有序修复材料及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种有序的生物修复材料及其制备方法和用途。

背景技术：

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重的神经系统创伤，具有高度的致残性。如今，中枢神经损伤后的神经修复被证明是可能的，然而常规的手术手段只能使这些伤者中的极少数人彻底康复。多项研究表明，脊髓内部微环境不适合是造成脊髓再生能力十分有限的主要原因。脊髓损伤后在很短的时间内，在受损部位形成了空洞和疤痕，在这样一个不利的环境下，轴突即使能够生长，也很难逾越这样的一个障碍。目前，对于脊髓损伤，应用生物支架来桥接损伤两侧的脊髓，结合神经营养因子或药物或干细胞，从而促进轴突再生是一个重要的治疗策略。在制备用于神经再生的生物支架材料时，材料的取向性非常重要，因为脊髓神经纤维(轴突)的生长是有方向的。目前，神经损伤修复材料主要由化学合成的材料制成，它们往往细胞相容性不好，容易引起免疫排斥问题。

此外，肌腱损伤是最常见的运动损伤，损伤机率高，致残率也高。肌腱损伤后，若未予以及时修复，常会导致肢体功能障碍，重者甚至残废。对于较严重的肌腱损伤往往需要手术干预，对于缺损性肌腱损伤往往需要植入修复体，如：自体肌腱、同种异体肌腱、异种肌腱或人工肌腱。前三者由于移植体来源有限或者排异反应等诸多原因，不能满足临床治疗需求，因此开发人工肌腱具有重要现实意义。肌腱独特的生物力学性能主要归因于肌腱细胞外基质(ECM)的高度组织性。细胞外基质主要由I型胶原蛋白构成，肌腱中的ECM呈等级束状且分不同层面平行地排列在基质蛋白中，棱形的肌腱成纤维细胞(也称肌腱细胞)呈纵向排列且大量鞘样细胞延伸至细胞外基质。I型胶原可以诱导肌腱胞外基质的形成增加410％。因此，基于胶原的并有一定取向性的材料是用于肌腱损伤修复的良好材料。

牛的肌肉表面存在一层保护组织，通常称为筋膜，属于肌腱的延伸部分，其主要成分与肌腱一样，由I型与III型胶原纤维构成。这种材料具有平行排列的纤维状结构，如图1所示，有可能作为一种合适的神经导向材料和肌腱修复材料。

技术实现要素：

一方面，本发明涉及一种制备有序修复材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氢氧化钠溶液中处理；

(2)使所得物在去污剂溶液中处理；

(3)使所得物干燥。

在实施方式中，筋膜可以取自哺乳动物，例如牛、羊、马等，优选为牛。筋膜是新鲜的筋膜。

在实施方式中，在步骤(1)之前，除去筋膜组织上粘附的组织，例如肌肉组织等。在实施方式中，还包括在步骤(1)之前去除筋膜组织中的脂肪。

在实施方式中，氢氧化钠溶液可以是氢氧化钠的水溶液。氢氧化钠溶液的浓度可以是约2～5N，例如约2N、3N、4N或5N。步骤(1)可以在约4℃～16℃进行，例如约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或16℃。此外，步骤(1)可以进行约30分钟至300分钟，例如约30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、150分钟、300分钟等。在步骤(1)中，可以更换新的氢氧化钠溶液，例如更换2～4次新的氢氧化钠溶液。

在实施方式中，步骤(2)中的去污剂可以是化学去污剂，例如吐温-80、吐温-20、TritonX-100等。去污剂溶液的浓度可以是约1～5％，例如约1％、2％、3％、4％、5％等。去污剂的溶液可以是去污剂的水溶液、缓冲液溶液等，其中缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等。

