提供了使用抗CD40LdAb治疗移植物排斥，特别是肾移植物排斥的方法。还提供了适合的抗CD40LdAb剂量和施用方案。另外，提供了使用抗CD40LdAb和CTLA4抗体的用于移植物排斥，特别是肾移植物排斥的联合治疗。对相关申请的引用本申请要求2014年3月19日提交的美国临时申请号61/955,588的优先权，其特此以其整体并入用于所有目的。对序列表的引用本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并特此通过提述以其整体并入。所述ASCII拷贝，创建于2015年3月19日，命名为200896_522603_SL.txt且大小为30,328字节。发明背景移植是对于终末阶段器官衰竭的疗法，其中在美国每年进行超过25,000例实体器官移植。从近30年前钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂的引入起，由于急性排斥所致的早期移植物失败的几率已经大大降低。然而，长期移植物存活仍然不太理想。免疫和非免疫介导的慢性移植物损伤可以导致同种移植物功能的逐步丧失。慢性移植物损伤可以部分归因于与目前免疫抑制疗法，特别是钙调磷酸酶抑制剂相关联的非免疫副作用。近年来，已经阐明了参与T细胞活化和功能的许多途径，包括牵涉参与T细胞共刺激的细胞表面蛋白的途径。致力于更特异性地抑制T细胞介导的排斥并且避免与目前的免疫抑制剂相关联的副作用，已经开发了针对参与T细胞活化的途径的新的生物试剂。这些试剂之一是抗CD40L抗体。在免疫和炎症反应中，CD40-CD40L相互作用的作用使得它们成为用于病原性免疫-炎症过程的治疗中有希望的靶标。通过特异性CD40L单克隆抗体(mAbs)对CD40-CD40L相互作用的阻断在灵长类中成功地预防了同种移植物排斥，并在动物模型中治疗了自身免疫病和动脉粥样硬化。Montgomery等，Transplantation74:1365-1369(2002)。在人中，在临床试验中已经使用了两种不同的抗CD40L单克隆抗体(mAb)，用于不同自身免疫病的治疗。Maribelet等，Mol.Immunol.45:937-44(2008)。然而，单克隆抗体可以显示高得不寻常的血栓栓塞(TE)并发症，如动脉粥样硬化性中枢神经系统事件，心肌梗塞，肺栓塞和深静脉血栓的发生率。例如，抗CD40LmAb克隆hu5c8(抗CD40LmAb，Biogen)的有用性受限于高得不寻常的的TE并发症的发生率。由这些抗体诱导的TE并发症认为是源自形成mAb与血小板上的膜结合CD40L，或从血小板上脱落的sCD40L的高阶免疫复合物(IC)，其可以通过它们的FcgRIIa受体连接并从而聚集邻近的血小板，导致血栓形成。血栓栓塞的风险已经导致所有正在进行的临床试验的停止。Boumpas等，Arthritis&Rheumatism48:719-727(2003)因此，本发明通过提供使用靶向靶向CD40L，但不引起例如血栓栓塞(TE)的域抗体治疗移植物排斥的方法，满足了本领域中的需要。发明概述对于临床用途，仍然需要治疗移植物排斥，特别是肾移植物排斥的方法，其不引起血栓栓塞(TE)或具有较低的血栓栓塞(TE)风险。此类方法可以包括抗CD40L抗体拮抗物的剂量方案和施用途径，所述抗CD40L抗体拮抗物不大可能引起血小板聚集且从而不大可能引起血栓栓塞。治疗肾移植物排斥的方法可以包括向有此需要的患者施用治疗有效量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。移植物排斥可以是急性移植物排斥或慢性移植物排斥。治疗肾移植物排斥的方法可以包括施用剂量从约2至约30mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。治疗肾移植物排斥的方法还可以包括施用剂量在约20至30mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。肾移植物排斥的治疗方法可以包括使用剂量约20mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)可以与免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂一同施用。免疫抑制，免疫调节和/或抗炎剂可以是CTLA4突变体分子。CTLA4突变体分子可以是L104EA29Y-Ig(贝拉西普(Belatacept))。可以以剂量从约10至约20mg/kg患者重量施用L104EA29Y-Ig(贝拉西普)。或者，可以以剂量为约20mg/kg患者重量施用L104EA29Y-Ig(贝拉西普)。在治疗方案的持续期间，可以按周(onaweeklybasis)施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。在治疗方案持续期间，可以按周与BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)一同施用免疫抑制，免疫调节和/或抗炎剂。治疗方案的持续时间可以为约70天。可以静脉内施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。可以静脉内施用免疫抑制，免疫调节和/或抗炎剂。可以单独，或者与用于治疗肾移植物排斥的常规疗法组合施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。用于与BMS2h-572-633-CT-L2一同使用的示例性常规疗法是抗IL-2R抗体，甲强龙(solumedrol)和吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil,MMF)的组合。然后，可以随着时间逐渐停止(taperoff)常规疗法，如患者进展所指示。免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂可以是抗CD28dAb。抗CD28dAb可以包括SEQIDNO:26，其可以任选地是PEG化的(pegylated)。抗CD28dAb的一个例子是BMS-931699(另外也称作1h-239-891(D70C)P30L-PEG或239-891-D70CP30LPEG)，其为PEG化的抗CD28dAb。该PEG部分可以是40kDa支链聚乙二醇。可以以约1mg/kg至约10mg/kg患者重量的剂量与BMS2h-572-633-CT-L2组合施用抗CD28dAb。一个示例性剂量是约3mg/kg的抗CD28dA并可以以每周间隔施用。或者，可以认为本文中描述的方法是BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)用于制备在有此治疗需要的患者中治疗肾移植物排斥的药物的用途。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的用途可以应用于上文和下文所述的任意方法和组合。附图简述图1A以带(ribbon)形式描绘了域抗体，其包含融合至来自阿巴西普(Abatacept)IgG1的经修饰的Fc尾的VH可变域BMS2h-572-633。