一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用，属于水包油佐剂【技术领域】。所述环糊精酯化衍生物，是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到。本发明还提供所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）环糊精与酰氯进行酯化反应；（2）步骤（1）反应后得到的混合物与氯磺酸进行酯化反应；（3）取步骤（2）反应后得到的混合物，调节pH至6.8-7.2，除去溶剂，取沉淀溶解、透析、干燥后得到环糊精酯化衍生物。本发明还提供一种水包油型佐剂及兽用疫苗。采用该环糊精酯化衍生物制备的水包油型佐剂，具有良好的热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。本发明环糊精酯化衍生物的制备方法，该方法简单，硫酸根的取代度低，月桂酰基的取代度高，收率高。
【专利说明】一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于水包油佐剂【技术领域】，具体涉及一种环糊精酯化衍生物、制备方法及 其应用。 【背景技术】
[0002] 目前油乳剂疫苗有三种剂型：油包水（W/0)型、水包油包水（W/0/W)型和水包油 (0/W)型。W/0剂型免疫活性最强，但毒副反应大、注射困难;W/0/W免疫活性也较强，但热稳 定性差、保存期短；0/W剂型毒副作用小、使用方便、热稳定性好，但是免疫活性较弱。MF59 是首个实现商品化应用的0/W剂型佐剂，用其制备的人用流感疫苗在欧洲和美国获得上 市。该佐剂的油为角鲨烯，具有安全、毒副作用极小等优点，表面活性剂为吐温和司本系列 产品。但是，该佐剂的免疫活性相对较弱，仅能协助诱导微弱的免疫应答，尚不能满足养兽 用疫苗的质量要求。另外，角鲨烯（或其类似物角鲨烷）的价格昂贵，也很难在兽用疫苗产 品中广泛应用。法国SEPPIC公司用白油替代角鲨烯，用吐温和司本系列产品作为表面活性 齐U开发了一种0/W佐剂（ISA15A VG)，免疫活性也较弱。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种环糊精酯化衍生物，采用该环糊精酯化衍生物制备的水 包油型佐剂，具有良好的热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。
[0004] 本发明的另一目的是提供环糊精酯化衍生物的制备方法，该方法简单，硫酸根的 取代度低，月桂酰基的取代度高，收率高。
[0005] 本发明的再一目的是提供水包油型佐剂，稳定性好，能显著增提高抗原免疫活性。
[0006] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0007] -种环糊精酯化衍生物，是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到。
[0008] 在本发明中，所述环糊精酯化衍生物中硫酸根的取代度为1. 2-1. 5,月桂酰基的取 代度为1. 3-1. 7 ;所述环糊精为β环糊精。
[0009] 本发明还提供所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤： [〇〇1〇] (1)环糊精与酰氯进行酯化反应；⑵步骤⑴反应后得到的混合物与氯磺酸进行 酯化反应；（3)取步骤（2)反应后得到的混合物，调节pH至6. 8-7. 2,除去溶剂，取沉淀溶 解、透析、干燥后得到环糊精酯化衍生物。
[〇〇11] 在本发明中，步骤（1)所述环糊精与酰氯进行酯化反应的方法为：在溶剂中，月桂 酰氯与环糊精在55?80°C条件下进行酯化反应，所述溶剂为二甲基甲酰胺与吡啶的混合 物。
[0012] 在本发明中，步骤（2)的具体方法为：在步骤（1)反应后得到的混合物中加入氯磺 酸，在55?80°C下反应。
[0013] 在本发明中，月桂酰氯与环糊精的摩尔比为（1?4) :1 ;氯磺酸与环糊精的摩尔比 为（0. 5?2. 0) : 1。优选的技术方案中，所述的月桂酰氯与环糊精的摩尔比为（3. 2-3. 8) : 1， 氯磺酸与环糊精的摩尔比为（0.8-1.2):1 ;步骤（1)和（2)的反应温度为55-65°C。