在实施方式中，在步骤(3)之前，对所得物进行充分清洗。其中，可以用去热源水对材料进行清洗；也可以用其他水例如蒸馏水、去离子水进行清洗。

在实施方式中，在步骤(3)中，可以采用低温干燥使所得物干燥，例如冷冻真空干燥等。在所得物干燥之后，可以进行灭菌，例如辐照灭菌等。

另一方面，本发明提供由上述方法制备得到的有序修复材料，其为线性胶原纤维。该线性胶原纤维包含I型胶原纤维和III型胶原纤维，其保留有天然胶原纤维的结构，并可以根据需要聚集成不同直径的束状，也可以修剪成任意形状和长度。此外，这些线性纤维具有利于细胞贴附的粗糙表面，并具有良好的生物相容性和生物可降解性。而且，在细菌和病毒杀灭方面更彻底，且排异反应更小。

再一方面，本发明提供本文有序修复材料作为组织修复材料的用途。

在实施方式中，本发明的有序修复材料可以用于组织的修复，尤其是神经和肌腱的修复。

本发明以天然筋膜为基础，用NaOH处理结合常见的去污剂处理，即可以以简单的处理工艺在短时间内得到有序排列的线性胶原纤维。NaOH处理可以有效杀灭细菌和病毒，并且减少最终产品的排异反应。这些线性胶原纤维保持有天然胶原纤维的结构，可以根据需要构成任意长度的片状或任意直径和长度的束状。此外，这些线性胶原材料具有可以引导神经细胞和成纤维细胞等在胶原纤维方向上生长的有序方向性、利于细胞粘附的粗糙纤维表面、应用于有机体的良好的生物相容性和生物可降解性。因此，本发明的线性胶原纤维可以用作组织修复材料，特别是用作神经修复材料和肌腱修复材料。

附图说明

图1示出天然牛筋膜的平行排列的纤维状结构。

图2A示出根据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维的宏观外观图，其中图下方为cm尺，可见纤维长为约7cm，图2B示出根据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维的扫描电镜图。

图3A示出大鼠背根神经节神经元在普通培养平皿中的轴突生长方向，图3B示出大鼠背根神经节神经元在根据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维上的轴突生长方向，图3C示出大鼠小脑颗粒细胞在根 据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维上的生长情况，其中各图中的标尺均为200μm。

图4A示出大鼠间充质干细胞在根据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维上的生长情况，图4B示出人成纤维细胞在根据本发明示例性实施方式的线性胶原纤维上的生长情况，其中各图中的标尺均为200μm。

具体实施方式

天然筋膜的结构紧密，成分较为复杂，不适合细胞的贴附和生长，而且有引起机体免疫排斥的风险。

本发明通过氢氧化钠消蚀与去污剂处理的结合，除去筋膜中的细胞成分并保留细胞外基质，得到具有有序结构、良好的生物相容性和良好的生物可降解性的线性胶原纤维。而且，这种线性胶原纤维在细菌和病毒杀灭方面更彻底，且排异反应更小。

本发明人发现，氢氧化钠和去污剂均可以起到脱细胞的作用，但强度不同。去污剂例如吐温-80、TritonX-100的处理较为柔和，一般不破坏细胞外基质的天然结构和成分，但是处理时间较长，且会损失一部分细胞外基质中的蛋白。而NaOH的作用更为剧烈，但是由于比较容易洗去，没有在最终产品上的残留问题，对修复的组织和细胞没有毒性。两种处理的结合可以较好地去除筋膜的抗原性，并保留其I型和III型胶原纤维，主要保留I型胶原纤维。比起单独去污剂的处理，NaOH的在先处理可以有效杀灭细菌和病毒，并且减少最终产品的排异反应。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本发明的产品优于传统方法得到的产品。具体地，本发明提供一种制备有序修复材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氢氧化钠溶液中处理；

(2)使所得物在去污剂溶液中处理；

(3)使所得物干燥。

筋膜可以是取自哺乳动物，例如牛、羊、马等的新鲜筋膜。由于来源较为便利且价廉，而处理后得到的材料没有免疫原性，因此本发明的修复材料可以大量应用于临床。

所使用的氢氧化钠溶液为氢氧化钠的水溶液，浓度可以是约2～5N，例如约2N、3N、4N或5N。当氢氧化钠的浓度小于2N时，脱细胞效果不好，而当浓度大于5N时，对胶原材料的物理性能具有一定破坏作用。步骤(1)可以在约4℃～16℃的低温下进行，优选为约10℃。此外，步骤(1)可以进行30～300分钟，并且优选在此过程中更换新的氢氧化钠溶液，例如更换2～4次新的氢氧化钠溶液。延长的处理时间和溶液的更新可以使处理效果更好，即更好地去除细胞成分。

