1么1'-1(11?+11^6”处理后PC12细胞内P-STAT3水平，较IL-6刺激组显著下降(P < 0.05)，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。提示TAT-KIR对PC12细胞STAT3的磷酸化有抑制作用，尤其是对IL-6刺激引起的P-STAT3增高有显著的抑制效果。
[0055]6.1、星形胶质细胞细胞原代分离培养
[0056]新生1-3天内SD大鼠，75%乙醇消毒后断头处置。在体视显微镜协助下用弯眼科镊剥去脑膜，夹取大脑皮层组织，以预冷的基础培养基洗涤2次后用眼科剪快速剪碎组织，
0.25%的胰蛋白酶液消化IOmin,再加入ImL左右FBS以终止消化,离心(600r/min) lmin,弃上清，加入冰PBS混匀，轻轻吹打，用400目筛网过滤后离心弃去上清，细胞计数后接种至培养瓶中差速粘附Ih后转移细胞液至预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中。待原代培养的细胞长满培养瓶底时传代。
[0057]经鉴定，原代分离培养的细胞95%以上为星形胶质细胞如图7所示，可用于下步实验。
[0058]6.2、实验分组
[0059] 星形胶质细胞传代后以2X 105/ml密度接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基贴壁培养，将细胞分为4组:(I)对照组:不做任何处理，继续正常培养；(2) IL-6刺激组:于培养基中加入(100ng/ml)的IL-6，模拟脑损伤后炎性细胞因子引起的炎症反应；(3)TAT-KIR组:培养基中加入终浓度为3 μ m/L的TAT-KIR，观察KIR对正常培养的星形胶质细胞的影响；(4) TAT-KIR+IL-6组:培养液中先加入终浓度3 μ m/L的TAT-KIR，于30min后各孔再加入IL-6进行刺激，观察KIR对IL-6模拟的炎症反应的影响。
[0060]6.3、MTT检测细胞活力
[0061]将传代培养的星形胶质细胞以5000个/孔接种于96孔板，每孔加10%胎牛血清的DMEM/高糖完全培养基200 μ 1，培养24h后每孔加入终浓度为100ng/ml的IL-6，对照组加入等量培养基，继续培养24h，加入MTT溶液(每孔20 μ I)，继续37°C孵育4h后吸弃培养液，每孔加入DMSO溶液150 μ 1，震荡使结晶物溶解，然后于490nm波长以酶联免疫检测仪测定各孔吸光值。
[0062]6.4、免疫组化检测蛋白表达[0063]处理后的细胞经4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤三次，封闭血清+0.3% Triton打孔封闭2h，加鼠抗GFAP及兔抗ki67，4°C过夜后加二抗孵育2h，洗涤后封片，荧光显微镜观察。
[0064]6.5、免疫印迹检测蛋白表达
[0065]IL-6刺激及TAT-KIR处理组细胞在分别处理后15min收集细胞，TAT-KIR+IL-6组细胞先经过TAT-KIR预处理30min，然后在IL-6刺激后15min收集细胞，依照全蛋白提取盒说明书提取细胞全蛋白，蛋白定量后经电泳分离，将分离后蛋白转膜，并以BSA封闭，依次分别与第一抗体(P-STAT3，STAT3及β-actin)及第二抗体(HRP标记抗兔和抗小鼠IgG)孵育，化学发光法检测。
[0066]上述实验结果如下:
[0067]I) IL-6对星形胶质细胞的炎性刺激作用
[0068]参考图8、图9所示，以终浓度100ng/ml的IL-6刺激星形胶质细胞模拟脑损伤后引起的炎症反应。结果显示，IL-6作用后胞内ki67(与细胞增殖相关蛋白)的表达增加，且细胞活力/活细胞数量有所增加，与对照组差异有统计学意义，提示IL-6可以增加星形胶质细胞活力和增殖能力，成功地模拟了炎症反应。
[0069]与此同时，免疫印迹检测IL-6作用后星形胶质细胞内STAT3磷酸化水平的结果显示:IL-6作用后，细胞内STAT3的磷酸化水平增加，与对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05，图10所示)。提示增高STAT3磷酸化水平，即激活了星形胶质细胞内JAK/STAT3信号通路。
[0070]2) TAT-KIR对星形胶质细胞炎性反应及STAT3磷酸化的影响
[0071]参考图11、图12所示，“TAT-KIR+IL-6”处理后星形胶质细胞胞内ki67(与细胞增殖相关蛋白)的表达及细胞活力/活细胞数量均较IL-6刺激组显著下降(P < 0.05)。提示TAT-KIR可以一定程度上抑制炎性因子介导的炎性反应。
[0072]对“TAT-KIR+IL-6”处理后星形胶质细胞内STAT3磷酸化水平通过免疫印迹方法检测，“TAT-KIR+IL-6”处理后星形胶质细胞内STAT3磷酸化水平，较IL-6刺激组显著下降(P < 0.05)。提示TAT-KIR对星形胶质细胞STAT3的磷酸化有抑制作用，尤其是对IL-6刺激引起的STAT3磷酸化增高有显著的抑制效果(如图13所示)。
[0073]综合以上实验结果证明融合肽TAT-KIR可以高速有效穿膜入胞，并可在胞内发挥作用，即负性调控了炎性因子介导的STAT3的磷酸化(包括肾上腺嗜铬细胞瘤细胞和星形胶质细胞)，可应用于制备抑制脑损伤后炎性反应的药物中的应用，比如抑制脑损伤后炎症反应、促进损伤修复的药物。而且由于STAT3磷酸化一定程度上加重损伤，而融合肽TAT-KIR抑制磷酸化STAT3的表达，能够促进损伤修复，用于抗脑损伤的药物中的制备，比如对局灶性脑缺血再灌注损伤的修复。
【权利要求】
1.一种调控STAT3磷酸化的融合肽，其特征在于，通过连接蛋白将穿膜肽TAT的C端与细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区KIR的N端连接。
2.如权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽，其特征在于，穿膜肽TAT的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区KIR的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
3.如权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽，其特征在于，所述的连接蛋白为Leu-Arg0
4.如权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.3 所示。
5.权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备负性调控磷酸化STAT3表达的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为负性调控炎性因子介导的STAT3磷酸化的药物。
7.权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抑制JAK/STAT3信号通路的活化的药物中的应用。
8.权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抑制脑损伤后炎性反应的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物是抑制炎症反应、促进损伤修复的药物。
10.权利要求1所述的调控STAT3磷酸化的融合肽在制备抗脑损伤的药物中的应用。
【文档编号】A61P9/10GK103936863SQ201410166146
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】吕海侠, 王丽, 马辉, 焦倩, 燕晗祺, 马雯, 张智超, 刘勇 申请人:西安交通大学