一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法及应用，该方法能够较高水平地获得乳酸菌分泌的胞外蛋白，制备过程简单，成本低廉，适用于规模化生产。包括下述步骤：将乳酸菌接种于改良番茄汁培养基于37℃厌氧条件下进行培养；刮下培养的乳酸菌菌苔，转移至pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液重悬，之后振荡，离心除菌体，收集上清液；经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液；将乳酸菌胞外蛋白的粗提液进行Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，收集含有蛋白峰的蛋白溶液，得到纯化的乳酸菌胞外蛋白。对其进行分子量鉴定，分子量为67KD和37KD。通过两种嗜酸乳杆菌胞外蛋白的应用试验，67KD和37KD胞外蛋白对HT-29细胞的生长具有不同的抑制功效。
【专利说明】一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，特别是涉及一种益生菌分泌胞外蛋白的提取方法及嗜酸乳杆菌胞外蛋白的应用。
【背景技术】
[0002]长期以来，益生菌均被认为“通常比较安全”的，但从治疗作用考虑而选择的益生菌株通常对肠上皮细胞具有较好的黏附能力，而这一特性也导致细菌易位的可能性增加。临床上已有益生菌在一些免疫力低下的个体中引起菌血症、感染性心内膜炎与肝脓肿的报道。因此，益生菌虽已进入临床应用，但用药的剂量、时机、疗程、安全性等诸多问题仍有待研究明确。
[0003]嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物。自二十世纪八十年代中期，随着嗜酸乳杆菌降低人体胆固醇水平能力的报道，人们开始重视其保健功能的研究，包括改善和调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等健康促进效果。嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸及耐胆汁盐能力，是少有的能顺利通过胃肠道环境，并能发挥益生保健作用的益生菌，其相关研究引起了国内外的关注，必将成为新一代人们重视的一类保健食品。
[0004]经最新的研究证实，某些益生菌胞外蛋白具有增强黏膜屏障、免疫调节、维持肠道稳态的功能，在一定程度上可以改善、缓解肠道疾病。因此胞外蛋白可以作为功能性食品用于肠道疾病的生物免疫治疗，为解决肠道疾病等常见、难愈的疾病提供了一条新的、有效的途径。
[0005]目前的益生菌胞外蛋白提取方法涉及到试剂沉淀法制备、离心分离和层析分离提取等方法。现实的研究水平是由于不同菌种在不同的培养基培养所分泌的胞外蛋白存在差异，主要是分泌胞外蛋白的水平较低，加之现有的分离纯化益生菌胞外蛋白的方法，不适于规模化制备生产。
【发明内容】
[0006]本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法，该方法能够较高水平地获得乳酸菌分泌的胞外蛋白，制备过程简单，成本低廉，适用于规模化制备生产。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种嗜酸乳杆菌胞外蛋白在用于肠道疾病，特别是IBD、肠易激综合症和预防结直肠癌的生物免疫治疗中的应用。
[0008]本发明通过下述技术方案实现:
[0009]一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法，包括下述步骤:
[0010](I)乳酸菌的培养:将乳酸菌接种于改良番茄汁培养基于37°C厌氧条件下进行培养；所述改良番茄汁培养基的组成为:每100mL水中含有新鲜番茄汁50 — 60mL、酵母浸膏3-7g、牛肉浸膏8-12g、乳糖18-25g、葡萄糖l_4g、吐温60_90mL、醋酸钠6_8g和琼脂粉12-18g，所述改良番茄汁培养基的pH值为6.8 ± 0.2 ;
[0011](2)乳酸菌胞外蛋白的粗提取:刮下步骤(I)中培养的乳酸菌菌苔，转移至pH值为7.2?7.4的磷酸盐缓冲液重悬，之后振荡，离心除菌体，收集上清液；经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液；
[0012](3) Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析:将步骤(2)中得到的乳酸菌胞外蛋白的粗提液进行Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，收集含有蛋白峰的蛋白溶液，得到纯化的乳酸菌胞外蛋白。
[0013]所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌；步骤(3)中收集两个蛋白峰，对步骤(3)中的两个蛋白峰通过SDS-PAGE电泳进行分子量的检测，两个蛋白峰的分子量分别为67KD和37KD。
[0014]所述乳酸菌菌种在改良番茄汁培养基37°C厌氧培养48小时。