在步骤(2)中，去污剂的选择要考虑其强度以及其残留对所得材料应用的影响。经测试，吐温-80、吐温-20、TritonX-100可以用在本发明中，并具有良好的效果。而且，本领域技术人员可知，这几种去污剂可以替换使用。去污剂的浓度在约1～5％的范围内，浓度过低会使处理效果变差，而浓度过高会影响材料的性能。此外，去污剂的处理时间和温度可以由本领域技术人员适当确定。

在步骤(3)中，可以采用低温干燥对所得物进行干燥。低温真空干燥可以除去所得物中的水分和溶液残留，完好保持筋膜处理后剩余部分的结构。低温干燥可以通过例如冷冻真空干燥的方法，在冷冻干燥仪中进行。

如果本发明方法的所得物要用于医疗用途，需要对所得物进行充分清洗，并进行杀菌消毒。其中，可以用去热源水对材料进行清洗；也可以用其他水例如蒸馏水、去离子水进行清洗并辐照杀菌。其中，去热源水为不含热源物质的水。去热源水的制备方法为本领域技术人员所知，如用超滤膜、反渗透、层析等方法处理水等而得到。

使用本发明方法制备得到的有序修复材料是线性胶原纤维。该线性胶原纤维保留有天然胶原纤维的结构，可以根据要求随意聚集成不同直径的束状，也可以修剪成任意长度，方便用于任意大小和任意部位的组织修复。

本发明的线性胶原纤维还具有方向性。这种方向性对于神经纤维和肌腱成纤维细胞的生长尤其重要。其中，神经纤维(轴突)的方向性是准确有效传送神经脉冲的基础，而本领域人员已知肌腱的成纤维细胞呈纵向排列。本发明的线性胶原纤维不仅给神经纤维和肌腱成纤维细胞的生长提供支持，还可以与药物等结合使用来促进两种细胞的 生长。

另外，本发明的有序修复材料具有良好的生物相容性。本发明的有序修复材料由I型和III型天然胶原蛋白构成，主要为I型胶原蛋白，没有免疫原性，因此可以应用到组织修复中。在损伤的脊髓中，本发明的胶原材料可以搭接损伤脊髓的两侧，为轴突的生长提供支持，并且可以结合神经营养因子或药物等促进神经再生。而本发明神经纤维的粗糙表面，有利于细胞的贴附。此外，已经证实，肌腱的独特生物力学性能主要归因于肌腱细胞外基质的高度组织性，而本发明的有序修复材料中包含的I型胶原可以诱导肌腱细胞外基质的形成增加410％。

目前用于组织损伤修复的胶原生物材料，主要从酸溶的胶原制备，工艺复杂，步骤较多，而且主要以无序的管状和胶原凝胶为主。本发明的加工方法，以机体天然筋膜为基础，利用独特的处理工艺，开发出可用于脊髓和肌腱损伤修复的新材料，其对细胞具有良好相容性，免疫原性低。更重要的是，这种材料可以使神经元或肌腱再生种子细胞沿着胶原纤维的方向有序生长，这对于肌腱及脊髓损伤的修复非常重要。因此，本发明的有序修复材料具有很好的临床应用前景。