[0014] 本发明还提供一种水包油型佐剂，包括所述环糊精酯化衍生物。
[0015] 优选的技术方案中，所述水包油型佐剂，其特征在于由如下成分组成：
[0016] 所述环糊精酯化衍生物 0.5-1.5质量份 吐温-80 1-3质量份 水 70-90质量份 白油 7-9质量份。
[0017] 本发明还提供一种兽用疫苗，包括抗原和所述水包油型佐剂；所述疫苗为猪圆环 病毒疫苗。
[0018] 本发明环糊精酯化衍生物，硫酸根的取代度低，月桂酰基的取代度高，同时具有亲 水和亲油基团，具备双亲功能。采用该环糊精酯化衍生物制备的水包油型佐剂，具有良好的 热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。
[0019] 本发明采用月桂酰氯对环糊精进行酯化反应，然后采用硫酸酯化法（用氯磺酸进 行磺化），制备了环糊精酯化衍生物。本发明方法简单，收率高。
[0020] 本发明水包油型佐剂，热稳定性和离心稳定性均合格，能显著提高抗原免疫活性。 以猪圆环病毒2型（PCV-2)为模式抗原，通过体内免疫试验测评，该佐剂的免疫增强活性显 著优于进口产品ISA15A VG。本发明提供的水包油型佐剂成功地解决了常规0/W剂型佐剂 免疫活性较弱、不能满足兽用疫苗质量要求的难题，可以用于PCV-2等兽用疫苗的生产。 【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是环糊精的标准曲线图；
[0022] 图2是硫酸钠的标准曲线图。 【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受这些实施例子的限 制。
[0024] 实施例1制备环糊精酯化衍生物
[〇〇25] (1)材料与仪器
[0026] 试验药物：环糊精（分子量1135, β型，上海楷洋生物技术有限公司，批号 Τ0008)、Ν，Ν-二甲基甲酰胺、吡啶、硫酸、盐酸、氯磺酸、氨水（分析纯，南京化学试剂有限公 司）；月桂酰氯（aladdin industrial corporation,批号F1228036);铬酸钾、氯化钠、无水 硫酸钠（西陇化工股份有限公司）。
[〇〇27] 主要仪器设备：DZF-6051真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SHI-82A恒 温水浴振荡器（常州国华电器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-III 循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；KH-500DE数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器 厂）；754紫外分光光度计（上海菁华科技有限公司）；LGJ-18冷冻干燥机（北京松源华兴 科技发展有限公司）。
[0028] (2)糖含量、硫酸根取代度、月桂酰基取代度的测定方法
[0029] 将待测样品放入真空干燥箱中50°C干燥至恒重以上），测定游离脂肪酸的比 例、S0/+质量和糖的质量。
[0030] 游离脂肪酸比例的测定：干燥后样品（Ag)溶于4. Omol/L的HC1水溶液中，用等体 积的氯仿进行抽提、萃取，过滤后，取沉淀干燥，干燥后的沉淀质量为Bg。游离脂肪酸的比例 (g/Kg) = (A - B) + AX 1000。
[0031] S042+的质量：用超声酸性铬酸钡分光光度法法测定样品中S04 2+的质量。以无水硫 酸钠为标准品，用分光光度计测定不同浓度硫酸钠溶液在375nm处的吸光度值（A375值）， 得到硫酸钠浓度与A375的标准曲线和线性方程（图2)。取干燥后样品（Ag)溶于4. Omol/ L的HC1水溶液中，100°C作用6h，测定A375。根据硫酸钠浓度与A375的线性方程，计算出 S042+ 的质量（Cg)。
[0032] 样品中糖的质量测定：用苯酚硫酸法测定样品中糖的质量。以环糊精为标准品， 用分光光度计测定不同浓度环糊精在490nm处的吸光度值（A490值），绘制环糊精浓度与 A490的标准曲线和线性方程。取一定质量（Ag)的样品溶于4. Omol/L的HC1溶液中，100°C 作用6h，测定A490,根据线性方程计算样品中糖的质量（Dg)。