[0015]所述培养乳酸菌的改良番茄汁培养基的配制方法为:将新鲜番茄洗净，切碎，置于4°C冰箱中8-12h直到有上清液析出，用纱布过滤得到新鲜番茄汁；按照每100mL水中含有新鲜番茄汁50 - 60mL、酵母浸膏3-7g、牛肉浸膏8_12g、乳糖18_25g、葡萄糖l_4g、吐温60-90mL、醋酸钠6-8g和琼脂粉12_18g配置，之后121°C高压灭菌20min，得到所述改良番茄汁培养基；所得改良番茄汁培养基的pH值为6.8 ±0.2。
[0016]所述乳酸菌胞外蛋白的粗提取的具体方法为:将所述改良番茄汁培养基培养的乳酸菌菌苔刮下，转移至灭菌的PH值为7.2?7.4、浓度为0.01-0.lOmol/L磷酸盐缓冲液中，用漩涡振荡器充分振荡，低温lOOOOr/min离心1min去除菌体，收集上清液；重复洗涤一次，合并上清液，经0.22 μ m的滤膜过滤，所得滤液经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液。所述的低温为4 一 7°C。
[0017]所述Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析分离提取乳酸菌胞外蛋白的条件:检测波长:280nm,柱长:1.6*60 (cm),流速:lmL/min,上样量:2.5mL,洗脱液:0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗脱时间:2.5h,3min—管。
[0018]所述SDS-PAGE电泳检测分子量的方法为:浓缩胶浓度为5.0%，分离胶浓度为12.0%,开始以100V恒压电泳，待被分离物进入分离胶后120V恒压电泳，直至染料距前沿底边0.5cm时，停止电泳；经过染色、脱色，最后电泳凝胶放入凝胶电泳图像分析系统(B1-Rad)中摄像并进行分子量测定。
[0019]一种嗜酸乳杆菌胞外蛋白在用于肠道疾病，特别是IBD、肠易激综合症和预防结直肠癌的生物免疫治疗中的应用。
[0020]一种嗜酸乳杆菌胞外蛋白在抑制HT-29结肠癌细胞生长中的应用。
[0021]本发明具有下述技术效果:
[0022]1、本发明的方法从乳酸菌的培养物中直接分离到两种不同分子量的胞外蛋白，通过培养基组成成分的筛选，使得该菌能够较高水平地分泌胞外蛋白，有利于实现该功能性蛋白质的大规模制备生产，有利于人类的健康。同时，通过对蛋白分离提取的介质及其手段的确定，得到了乳酸菌胞外蛋白。该方法提取胞外蛋白的过程简单，成本低廉。
[0023]2、本发明的方法米用改良的番爺汁培养基培养嗜酸乳杆菌，由于该培养基中所制备具特征的番茄汁作为该菌的增殖促进剂，使得通过该培养基培养的嗜酸乳杆菌菌量明显提闻。
[0024]3、本发明的方法中，采用在固体培养基上刮下菌苔的再配置菌悬液的方法，避免了培养基中蛋白对嗜酸乳杆菌分泌胞外蛋白的影响，可以得到纯度更高的胞外蛋白。
[0025]4、本发明中采用凝胶层析技术，其操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，分离后所得到的蛋白仍具有较高的生物活性，使用简单，并且回收率比较高。
[0026]5、本发明的方法所得嗜酸乳杆菌分泌胞外蛋白可以用于肠道疾病的生物免疫治疗中，并对HT-29结肠癌细胞生长具有抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白的凝胶层析图谱；
[0028]图2所示为SDS-PAGE电泳结果；
[0029]图3所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白质相对分子量的测定；
[0030]图4所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞p38和p-p38蛋白的影响WesternBlott ing 图；
[0031]图5所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞ERK和ρ-ERK蛋白的影响WesternBlott ing 图；
[0032]图6所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞JNK和p-JNK蛋白的影响WesternBlott ing 图；
[0033]图7所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞ρ-Akt蛋白的影响Western Blotting 图；
[0034]图8所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞PI3K蛋白的影响Western Blotting 图。
【具体实施方式】
[0035]以下结合以嗜酸乳杆菌为具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0036]实施例1
[0037](I)改良番爺汁培养基的制备:
[0038]将新鲜番茄洗净，切碎，置于4°C冰箱中8_12h直到有上清液析出，用纱布过滤得到新鲜番茄汁；按照每100ml水中含有新鲜番茄汁50 - 60mL、酵母浸膏3_7g、牛肉浸膏8-12g、乳糖18-25g、葡萄糖l_4g、吐温60-90mL、醋酸钠6-8g和琼脂粉12_18g配置，之后121°C高压灭菌20min，得到改良番茄汁培养基。所述改良番茄汁培养基的pH值为6.8±0.2。
[0039](2)用改良番爺汁培养基培养嗜酸乳杆菌:
[0040]将嗜酸乳杆菌菌种((Lactobacillus acidophilus,CICC 6005):购自中国工业微生物菌种保藏中心)接种在步骤(I)所得的改良番茄汁培养基中，置于37°C培养箱中厌氧培养48小时。
[0041](3)嗜酸乳杆菌胞外蛋白的粗提取:
[0042]将步骤(2)中改良番茄汁培养基培养的嗜酸乳杆菌菌苔刮下，转移至灭菌的pH值为7.2?7.4、浓度为0.01-0.lOmol/L磷酸盐缓冲液中，用漩涡振荡器充分振荡，低温(4 - 7°C ) 10000r/min离心lOmin，去除菌体，收集上清液。重复洗涤一次，合并上清液，过0.22 μ m的滤膜，经透析除盐、浓缩得到嗜酸乳杆菌分泌的胞外蛋白粗提液。
[0043](4) Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析:将步骤(3)获得的嗜酸乳杆菌分泌的胞外蛋白粗提液进行Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析纯化，收集含有两个蛋白峰的蛋白溶液，得到两种纯化的嗜酸乳杆菌胞外蛋白。Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析的条件为:柱长:
1.6*60 (cm),流速:lml/min,上样量:2.5ml,洗脱液:0.05mol/L磷酸盐缓冲液,洗脱时间:
2.5h, (3min 一管)。
[0044](5) SDS-PAGE电泳:对步骤(4)中的两个蛋白峰进行分子量的检测:浓缩胶浓度为5.0% ,分离胶浓度为12.0%，开始以100V恒压电泳，待被分离物进入分离胶后120V恒压电泳，直至染料距前沿底边0.5cm时，停止电泳；经过染色、脱色，最后电泳凝胶放入凝胶电泳图像分析系统(B1-Rad)中摄像并进行分子量测定。两个蛋白峰中，A峰的分子量为67KD和B峰的分子量为37KD。
[0045]嗜酸乳杆菌胞外蛋白的凝胶层析图谱如图1所示，从左到右的蛋白峰分别为A峰和B峰。SDS-PAGE电泳结果如图2所示，蛋白质相对分子量的对数与其迁移率的标准曲线如图3所示。图2中，I泳道为标准蛋白分子量(Marker) ；2泳道为胞外蛋白的粗提液；3泳道为分离纯化的胞外蛋白A ；4泳道为分离纯化的嗜酸乳杆菌胞外蛋白B。
[0046](6)两种嗜酸乳杆菌胞外蛋白的应用试验:
[0047]将步骤(4)中提取的两种嗜酸乳杆菌胞外蛋白作用于处于生长对数期的HT-29人结肠癌细胞试验:
[0048]㈠试验分组:
[0049]对照组:只有HT-29细胞
[0050]37KD胞外蛋白组:HT-29细胞+37KD胞外蛋白
[0051]67KD胞外蛋白组:HT-29细胞+67KD胞外蛋白
[0052]检测HT-29细胞增殖抑制率时，67KD胞外蛋白组剂量设0.001 μ g/ml、0.01 μ g/ml、0.1 μ g/ml、I μ g/ml 4 个浓度组；37KD 胞外蛋白组剂量设 0.001 μ g/ml、0.01 μ g/ml、0.1 μ g/ml、I μ g/ml 4个浓度组。采用MTT法观察不同浓度的胞外蛋白在不同时间段(12h、24h、48h、72h)对HT-29细胞生长的抑制率。
[0053]㈡试验过程:
[0054]①将HT-29细胞稀释到1000cel I s/ml接种到96孔板中，每孔100 μ L，放于培养箱中37°C，5% CO2条件下培养。空白组只加完全培养基(该培养基由10%的FBS和90%的DMffl组成)。
[0055]②12h后，细胞贴壁，吸弃培养液。将胞外蛋白用完全培养基配成不同浓度溶液，分别加到对应的孔中，每组6个复孔。
[0056]③在培养箱中培养24h后，每孔中加入20 μ L MTT溶液，放于培养箱中孵育4h。
[0057]④吸弃孔中液体，每孔中加入100 μ L 二甲基亚砜(DMSO)，在振荡器上震荡5?1min,溶解结晶体,在490nm下测定吸光度值。计算抑制率。
[0058]⑤计算抑制率:抑制率(IR% ) = (1-加药组OD值/对照组OD值)X 100%。
[0059]⑥67KD和37KD胞外蛋白对HT-29细胞的生长呈现明显的剂量依赖关系和时间依赖效应，67KD胞外蛋白作用于HT-29细胞48h后，抑制率达到38.41 %，37KD胞外蛋白作用于HT-29细胞48h后，抑制率达到45.06%。
[0060]⑦本实施例嗜酸乳杆菌分泌的两种胞外蛋白对HT-29细胞的抑制作用的机理的试验，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测对HT-29细胞相关信号通路中关键蛋白的表达水平的鉴定，试验结果如图4-8所示。