图1B示出了BMS2h-572-633-CT-L2的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，包含可变域BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)。该Fc融合蛋白是分子量77,984道尔顿的二聚体，其中每条多肽链由354个氨基酸组成。通过接头将可变域融合至人IgG1的突变Fc构建体，其中使用丝氨酸取代三个半胱氨酸残基，并使用丝氨酸残基取代一个脯氨酸(SEQIDNO:3)。图2提供了N末端氨基酸序列(分别为SEQIDNO:1356-1361，连接至接头的各种Fc域的顶部至底部。接头区域在方框中示出。图3示出了各种Fc形式的域抗体的例子(分别为SEQIDNOS1362-1365，按出现的顺序)。方框指示接头区域。图4描绘了在25℃，12.5-0.39nMBMS-986004(2:1系列稀释)结合至在链霉亲合素SPR传感器芯片上捕获的biot-IZ-hCD40L的SPR传感图数据。彩色线示出了双重参照(double-referenced)传感图数据，而黑线示出了对数据的1:1Langmuir拟合，其中亲合力影响的表观Kd为0.11nM。图5示出了19μMIZ-hCD40L向2μMBMS-986004中(黑色)或18μMBMS-986004向2μMIZ-hCD40L中(蓝色)滴定的ITC数据。限定每摩尔IZ-hCD40L三聚体和每摩尔二价BMS-986004Fc二聚体的摩尔比率(表观化学计量)。在横坐标上以等当点(equivalencepoints)获得的摩尔比率值提示大于1摩尔的BMS-986004可以结合每摩尔IZ-hCD40L三聚体；然而，单独从ITC数据不能确定该复合物的精确结构模型。正方形表示结合数据的整合热(integratedheat)，而实线表示“2组位点模型(2setsofsitesmodel)”的最佳拟合。图6示出了小鼠CD40L替代(surrogate)dAb-Fc(KLH诱导的抗体反应)2组)的体内效力。图7证明了小鼠dAbBMS-2m-126-24-Fc和抗体MR-1抑制小鼠中TNBS诱导的结肠炎(4组)。图8示出了BMS-2m-126-24-Fc和CTLA4-Ig协同作用以延长心脏同种移植物的存活。图9A示出了在猴中11mg/kgIV给药后BMS-986004的血浆浓度对时间概况。图9B表明了在猴子中2mg/kgIV给药后BMS-986003的血浆浓度对时间概况。图10呈现了BMS-986003(在猴中以0.2,2.0和20mg/kgSC给药后)和5c8IgG1(在猴中以20mg/kgIV给药后)的血浆浓度对时间概况。图11示出了在小鼠中1mg/kgIV和SC给药，和10mg/kgSC给药后，BMS-2m-126-24-CT的血浆浓度对时间概况。图12表明了BMS-986003和5c8-IgG1血浆暴露和抗KLH抗体反应(IgG滴度)的PK/PD建模(4组)。图13示出了BMS-986004血浆暴露的PK/PD建模(左边)和对外周血单核细胞(PBMC)的离体RO(右边)。图14表明了IV.3阻断了5c8/sCD40LIC介导的人血中血小板的活化。图15示出了Fc变体对人血中血小板活化的影响。图16证明了来自人供体的血液中用5c8-CT/sCD40LIC对血小板的活化，所述人供体对于FcgRIIa多态性基因型分型。图17图解了在来自人供体的血液中，通过多种抗体的血小板活化。图18示出了在表达hFcgRIIa的转基因小鼠中，通过多种抗体，包括BMS-986003的血小板活化的水平。图19呈现了使用高剂量(20mg/kg静脉内)的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲线。图20呈现了使用中等剂量(10mg/kg静脉内)的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲线。图21呈现了使用低剂量(2mg/kg静脉内)的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲线。图22呈现了使用高剂量(30mg/kg静脉内)的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲线。图23呈现了使用高剂量(20mg/kg静脉内)的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴子的血清肌酸酐(mg/dL)曲线。图24呈现了流式细胞仪图，示出了使用20mg/kgBMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的肾移植猴中，外周血中的白细胞组分(免疫表型)和与免疫活化一致的其它外周血细胞标志物(CD3+,CD4+,CD8+T细胞)。图25呈现了图24的细胞术图的流式组(flowpanels)。图26示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内处理的肾移植猕猴(rhesusmonkey)的外周血中CD4+/CD8+未免疫T细胞组分。图27示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内处理的肾移植猕猴的外周血中CD4+/CD8+记忆T细胞组分。图28示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内处理的肾移植猕猴的外周血中CD4+/CD8+记忆T细胞组分。图29示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内和20mg/kg的贝拉西普处理的肾移植猕猴的外周血中CD4+/CD8+未免疫的T细胞组分。图30示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内和20mg/kg的贝拉西普处理的肾移植猕猴的外周血中CD4+/CD8+记忆T细胞组分。图31示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)静脉内和20mg/kg的贝拉西普处理的肾移植猕猴的外周血中CD4+/CD8+记忆T细胞组分。图32表明了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)处理的猕猴中巨细胞病毒(CMV)病毒再活化率(拷贝/mL)。发明详述提供了使用特异性结合人CD40L的抗体多肽的治疗移植物排斥的方法。抗体多肽不太可能引起血小板聚集并因此不太可能引起血栓栓塞。如本文所使用的，“特异性结合”指抗体多肽以解离常数(Kd)为约1μM或更低结合抗原，如通过例如表面等离振子共振(SPR)测量的。适合的测定系统包括BIAcoreTM表面等离振子共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，版本2.1)。对于特异性结合相互作用的亲和力或Kd可以是约1μM或更低，约500nM或更低，或约300nM或更低。术语“约”将为本领域的普通技术人员所理解且在使用该术语的情形下将有一定程度的变化。一般而言，约涵盖所提及值加上/减去10％的数值范围。根据此详细描述，以下缩写及定义适用。