以下提供本发明的具体实施例，实施例仅为示例说明本发明，而并不限制本发明的范围。

制备例.线性胶原纤维的制备

1.取新鲜带有白色筋膜的成年牛的肌肉组织，用10℃去离子水冲洗3遍；

2.用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织；

3.将外层的脂肪、附着的肌肉血管组织去除后，用氢氧化钠水溶液处理(氢氧化钠的摩尔浓度、温度和处理时间见以下表格)；

4.更换新的氢氧化钠溶液(摩尔浓度、温度和处理时间与上一步保持一致)，该步骤重复次数见以下表格；

5.用去污剂溶液(去污剂的种类、浓度和溶剂见以下表格)在16℃下处理60分钟；

6.用去热源水对材料进行充分清洗；

7.将材料用冷冻干燥仪冻干。

参照以下表格，按照上述步骤进行线性胶原纤维的制备。

在步骤1中采用来自成年羊的肌肉组织，如上进行制备例14～26；在步骤1中采用来自成年马的肌肉组织，如上进行制备例27～36。

制备比较例.仅使用去污剂制备线性胶原纤维

1.取新鲜带有白色筋膜的成年牛的肌肉组织，用10℃去离子水冲洗3遍；

2.用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织；

3.将外层的脂肪、附着的肌肉血管组织去除后，用5％的吐温-20水溶液在16℃下处理60分钟；

4.用去热源水对材料进行充分清洗；

5.将材料用冷冻干燥仪冻干。

得到比较样品1。

实施例1.线性胶原纤维的形态观察

对各个制备例和制备比较例得到的样品进行形态观察。可以看到，各个制备例和制备比较例中得到的线性胶原纤维均可以聚集成束状，如图2A所示，其长度和束状直径可以随意调节，并且呈现出方向性。之后，通过扫描电镜来观察制备例和制备比较例的胶原纤维，其中图2B示出本发明制备例13胶原纤维的其中一根的结构，发现线状胶原纤维具有有序结构，其粗糙的表面结构有利于细胞的贴附。

实施例2.线性胶原纤维的内毒素含量测定

尽管制备例和制备比较例得到的样品在形态上没有差别，但是制备例得到的产品在细菌和病毒杀灭方面更彻底，且排异反应更小。在各制备例样品的浸提液中，内毒素含量<0.5EU/ml，而在将制备比较例样品同样处理得到的浸提液中，内毒素含量>2.5EU/ml。

内毒素检测方法：

浸提液的制备：使用注射水按6cm²/ml比例浸提材料24小时，测试浸提液的内毒素含量。

1、选择所需规格(0.1ml)及灵敏度(0.25EU/ml)的鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司)、细菌内毒素标准品(中国食品药品检定研究所，批号250601-201174)及细菌内毒素检查用水(2ml/支，内毒素含量低于0.003EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取内毒素标准品(冻干品)1支，用水溶解后稀释至所需浓度备用。

3、取鲎试剂8支，2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

4、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水；每支供试品检查管另加入0.1ml样品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素标准品溶液；供试品阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素的样品。

5、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃恒温器中孵育60±2分钟，然后观察结果。试管孵育期间应避免任何震动。

6、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°时，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

7、阴性对照管必须是阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须是阳性，否则实验结果无效。

实施例3.神经元在线性胶原纤维上的生长

分离SD大鼠的背根神经节，分别接种在普通平皿或本发明制备例13的线性胶原纤维上。

具体而言，在解剖显微镜下暴露E15胎鼠的椎管和椎间孔，用镊子将脊髓连带两旁的神经节一起取出，用显微镊逐个摘除神经节。用0.25％(vol/vol)的胰蛋白酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS缓冲液)37℃消化30min，用约2ml血清(invitrogen，10099141)终止反应。300目筛网过滤，1000rpm离心5min收集细胞。PBS(pH 7.4)清洗一遍后，离心收集，用适量DMEM/F12完全培养液(invitrogen,11330032)吹打成单细胞悬液，分别接种在普通平皿或本发明制备例13的线性胶原纤维上。接种后放在二氧化碳培养箱(品牌和型号：HERAcell 150i)中培养(37℃，5％CO₂)。

接种7天后，在显微镜下观察背根神经节球的生长情况。如图3A所示，普通平皿中背根神经节球的轴突四散分布，而在本发明的线性胶原纤维上，背根神经节的轴突沿着胶原纤维的方向有序分布，如图3B所示。