[0061]图4为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞p38和p_p38蛋白的影响Western Blotting 图，图中，C:对照组；A1(67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；A2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；A3(67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；A4 (67KD):1 μ g/ml 胞外蛋白组；BI (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；B2(67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；Β3 (67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；B4(67KD):1 μ g/ml胞外蛋白组。
[0062]图5为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞ERK和p-ERK蛋白影响的Western Blotting 图谱，图中:C:对照组；A1 (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；A2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；A3(67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；A4 (67KD):1 μ g/ml 胞外蛋白组；BI (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；B2(67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；Β3 (67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；B4(67KD):1 μ g/ml胞外蛋白组)。
[0063]图6所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞JNK和p-JNK蛋白影响的WesternBlott ing 图谱，图中:C:对照组；A1 (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；A2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；A3(67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；Α4 (67KD):1 μ g/ml 胞外蛋白组；B1 (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；B2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；B3 (67KD):0.1 μ g/ml胞外蛋白组；B4(67KD):1 μ g/ml胞外蛋白组。
[0064]图7所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞ρ-Akt蛋白影响的Western Blotting 图谱，图中:C:对照组；A1 (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；A2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；A3(67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；A4 (67KD):1 μ g/ml 胞外蛋白组；BI (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；B2(67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；Β3 (67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；B4(67KD):1 μ g/ml胞外蛋白组。
[0065]图8所示为嗜酸乳杆菌胞外蛋白对HT-29细胞PI 3K蛋白影响的Western Blotting 图谱，图中:C:对照组；A1 (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；A2 (67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；A3(67KD):0.1μ g/ml 胞外蛋白组；A4(67KD):1 μ g/ml 胞外蛋白组；BI (67KD):0.001 μ g/ml 胞外蛋白组；B2(67KD):0.01 μ g/ml 胞外蛋白组；Β3 (67KD):0.1 μ g/ml 胞外蛋白组；B4(67KD):1 μ g/ml胞外蛋白组。