须注意，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”及“该”包括复数个提及物，除非上下文另外明确规定。因此，举例而言，提及“抗体”包括复数个此类抗体，且提及“该剂量”包括提及一个或多个剂量及本领域的技术人员已知的其等同物，等等。如本文所使用的，“BMS-986004”指代二聚体融合多肽，由抗体多肽的两个分子构成，所述抗体多肽具有连接到dAbBMS2h-572-633的C末端的IgG1的经修饰的Fc片段，所述连接通过具有氨基酸序列AST的接头序列。BMS2h-572-633dAb具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。BMS2h-572-633dAb的示例性编码序列为SEQIDNO:27。经修饰的Fc片段具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。见图1A和1B。本文使用的BMS-986004的其它名称包括BMS2h-572-633-CT-L2,2h-572-633-CT-L2,BMS2h-572-633-CT-长,和2h-572-633-CT-长。应当理解本文列出的范围之间的任何或全部整个或部分整数包括在本文中。1.CD40L及CD40L活性提供结合人类CD40L的抗体多肽。CD40L也称为CD154、gp39、TNF相关活化蛋白(TRAP)、5c8抗原或T-BAM。可以在例如UniProt登录号P29965下发现人类CD40L的相关结构信息。“人类CD40L”是指包含以下氨基酸序列的CD40L：(SEQIDNO:3)CD40L也已在野猪(Susscrofa)、小家鼠(Musmusculus)、家犬(Canisfamiliaris)、Bosffini、猕猴(Macacamulatta)、夜猴(Aotustivirgatus)、普通狨(Callithrixjacchus)、白领灰须白眉猴(Cercocebustorquatusatys)、豚尾猴(Macacanemestrina)、挪威鼠(Rattusnorvegicus)、原鸡(Gallusgallus)、家猫(Feliscatus)及野猪(Susscrofa)中测序。本发明的抗体多肽与CD40L的结合拮抗CD40L活性。“CD40L活性”包括(但不限于)与APC上的MHC分子对T细胞受体的刺激联合共刺激及活化APC、在细胞因子存在下分泌所有免疫球蛋白同种型、刺激B细胞增殖、细胞因子产生、抗体类别转换及亲和力成熟。举例而言，具有X连锁高IgM综合征(X-linkedhyper-IgMsyndrome)的患者在其B细胞上表达功能性CD40，但其活化的T细胞具有缺陷的CD40L蛋白，导致其不能活化B细胞且诱导免疫球蛋白同种型转换。Aruffo等人，Cell72:291-300(1993)。CD40L活性可通过与其它分子相互作用而介导。“CD40活性”包括CD40L与以下分子之间的功能性相互作用：CD40(CD40L受体)、α5β1整合蛋白及αIIbβ3。举例而言，CD40L结合其受体CD40，CD40在多种APC(诸如B细胞、巨噬细胞及树突细胞)上以及在基质细胞、血管内皮细胞及血小板上表达。如本文所用，术语“活化”是指给定的可测量的CD40L活性相对于参照物增加至少10％，例如至少10％、25％、50％、75％或甚至100％或更多。若活性相对于拮抗剂的缺乏降低至少10％，且在一个例示性实施例中降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或甚至100％(也即检测不到活性)，则CD40L活性被“拮抗”。例如，抗体多肽可拮抗一些或全部CD40L活性。抗体多肽可以不活化B细胞增殖。抗体多肽可以不活化T细胞或树突细胞(DC)的细胞因子分泌，其中细胞因子为选自下组的至少一种细胞因子：IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ。2.抗体多肽抗体多肽包含可变域。抗体多肽可以是含有单个可变域的dAb形式。抗体多肽可以是包含由双硫键互相连接的两条重(H)链及两条轻(L)链的全长抗CD40L免疫球蛋白分子。各链的氨基末端部分包括约100-120个氨基酸的可变域(VL或VH)。其中所含的互补性决定区(CDR)主要负责抗原识别，尽管框架残基可在表位结合中起作用。每条重链的羧基末端“半部(half)”确定主要负责效应器功能的恒定区(Fc)。“域抗体”(dAb)包含能够特异性并单价地结合抗原，如CD40L的单个可变(VL或VH)域。例如，dAb可以具有骆驼科动物(camelid)dAb所特有的VHH结构。如本文所用的“VH域”表示包括VHH结构。VH域(包括如本文实施方案所呈现的全部特征及特征组合)不同于VHH域。dAb可在溶液中形成均二聚体或异二聚体。尽管不受任何特定理论限制，但据信本文所揭示的dAb不引起血小板凝集，因为含有突变型Fc构建体的抗体不结合血小板表面上的FcγRIIa(也称为CD32a)且不活化血小板。如本文所使用的，术语“可变域”是指由Kabat等人，SequencesofImmunologicalInterest,第5版，美国健康与人类服务部，Washington,D.C.(1991)所定义的免疫球蛋白可变域。可变域内CDR氨基酸残基的编号及定位是依照熟知的Kabat编号惯例。抗体多肽也可以是包含全长抗CD40L免疫球蛋白分子中包含特异性结合CD40L的可变域的一部分的“片段”。因此，术语“抗体多肽”包括例如抗原结合重链、轻链、重链-轻链二聚体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链Fv(scFv)及dAb。因此术语“抗体多肽”包括通过重组工程化及表达所制造的多肽，以及通过天然重组及杂交瘤细胞克隆分泌所产生的单克隆抗体。如本领域中已知，轻链分类为卡帕(κ)或拉姆达(λ)，且由特定恒定区CL表征。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，且定义抗体的同种型分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。对于IgG、IgD及IgA，重链恒定区包含三个结构域(CH1、CH2及CH3)；且对于IgM及IgE，包含四个结构域(CH1、CH2、CH3及CH4)。抗CD40L抗体可具有选自任一免疫球蛋白类别(IgA、IgD、IgG、IgM及IgE)的重链恒定区。每个轻链可变域(VL)及重链可变域(VH)由三个CDR及四个框架区(FR)构成，自氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。轻链的三个CDR称为“LCDR1、LCDR2及LCDR3”，且重链的三个CDR称为“HCDR1、HCDR2及HCDR3”。如本文所用，术语“Fc域”是指包含CH2及CH3恒定域的恒定区抗体序列，如根据Kabat等人，SequencesofImmunologicalInterest,第5版，美国健康与人类服务部(U.S.Dept.Health&HumanServices),Washington,D.C.(1991)所界定。Fc区可以衍生自人IgG。