此后，如下所述制备出大鼠的小脑颗粒细胞。出生一周的SD大鼠，延颅骨中缝打开颅骨，分离小脑置于冷的PBS(pH 7.4)中。将分离脑组织的脑膜和血管剥离干净。剪碎脑组织至1mm³的小块。将剪碎的脑组织转移至2mL 0.25％(vol/vol)的胰酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS缓冲液)中，37℃消化15分钟，加入100微升胰酶抑制剂(invitrogen，17075-029)终止消化。5分钟后再加入4mL的DMEM/F121:1基础培养基，用玻璃滴管将组织吹散，转移上清至新离心管中，向剩余的沉淀物中加入4mL的新鲜基础培养基继续吹打，转移上清后再吹打一次。将收集的所有上清和沉淀合并在一起，用40μm的滤膜(BD,352340)过滤。将滤后的液体于500g离心5分钟，去除上清，将沉淀用神经细胞培养基(含2％B27的DMEM-F12)(B27，invitrogen,17504044；DMEM-12，invitrogen,11330032)重悬，计数后接种至添 加有本发明制备例13的线性胶原纤维的包被有多聚赖氨酸(sigma，P0899)的培养皿上。

具体而言，将所得的大鼠小脑颗粒细胞以5×10⁴/mm³的密度接种在本发明的线性胶原纤维上。接种后放在二氧化碳培养箱(品牌和型号：HERAcell 150i)中培养(37℃，5％CO2)。

2天后，可以看到，神经元细胞沿线性胶原纤维的纤维方向生长，呈现出很好的有序性，如图3C所示。

实施例4.大鼠间充质干细胞及人成纤维细胞在线性胶原纤维上的生长

如下所述制备出大鼠间充质干细胞。选取出生后4周的SD大鼠，脱臼处死，75％酒精浸泡5min，在无菌条件下取出双侧胫骨、股骨，然后清除两端骨骺及软组织，在暴露出骨髓腔后，把无血清L-DMEM培养液(HYCLONE，SH3002101B)作为冲洗液，用无菌注射器反复冲洗骨髓至透明为止，然后将所得的冲洗液装入15mL离心管；1000rpm离心5min，弃上清。用10mL无血清L-DMEM培养液重悬细胞，200目滤网过滤成单细胞。使用血球计数板计数，细胞以1×10⁶/mL接种于含10％血清的L-DMEM培养基中。将细胞置于5％CO₂浓度，37℃培养箱内进行培养。24h半量换液，48h全量换液，然后每3天进行培养液的更换。当细胞增殖并逐渐融合到90％时，用0.25％的胰酶进行消化传代，然后以1×10⁶/mL的密度，在培养皿内进行传代，扩增培养。

如下制备得到人成纤维细胞。将人包皮组织用PBS溶液漂洗三次，洗去组织表面附着的血细胞；将包皮组织置于PBS的培养皿中，用眼科剪去除皮肤内表面附着的皮下组织；再将包皮组织置于新的盛有PBS的3.5cm培养皿中，用眼科剪将组织剪成1mm³的组织块；1000rpm离心2min；用1ml DMEM培养基(GIBCO,11330032)重悬组织块，转移至T25培养瓶(Corning，430639)中，用Pasteur管(Fisher，13-678-20A)使组织块均匀分布，并小心吸出多余培养基；将T25培养瓶倒置，放置于37℃培养箱中；约20～24h后，将T25培养瓶翻转，加入1～1.5ml培养基；隔日换液，约3～7日后可见细胞从组织块周围爬出；约10～14日后可进行传代(0.25％TE消化)。

取生长状态良好的大鼠MSC细胞(P3代)或人成纤维细胞(P5代)，0.25％胰酶消化后，将细胞离心后重悬于约1ml DMEM培养基(GIBCO,11330032)中，接种于制备例13的线性胶原纤维上。置于37℃，5％CO₂培养箱中放置4～5h，加入适量DMEM培养基，以淹没线性胶原纤维为宜。之后，继续在培养箱中培养。

2天后，可以在显微镜下观察到，大鼠间充质干细胞(图4A)和人成纤维细胞(图4B)在本发明的线性胶原纤维上沿材料纤维方向良好生长，如图4所示。