[0066]本发明通过两种胞外蛋白对MAPK信号通路和PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的作用，研究确定了嗜酸乳杆菌分泌的两种胞外蛋白在一定程度上抑制HT-29细胞中MAPK的磷酸化程度，下调p-ERKl/2、p-p38蛋白的表达，但对p-JNK蛋白的表达没有影响，同时也影响HT-29细胞中PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达，下调p_Akt、PI3K蛋白的表达。从而推断出，嗜酸乳杆菌胞外蛋白抑制HT-29结肠癌细胞生长机制可能与调控MAPK和PI3K-Akt两个通路相关。
[0067]本发明提供的是一种通用的从乳酸菌提取胞外蛋白的方法，未来在益生菌胞外蛋白的科学研究、益生菌功能性成分的生产以及益生菌专有药品的制造均具有很好的可行性和开发前景。
[0068]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)乳酸菌的培养:将乳酸菌接种于改良番茄汁培养基于371厌氧条件下进行培养；所述改良番茄汁培养基的组成为:每10001水中含有新鲜番茄汁50 — 60此、酵母浸膏3-78、牛肉浸膏8-128、乳糖18-258、葡萄糖1-?、吐温60-90此、醋酸钠6-?和琼脂粉12-18&所述改良番茄汁培养基的邱值为6.8±0^ 2 ； (2)乳酸菌胞外蛋白的粗提取:刮下步骤(1)中培养的乳酸菌菌苔，转移至邱值为7.2?7.4的磷酸盐缓冲液重悬，之后振荡，离心除菌体，收集上清液；经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液； (3)86^6^「100葡聚糖凝胶层析:将步骤(2)中得到的乳酸菌胞外蛋白的粗提液进行36汕^161 6-100葡聚糖凝胶层析，收集含有蛋白峰的蛋白溶液，得到纯化的乳酸菌胞外蛋白。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌；步骤⑶中收集两个蛋白峰，对步骤⑶中的两个蛋白峰通过电泳进行分子量的检测，两个蛋白峰的分子量分别为671(0和37X0。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述乳酸菌菌种在改良番茄汁培养基371厌氧培养48小时。
4.根据权利要求2所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述培养乳酸菌的改良番茄汁培养基的配制方法为:将新鲜番茄洗净，切碎，置于41冰箱中8-121！直到有上清液析出，用纱布过滤得到新鲜番茄汁；按照每10001水中含有新鲜番茄汁50 — 60此、酵母浸膏3-78、牛肉浸膏8-128、乳糖18-258、葡萄糖1-知、吐温60-904、醋酸钠6-?和琼脂粉12-1?配置，之后1211高压灭菌得到所述改良番茄汁培养基；所得改良番茄汁培养基的邱值为6.8±0丨2。
5.根据权利要求2所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述乳酸菌胞外蛋白的粗提取的具体方法为:将所述改良番茄汁培养基培养的乳酸菌菌苔刮下，转移至灭菌的邱值为7.2?7.4、浓度为0.01-0.10^1/1磷酸盐缓冲液中，用漩涡振荡器充分振荡，低温1000017111111离心10111111去除菌体，收集上清液；重复洗涤一次，合并上清液，经0.22 9 ！！！的滤膜过滤，所得滤液经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液。
6.根据权利要求2所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述36汕^1#1.6*60 (挪)，流速上样量:2.50[，洗脱液:0.05^01/1磷酸盐缓冲液，洗脱时间:2.511, 3111111 一管。
7.根据权利要求2所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述八⑶电泳检测分子量的方法为:浓缩胶浓度为5.0%，分离胶浓度为12.0%，开始以1007恒压电泳，待被分离物进入分离胶后1207恒压电泳，直至染料距前沿底边0.50.11时，停止电泳；经过染色、脱色，最后电泳凝胶放入凝胶电泳图像分析系统中摄像并进行分子量测定。
8.根据权利要求5所述的乳酸菌胞外蛋白的提取方法，其特征在于，所述的低温为4一7。。。
9.一种权利要求2所得的嗜酸乳杆菌胞外蛋白在用于肠道疾病，特别是180、肠易激综合症和预防结直肠癌的生物免疫治疗中的应用。
10.一种权利要求2所得的嗜酸乳杆菌胞外蛋白在抑制HT-29结肠癌细胞生长中的应用。
【文档编号】A61P1/00GK104388503SQ201410680804
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】陈庆森, 任效东, 阎亚丽 申请人:天津商业大学