例如，Fc域可以衍生自人IgG1或人IgG4Fc区。示例性的经修饰的人IgG1Fc域为：EPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:3)。SEQIDNO:3衍生于人IgG1Fc，并在位置5，11和14包括Ser代替Cys，和位置23包含Ser代替Pro。制得该半胱氨酸-至-丝氨酸点突变以消除Fc铰链中的二硫键。另一种示例性Fc区是SEQIDNO:5，其衍生于人IgG4Fc，具有以下氨基酸序列：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:5衍生于人IgG4Fc并包含位置10的修饰以包含Pro。可变域可以融合至Fc域。当可变域融合至Fc域时，可变域的羧基末端(VL或VH域，包括dAb)可连接或融合至FcCH2域的氨基末端。或者，可变域的羧基末端可连接或融合至CH1域的氨基末端，其自身融合至FcCH2域。蛋白质可整体或部分包含CH1与CH2域之间的铰链区。各种Fc形式的域抗体及其效能的例子提供在表4中。图2提供连接至接头区的本文所提供的各种Fc域的N-末端序列。接头区显示在方框中。如表2中所用，“Fc”指示dAb融合至人类IgG1短Fc。“CT长Fc”也称为CT-L2，CT长，和CT，具有氨基酸序列SEQIDNo:3。“CT短”也称为CT-S1，与CT长相比在N-末端短7个氨基酸。“N297Q长Fc”也称为N297Q-L4，是具有为除去Fc中的N-连接碳水化合物所进行的N297Q突变的人类IgG1的Fc域。“N297Q短Fc”也称为N297Q-S3，在N-末端比N297Q长Fc短7个氨基酸，且为具有为除去Fc域中的N-连接碳水化合物所进行的N297Q点突变的人类IgG1。“CT-FcSP5”为CT长Fc，其中SP5是指用于从哺乳动物表达宿主分泌的octeonectin信号肽。切割位点由“^”表示。图3进一步提供各种Fc域形式的例子。融合抗体多肽的抗体多肽可以通过“氨基酸接头”或“接头”连接。例如，dAb可以融合至氨基酸接头的N-末端，而Fc域可以融合至接头的C-末端。尽管氨基酸接头可以是任意长度并由氨基酸的任意组合组成，接头的长度可以是相对短的(例如，五个以下的氨基酸)以降低连接的域之间的相互作用。也可以调整接头的氨基酸组成以降低具有大体积的侧链的氨基酸或可能引入二级结构的氨基酸的数量。适合的氨基酸接头包括但不限于，长度多达3,4,5,6,7,10,15,20,或25个氨基酸的那些。代表性氨基酸接头序列包括GGGGS(SEQIDNO:6)，以及包括GGGGS的2,3,4,或5个拷贝的接头(分别为SEQIDNOs:7-10)。下表为用于本公开中的适合的接头序列。包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)的氨基酸序列的第一可变域融合至人Fc域。见图1A和1B。可以从上表中的任意接头列表选择接头。例如，接头可以包含或是AS(SEQIDNO:11)。另外，使用抗体多肽的方法可以包含可变域，其中可变域的氨基酸序列包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)，包含AST(SEQIDNO:12)的接头，和选自SEQIDNO:3的人Fc域。另一种公开的方法，抗体多肽包含可变域，其中可变域的氨基酸序列包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)，包含AS(SEQIDNO:11)的接头，和包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的人Fc域。术语“人类”当应用于抗体多肽时，表示抗体多肽具有源自人类免疫球蛋白的序列，例如框架区及/或CH域。当序列：(a)自人类个体或自人类个体的细胞或细胞株分离而得；(b)自经克隆的人类抗体基因序列文库或人类抗体可变域序列文库分离而得；或(c)通过自一种或多种以上多肽突变和选择而多样化时，该序列是“源自”人类免疫球蛋白编码序列。如本文所用的“分离的”化合物表示该化合物是从在自然界中与该化合物天然相关的至少一种组分中移出。可将抗体多肽施用至人类患者，同时在很大程度上避免通常通过施用来自其它物种(例如小鼠)的抗体所引起的抗抗体免疫反应。例如，根据本领域中公知的程序，可通过将鼠类CDR移植至人类可变域FR上来使鼠类抗体“人源化”。然而，可在不需要基因操作鼠类抗体序列的情况下产生如本文所公开的人类抗体。可变域可以包含具有与由人类种系抗体基因区段编码的相应框架区相同的氨基酸序列的一个或多个FR。例如，域抗体可包含VH种系基因区段DP47、DP45或DP38，Vκ种系基因区段DPK9，JH区段JH4b，或Jκ区段Jκ1。可改变抗体多肽序列，同时保留特异性结合CD40L的能力。特别地，抗体多肽(例如dAb)可以包含保留与dAbBMS2h-572-633一样的特异性结合CD40L的功能的变体可变域。变体可变域可以与BMS2h-572-633竞争对CD40L的特异性结合。抗体多肽可以通过PEG化格式化(formatted)以增加其体内半衰期。PEG为共价连接的。或者，PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基处连接至抗体多肽。PEG连接的抗体多肽可以具有至少24kD的水动力大小(hydrodynamicsize)。一般来说，总PEG大小为从20至60kD，包括端点。一般来说，PEG连接的域抗体具有至少200kD的水动力大小。可以使用几种PEG附着部分实现PEG化，包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、乙烯砜或硫醇。PEG聚合物可连接至抗体多肽的预定位置，或可随机地连接至域抗体分子。PEG化也可经由附着至域抗体的肽接头来介导。也就是说，PEG部分可连接至融合至抗体多肽的肽接头，其中该接头提供用于PEG附着的位点(例如游离的半胱氨酸或赖氨酸)。使抗体PEG化的方法在本领域中试是已知的，例如由Chapman等人,“PEGylatedantibodiesandantibodyfragmentsforimprovedtherapy:areview”,Adv.DrugDeliv.Rev.54(4):531-45(2002)中公开。3.药物组合物及治疗方法方法包括向患者施用抗体多肽。抗体多肽可以配制为药物组合物。药物组合物包含治疗有效量的一种或多种抗体多肽和任选地药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物以及其组合。药学上可接受的载体可进一步包含少量可延长融合蛋白的货架期或有效性的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。组合物可以经配制以使活性成分在投药之后快速、持续或延迟释放。合适的药物组合物及其制备方法是本领域中所熟知的。参见例如Remington,THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY,A.Gennaro等人编，第21版，MackPublishing公司(2005)。