[0033] 硫酸根取代度（Sulphate/monosaccharide) = C + DX 162 + 96。
[0034] 月桂醜基取代度（Lipid/monosaccharide) = (A - C - D - B) +DX 162 + 200。
[0035] (3)环糊精酯化衍生物的制备
[0036] 1)无水二甲基甲酰胺与无水吡啶按照体积比4:1混合，得到二甲基甲酰胺与吡啶 混合液；
[〇〇37] 2)首先对环糊精进行真空干燥预处理，然后取400mg溶于10mL二甲基甲酰胺和吡 陡混合液中，得到环糊精溶液；取0. 8ml、1. 6ml和2. 4ml月桂酰氯分别溶于2mL二甲基甲酰 胺和批陡混合液，得到不同月桂酰氯溶液；取0. 9ml、l. 8ml和3. 6ml氯磺酸分别溶于二甲基 甲酰胺和吡啶混合液，得到不同浓度氯磺酸溶液，氯磺酸与二甲基甲酰胺和吡啶混合液的 体积比为1:2。
[0038] 3)再按表1正交试验设计中月桂酰氯与环糊精的摩尔比，将月桂酰氯溶液与环糊 精溶液混合，按表1调整各试验反应温度，进行酯化反应，反应时间为条件6h。
[0039] 4)然后按表1设定的氯磺酸与环糊精摩尔比，取不同浓度的氯磺酸溶液加入步骤 3)反应后混合物中，按表1调整各试验反应温度，酯化反应6h，冷却至室温；
[0040] 5)用NaOH溶液调节步骤4)反应后混合物的pH至7. 0±0. 2,通过减压蒸馏法 (60°C )去除溶剂，将沉淀用蒸馏水重悬，至流动的水中透析（4°C，7天）除去杂质，真空冷 冻干燥获得环糊精酯化衍生物。
[0041] 表1是3因素3水平正交试验表（L9(34)正交表）
[0042]
【权利要求】
1. 一种环糊精酯化衍生物，是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到。
2. 根据权利要求1所述环糊精酯化衍生物，其特征在于所述环糊精酯化衍生物中硫酸 根的取代度为1. 2-1. 5,月桂酰基的取代度为1. 3-1. 7 ;所述环糊精为β环糊精。
3. 权利要求1所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1)环糊精与酰氯进行酯化反应；（2)步骤（1)反应后得到的混合物与氯磺酸进行酯化 反应；（3)取步骤（2)反应后得到的混合物，调节pH至6. 8-7. 2,除去溶剂，取沉淀溶解、透 析、干燥后得到环糊精酯化衍生物。
4. 根据权利要求3所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于步骤（1)所述环糊 精与酰氯进行酯化反应的方法为：在溶剂中，月桂酰氯与环糊精在55~80°C条件下进行酯 化反应，所述溶剂为二甲基甲酰胺与吡啶的混合物。
5. 根据权利要求3或4所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于步骤（2)的具 体方法为：在步骤（1)反应后得到的混合物中加入氯磺酸，在55~80°C下反应。
6. 根据权利要求5所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于月桂酰氯与环糊精 的摩尔比为（1~4) :1 ;氯磺酸与环糊精的摩尔比为（0.5~2.0) :1。
7. 根据权利要求6所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于所述的月桂酰氯与 环糊精的摩尔比为（3. 2-3. 8) : 1，氯磺酸与环糊精的摩尔比为（0. 8-1. 2) : 1 ;步骤（1)和（2) 的反应温度为55-65°C。
8. -种水包油型佐剂，包括权利要求1-3所述环糊精酯化衍生物。
9. 根据权利要求8所述水包油型佐剂，其特征在于由如下成分组成： 权利要求1-3之一所述环糊精酯化衍生物 0. 5-1. 5质量份， 吐温_80 1_3质量份， 水 70-90质量份， 白油 7-9质量份。
10. -种兽用疫苗，包括抗原和权利要求9所述水包油型佐剂；所述疫苗为猪圆环病毒 疫苗。
【文档编号】A61K47/40GK104086676SQ201410346398
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】卢宇, 王德云, 赵晓娟, 潘华荣, 侯继波, 胡元亮 申请人:江苏省农业科学院