药物组合物进一步可包含免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂。治疗需要此类治疗的患者中的移植物排斥的方法可以包括向该患者施用治疗有效量的药物组合物。移植物可以是肾移植物。拮抗CD40L介导的T细胞活化可抑制移植物排斥期间不想要的T细胞反应。抑制CD40L介导的T细胞活化可减缓移植物排斥的进展和/或严重程度。如本文所用，“患者”表示动物，例如哺乳动物，包括人类。患者可经诊断患有免疫疾病。“治疗”是指涉及减轻症状、病症、状况或疾病的进展或严重程度的过程。药物组合物可单独施用或以与免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂的疗法组合(即同时，序贯或与共同配制)施用。不同免疫疾病可以需要使用可用于治疗免疫疾病的特定辅助化合物，其可以基于不同患者来确定。例如，公开的药物组合物可与细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)突变分子，如L104EA29Y-Ig(贝拉西普)伴随(同时或与其共同配制)或序贯共施用。CTLA4以比CD28高的亲合力结合至CD80(B7-1)及CD86(B7-2)，且其在活化之后的T细胞上短暂表达，其中CTLA4中断CD28与CD80/86之间的相互作用。Oosterwegel等人，Curr.Opin.Immunol.11:294-300(1999)。这创建T细胞活化的负反馈信号。相比于野生型CTLA4，CTLA4突变分子，包括L104EA29Y-Ig，具有对CD80/86的增强的结合亲合力。已成功实行了通过L104EA29Y-Ig对CD28-CD80/86途径的干预，单独或与其它免疫抑制剂组合，例如以治疗非人类灵长类动物移植物模型中的移植物相关疾病。Larsen等人，Amer.J.Transplant.5:443(2005)。美国专利申请号2010/0166774描述了L104EA29Y-Ig的结构、产生L104EA29Y-Ig的方法，和包含CTLA4分子的配制剂；且该申请案以引用的方式并入本文。美国专利号7,094,874和7,482,327进一步公开L104EA29Y-Ig的施用(包括与一种或多种其它药物共施用)及剂量日程表，且这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用任何适当方法或途径来施用抗体多肽或药物组合物。施用途径包括例如经口、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。施用的抗体多肽的治疗有效剂量取决于许多因素，包括例如所治疗的免疫疾病的类型及严重程度、组合疗法的使用、抗体多肽或药物组合物的施用途径，和患者的体重。域抗体的治疗有效量的非限制性范围为约0.1mg/kg至约30mg/kg，或约2mg/kg至约30mg/kg，或约20mg/kg至约30mg/kg，相对于患者的体重。域抗体的治疗有效量可以是约20mg/kg。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的治疗有效量可以是约0.1mg/kg至约30mg/kg，或约2mg/kg至约30mg/kg，或约20mg/kg至约30mg/kg，或约20mg/kg。治疗有效量可以静脉内施用。在治疗方案的持续时间，可以按周施用治疗有效量。治疗方案的持续时间可以变化。持续时间可以长约70天。域抗体可与免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂，例如CTLA4突变分子(例如贝拉西普)一同施用(同时，序贯或与其共同配制)。免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂可以以约20mg/kg施用。代表性模型描述于下文及实施例中。肾移植患者在他们的治疗过程期间可以施用几种免疫抑制剂的一种或多种。这些可以包括糖皮质激素。免疫抑制剂还可以包括小分子药物包括免疫亲和素(immunophilin)结合药物(例如，钙调磷酸酶抑制剂，例如亲环素结合药物包括环孢素和ISA(TX)247；FKBP12结合药物例如他克莫司(tacrolimus)和缓释(modified-release)他克莫司；和雷帕霉素靶标抑制剂(target-of-rapamycininhibitor)，如西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus))，核苷酸合成抑制剂(例如嘌呤合成抑制剂(IMPDH)例如吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)，肠溶包被的霉酚酸(enteric-coatedmycophenolicacid)，和咪唑立宾(mizoribine)；嘧啶合成抑制剂(DHODH)例如Lefunomide和FK778)，抗代谢物(例如咪唑硫嘌呤)和鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂(例如FTY720)。免疫抑制剂还可以包括蛋白药物例如耗竭性抗体(例如，针对T细胞，B细胞，或两者，并可以包括马或兔抗胸腺细胞球蛋白，小鼠单克隆抗CD3抗体例如muromonab-CD3，人源化的单克隆抗CD52抗体(alemtuzaumab)，B细胞耗竭单克隆抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))，和静脉内免疫球蛋白。对于这些药物的综述参见Halloran,“ImmunosuppressiveDrugsforKidneyTransplantation,”NewEngl.J.Med.351:27152729(2004)。考虑的是单一疗法中范围从2mg/kg至30mg/kg的单独BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的组合。或者，可以在组合疗法中与CTLA4突变分子例如L104EA29Y-Ig(贝拉西普)一同施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。在组合疗法中，可以以约10mg/kg,15mg/kg,20mg/kg,25mg/kg,或30mg/kg的量(或其间的任意整数量)施用贝拉西普。或者，BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)可以与抗CD28Dab组合施用。优选的抗CD28dAB是BMS-931699，其包含可变域BMS1h-239-891(D70C)(SEQIDNO:26)并为PEG化的。BMS1h-239-891(D70C)描述于例如题为“CompositionsMonovalentforCD28BindingandMethodsofUse”的美国专利号8,168,759中。可以以从1mg/kg至约10mg/kg的量施用抗CD28dAB，例如约3mg/kg。4.同种移植物排斥体内模型可以在几种可用的体外或体内模型系统的一种中测试本公开的抗体多肽拮抗CD40L的能力。下文描述了适合的人，动物，和细胞模型系统。进一步的细胞测定系统描述于实施例中。对于预防实体器官移植(SOT)的排斥，靶向CD40-CD40L途径长期以来备受关注，特别是鉴于来自大量发表的非人灵长类中移植研究的有希望的数据。已经证明了离体的活化CD4+T淋巴细胞上降低的CD40L表达与极好的肾同种移植物功能相关。Lederer等人,Int.Arch.AllergyImmunol.133:276-284(2004)。此外，几项研究已经证明了抗CD40LmAb可以既预防又逆转灵长类中的急性同种移植物排斥。例如，Kirk等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8789-8794(1997)报道了在使用肾移植物移植的猕猴中，抗CD40LmAb5C8单独或与CTLA4-Ig组合显著延长了无排斥存活(rejection-freesurvival)。CD40L特异性mAbhu5c8单独也允许猕猴中的同种异体胰岛移植和长期胰岛素依赖性，所述猕猴移植了足够数量的可活胰岛。Kenyon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)。Preston等人,Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)在MHC(主要组织相容性复合物)错配的猕猴中进行了肾移植，并使用CD40L特异性mAbIDEC-131和/或雷帕霉素(sirolimus)，和/或移植前供体特异性输血的组合治疗受体。IDEC-131在灵长类中的肾同种异体抑制排斥的预防中高度有效。在经历肾异体移植的食蟹猴中，使用抗CD40LmAbABI793有效地预防了移植物排斥。Schuler等人，Transplantation77:717-726(2004)。除预防异体移植物排斥外，CD40L特异性mAb在灵长类移植模型中诱导供体特异性耐受。Preston等人，Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)；Kenyon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)。在肝或小肠移植后经历急性移植物排斥的儿童人类患者中，观察到CD8+T细胞上CD40L的表达和移植物排斥风险之间的相关性。Ashokkumar等人，Amer.J.Transplantation9:179-191(2009)和Ashokkumar等人，Surgery146:166-173(2009)。相似地，在肝或肾移植后经历同种移植物排斥的成年患者中，组织学分析揭示了CD40L表达和急性或慢性排斥之间的关联。Bartlett等人，Amer.J.Transplantation3:1363-1368(2003)和Biancone等人，Nephrol.Diall.Translpant.13:716-722(1998)。几项研究支持靶向CD40L超过CD40以实现移植中更好的效力。例如，相比于CD40，当选择性阻断CD40L时，移植物存活更长且更持久。Gilson等人，J.Immunol.183:1625-35(2009)。此外，最近的数据提示CD40L阻断可以提高对Treg和/或抑制细胞的诱导以促进移植物存活。Garcia等人，J.Clin.Inv.120:2486-96(2010)。另外，CD40L，而不是CD40的阻断，已经证明诱导长期的免疫耐受，导致无限期的移植物存活，特别是当与B7途径的阻断组合时。Kenyon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)；Kawai等人，Amer.J.Transplantation4:1391-1398(2004)；Preston等人，Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)；Adams等人，J.Immunol.174:542-50(2005)。阻断CD40-40L和B7-CD28途径在提高移植物存活中的协同性是特别重要的，因为其提出了目前公开的域抗体作为与贝拉西普(L104EA29Y-Ig)组合的自然选择用于实体器官移植物(SOT)。示例性氨基酸序列对于抗体多肽有用的代表性抗人CD40LVH域氨基酸序列公开于美国临时申请号61/955,588中的表1中。编码表1的VH域序列的代表性核酸列在美国临时申请号61/955,588的表2中。如本领域中公知的，多种密码子可以编码相同的氨基酸。因此，编码蛋白序列的核酸包括具有密码子简并性的核酸。美国临时申请号61/955,588中公开的抗体多肽特异性结合CD40L。使用反复起始/初步筛选(reiterativeinitial/primaryscreening)制成它们，如共同转让的2014年11月15日公告的题为“ANTIBODYPOLYPEPTIDESTHATANTAGONIZECD40L”的美国专利号8,895,010中详细描述的。实施例实施例1克隆BMS2h-572的dAb选择针对由Bristol-MyersSquibb提供的生物素化的(1.42摩尔生物素/摩尔三聚体)人异亮氨酸拉链-CD40L(IZ-hCD40L)，使用降低浓度的抗原(第1轮300nM；第2轮30nM；第3轮3nM)平行进行三轮选择。在启动选择之前，将来自未处理4G和6GDomantisdAb文库的噬菌体合并到如下所示的合并物a)至h)中:a)长度在7-9个氨基酸之间的4GVHCDR3b)长度在10-12个氨基酸之间的4GVHCDR3c)长度在13-15个氨基酸之间的4GVHCDR3d)4GVKe)长度在7-9个氨基酸之间的6GVHCDR3f)长度在10-12个氨基酸之间的6GVHCDR3g)长度在13-15个氨基酸之间的6GVHCDR3h)6GVK每轮选择涉及向1000μl的2％MPBS(含有2％(w/v)Marvel的磷酸盐缓冲盐水[PremierFoods,UK])中的噬菌体的混合物(来自上文所示的未处理的文库合并物的一个，或后续选择输出噬菌体)添加期望浓度的生物素化的CD40L，并通过翻滚式(end-over-end)混合在室温孵育1小时。接着，通过添加100μl重悬的M-280链霉亲合素[Invitrogen,UK](第1和3轮)或50μl已经偶联了NeutrAvidin[ThermoFisherScientific,UK]的M-280甲苯磺酰活化的(Invitrogen)(第2轮)捕获生物素化的抗原噬菌体复合物，并在室温使用翻滚式混合孵育5分钟。接着，使用KingFisher磁力分离器[ThermoFisherScientific,UK]回收并使用1mLPBST(含有0.1％(v/v)聚氧乙烯山梨醇单月桂酸20[Sigma-Aldrich,UK]的PBS)洗涤7次，接着1mLPBS(磷酸盐缓冲盐水)清洗1次。通过使用500μl胰蛋白酶-PBS(50μl溶解于添加至450μLPBS的50mMTris-HClpH7.4,1mMCaCl2的10mg/ml胰蛋白酶)孵育，洗脱保留在经洗涤的上的结合噬菌体。将含有噬菌体的溶液回收并将250μL用于在37℃感染1.75mL对数生长期大肠杆菌TG1(OD600为约0.4)30分钟。以11,600xg在微型离心机中离心大肠杆菌TG1噬菌体感染的培养物1分钟，并将所得的细胞团块重悬于1mL2XTY(1升中的16g蛋白胨，10g酵母提取物和5gNaCl，在121℃高压灭菌处理15分钟)中并铺板到含有使用15μg/ml四环素补充的TYE培养基的9cm培养皿上。将平板在37℃孵育过夜，接着向每个平板添加2ml使用15％甘油补充的2XTY，使用玻璃涂布器松散细胞，并充分混合。将五十微升刮下的细菌用于接种50ml使用15μg/mL四环素补充的2XTY，并在37℃以250rpm摇动生长过夜。将过夜的培养物在3,300g离心15分钟以沉淀细菌。为了沉淀噬菌体，将10mlPEG/NaCl(20％聚乙二醇8000,2.5MNaCl)添加至40ml上清。混合噬菌体/PEG溶液并放置在冰上1h，接着在4℃以3,300g离心30分钟并弃去上清。将团块重悬于2mlPBS并在微型离心机中以11,600xg离心10分钟以去除剩余的细菌碎片。然后所得的含有噬菌体的上清用于针对适当浓度的生物素化IZ-hCD40L的下一轮选择。噬菌体ELISA：在第2和3轮选择后，进行了单克隆噬菌体ELISA。使用250μlPBST的3次洗涤，接着250μlPBS的3次洗涤进行所有洗涤。使用50μl/孔溶解于PBS的1μg/mlIZ-hCD40L在4℃包被平板过夜。洗涤平板并接着使用2％MPBS(修改的磷酸盐缓冲盐水)在室温封闭1小时。洗涤平板并添加25μl/孔噬菌体上清至2％MPBS的相等体积，并在室温孵育1小时。洗涤平板，并使用50μl/孔1:5000稀释于2％MPBS的抗M13-HRP(辣根过氧化物酶)缀合物[GEHealthcare,UK]检测结合的噬菌体并在室温孵育1小时。洗涤平板，并使用50μl/孔SureBlue1-ComponentTMB微孔过氧化物酶溶液[KPLInc,USA]对ELISA显色。通过添加等体积的1MHCl终止比色反应，且ELISA平板在450nm读数。通过与没有包被抗原但其它方面相同处理的孔比对，鉴定特异性噬菌体。从pDOM4质粒回收dAb基因通过对噬菌体载体pDOM4进行SalI和NotI限制性酶消化回收来自2和3轮输出的dAbV-基因，并且连接到SalI和NotI双重消化的pDOM5表达载体中。可溶性dAbELISA如下鉴定结合dAb。从每个输出挑取96个含有克隆到可溶性dAb表达载体pDOM5中的dAbV-基因的个别克隆到200μl含有OnEx自诱导培养基[Novagen,UK]的TerrificBroth(TB)中并在使用透气性粘结塑料条密封的Costar96WellCellCultureClusters[CorningIncorporated,USA]中使用250rpm摇动在37℃孵育过夜。离心培养物以沉淀细胞，且上清通过抗原结合ELISA测定结合至IZ-hCD40L的dAb。MaxiSorp96孔免疫板[Nunc,USA]使用50μl/孔溶于PBS的1μg/mlIZ-hCD40L在4℃包被过夜。所有的洗涤如对于噬菌体ELISA所描述的。使用200μl含有1％Tween20的PBS在室温封闭平板1小时。洗涤ELISA板并通过在4℃以1,800xg离心10分钟使含有dAb的培养上清澄清，接着添加到ELISA板(30μL/孔)，向其添加等体积的PBST。平板在室温孵育1小时，然后洗涤。通过添加50μl/孔1:2000稀释于PBST的9E10[抗-mycIgG,Sigma-Aldrich,UK]检测结合的dAb，并在室温孵育1小时；接着洗涤ELISA板并添加50μl/孔1:2000稀释于PBST的抗小鼠Fc-HRP[Sigma-Aldrich,UK]并在室温孵育1小时。洗涤平板并使用50μl/孔SureBlue1-ComponentTMB微孔过氧化物酶溶液[KPLInc,USA]显现ELISA，并且允许显现颜色。通过添加等体积的1MHCl终止比色反应，且ELISA平板在450nm读数。通过将来自IZ-hCD40L孔的信号强度与不含有抗原的对照孔比较，鉴定结合抗原的dAb。实施例2克隆BMS2h-572-6的鉴定使BMS2h-572dAb经过易错亲和力成熟(error-proneaffinitymaturation)以生成BMS2h-572谱系。这使用随机诱变进行，其中每dAb引入平均3.6个氨基酸改变。使用生物素化的单体和三聚人CD40L选择噬菌体文库(平均大小6x108)，其中交替链霉亲合素/neutravidin珠捕获抗原(如所述)。进行了使用降低浓度的抗原(第1轮以100nM；第2轮以10nM；第3轮以1nM)的三轮选择。使用测序来监控每轮选择后的多样性。将选择输出(对于BMS2h-572在CD40L三聚体上选择的第2轮)亚克隆到可溶性表达载体pDOM13中(无C末端标签)(如所述)并作为单克隆细菌微量培养物上清，在单体和三聚体CD40L两者上通过BIAcore筛选与亲本克隆相比筛选改进的解离率。DNA测序经鉴定改进的变体，并表达，纯化独特的dAb，然后使用BMS2h珠RBA以及细胞CD40L驱动测定法(如所述)测定。这些dAb的活性列于以下表1中。格式化BMS2h-572-6为Fc融合将BMS2h-572-6dAb克隆到含有源自人IgG1的Fc尾的pDOM38载体中以创建DMS0502。也将BMS2h-572-6dAb克隆到含有源自人IgG4的Fc尾的pDOM38载体中以创建DMS0505。将构建体在HEK293细胞中瞬时表达并使用蛋白A纯化蛋白。通过Biacore在对单体和三聚CD40L的结合方面以及在多个细胞测定(如所述)中分析纯化的Fc融合。克隆BMS2h-572-608,BMS2h-572-614和BMS2h-572-619的鉴定BMS2h-572-6dAb使用掺杂的寡聚物方法(dopedoligoapproach)经过亲和力成熟。对于该dAb构建了四个掺杂的文库：文库1–CDR1中的5个残基多样化文库2–CDR2中的6个残基多样化文库3–CDR2中的13残基多样化文库4–CDR3中的7个残基多样化在每个文库中，使用nnS密码子进行多样化，其中n保留了亲本碱基的大部分(85％)而将剩余部分在等摩尔量的剩余三个碱基(每个5％)之间分开，且S表示G或C。使用生物素化的单体和三聚人CD40L选择噬菌体文库(平均大小8x108)，交替链霉亲合素/neutravidin珠捕获抗原(如所述)。在选择过程期间，将文库2和3拉到一起。进行了使用降低浓度的抗原(第1轮50nM；第2轮5nM；第3轮1nM，使用200倍过剩的竞争物-非生物素化的CD40L三聚体)的三轮选择。每轮选择后使用测序以监控多样性。将选择输出(第2轮和第3轮)亚克隆到可溶性表达载体pDOM13(无C末端标签)中(如所述)并作为单克隆细菌微量培养物上清，在单体和三聚体CD40L两者上通过BIAcore筛选与亲本克隆相比改进的解离率。DNA测序经鉴定改进的变体，并表达，纯化独特的dAb，然后使用BMS2h珠RBA以及细胞CD40L驱动测定法(如所述)测定。作为结果，鉴定了成熟dAbsBMS2h-572-608,BMS2h-572-614和BMS2h-572-619。克隆BMS2h-572-633的构建序列分析揭示了BMS2h-572-608和亲本dAbBMS2h-572-6之间的所有氨基酸差异定位于CDR1中，且BMS2h-572-614和亲本dAbBMS2h-572-6之间的差异定位于CDR3中。两种成熟的dAb都与亲本dAbBMS2h-572-6共享CDR2。这创造了构建组合突变体的机会，所述组合突变体具有BMS2h-572-608的CDR1和BMS2h-572-614的CDR3。首先，PCR扩增BMS2h-572-608的CDR1区。其次，PCR扩增BMS2h-572-614的CDR2+CDR3片段。这接着是两个片段的SOEPCR(剪接重叠延伸聚合酶链式反应)组装以创建组合突变体BMS2h-572-633。将组装的dAbPCR产物克隆到可溶性表达载体pDOM13(无C末端标签)中，测序验证，表达，纯化，然后使用BMS2h珠RBA以及细胞CD40L驱动测定法(如所述)测定。格式化BMS2h-572-633为Fc融合将BMS2h-572-633dAb克隆到含有来源于人IgG1的Fc尾的pDOM38载体中以创建DMS0507。将构建体在HEK293细胞中瞬时表达并使用蛋白A纯化蛋白。通过Biacore在对单体和三聚CD40L的结合方面以及在多个细胞测定(如所述)中分析纯化的Fc融合。实施例3CD40活性细胞测定对抗人CD40LdAb功能性测定它们拮抗CD40L活性的能力。测试的CD40L活性是由hCD40L驱动的原代单核细胞衍生的树突细胞(DC)活化的B细胞增殖和细胞因子产生。除非另有说明，所有测定在补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中进行。如下文详细描述的多种测定的结果示于表1和表2中。可溶性IZ-hCD40L驱动的原代人B细胞增殖在96孔圆底板中，以终体积200μL/孔将1x105个扁桃体人B细胞与0.6μg/ml的IZ-hCD40L连同不同滴度的dAb或mAb孵育。平板在37℃孵育72小时，接着添加胸苷(3H；0.5μci/孔)6小时。基于胸苷掺入定量B细胞增殖。除非另有说明，所有测定在补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中进行。CHO-hCD40L驱动的原代B细胞增殖使用人CD40L转染CHO细胞以生成在细胞表面上表达高水平的CD40L的稳定细胞系。与人B细胞孵育前，CHO-CD40L细胞以10,000Rads照射。将1x105个扁桃体人B细胞与1x103个CHO-CD40L细胞(CHO-CD40L：人B细胞1：100比率)以及各种滴度的dAb或mAb在96孔圆底平板中以200μl/孔的终体积进行孵育。平板在37℃孵育72小时，接着添加胸苷(3H；0.5μci/孔)6小时。基于胸苷掺入定量B细胞增殖。除非另有说明，所有测定在补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中进行。原代T细胞驱动的人B细胞增殖从人外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞并使用通过山羊红细胞(SRBC)亲和力富集。将富集的人T细胞与PM-LCL(EBV转化的B细胞系；以10,000Rads照射)以5：1比率(T：LCL)在37℃培养6天以生成异基因的T细胞群体。在第6天，分离扩增的T细胞并以3000Rad照射，然后与原代人扁桃体B细胞(1x105B细胞/孔)以1:2比率培养(5x104T细胞/孔)，所述培养在使用抗CD3mAb(OKT3)包被的96孔平底平板中进行。向每个孔添加不同滴度的dAb/mAb；每个孔中的终体积为200μl。测试平板在37℃孵育3天。通过在最后18个小时向培养物添加胸苷(3H；0.5μci/孔)确定人B细胞增殖。除非另有说明，所有测定在补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中进行。在一些情况中，收获上清并测量IL-6的存在。CHO-hCD40L驱动的原代人单核细胞衍生的树突状细胞(DC)的活化：通过经由SRBC(山羊红细胞)重置(resetting)耗竭T细胞，将对人PBMC(外周血单核细胞)富集单核细胞。在6孔板中将单核细胞富集的PBMC与10ng/mlGM-CS(粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子)和5ng/mlIL-4在37℃孵育六天。在第2天和第5天，将培养的平板使用新鲜培养基(具有GM-CSF和IL-4)补充。在第6天将未成熟的DC(树突状细胞)用于细胞测定。在96孔平底板中，将8x104个未成熟的DC与4x103个CHO-hCD40L细胞(以10,000Rads照射)连同不同滴度的dAbs/mAbs培养。24小时后，收获上清并测试多种细胞因子(IL-12,TNF,IL-23)的存在。通过细胞因子产生的水平确定DC活化。除非另有说明，所有测定在补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中进行。表1单体dAb分子在多种原代细胞测定中的效能实施例4各种抗体的结合动力学和CD40L亲和力BMS-986004是一种二聚的融合蛋白，由连接至dAbBMS2h-572-633的C末端的IgG1的经修饰的Fc片段组成。表面等离振子共振(SPR)用于表征BMS-986004或单价组分域抗体BMS2h-572-633结合值CD40L的动力学和亲和力。将BMS-986004值与基准抗体5c8-IgG1和5c8-CT和单价组分5c8FAB片段的那些比较。该SPR实验利用含有N-末端异亮氨酸拉链基序的hCD40L构建体(IZ-hCD40L)，其促进CD40L分子特异性组装为天然三聚体形式。对于一些SPE实验，也利用具有等价结合活性的IZ-hCD40L的生物素化的版本(biot-IZ-hCD40L)。单价BMS2h-572-633域抗体以7.8nM的Kd结合biot-IZ-hCD40L，相比于单价5c8FAB片段的5.4nM的亲和力，表3。因为BMS-986004是双价的，而IZ-hCD40L靶标是三价的，该SPR结合数据被亲合力(avidity)所影响，不论CD40L靶标是在芯片上或在溶液中。为了评估亲合力影响的结合亲和力，将BMS-986004结合至biot-IZ-hCD40L表面的SRP数据拟合至1：1Langmuir模型，提示小于1nM的解离常数，表3。对于5c8-IgG1和5c8-CT，获得了相似的数据。表3如使用SPR(Biacore)测定的IZ-hCD40L动力学和亲和力值*值由于分析物的双价性受到亲合力的影响图4示出了在25℃，12.5-0.39nM的BMS-986004(2：1系列稀释)对链霉亲合素SPR传感器芯片上捕获的biot-IZ-hCD40L结合的SPR传感图数据。有色线示出了双重参照传感图数据，而黑线示出了对数据的1:1Langmuir拟合，其中亲合力影响的表观Kd为0.11nM。使用等温滴定量热法(ITC)在范围15–37℃的温度，在溶液中还表征了BMS-986004对CD40L结合的亲和力和热力学。这些数据表明，存在多个热力学上不同的结合模式(图3)，其中不同模式的Kd值超过了高亲和力检测限(Kd<2nM)(表4)，与SPR数据一致。通过ITC确定的单价5c8FAB片段对IZ-hCD40L的亲和力也与通过SPR确定的值一致。表4使用ITC确定的IZ-hCD40L亲和力ITC注射器中的分子ITC细胞中的分子Kd(nM)BMS-986004IZ-hCD40L<25c8-CTIZ-hCD40L<2IZ-hCD40LBMS-986004<2IZ-hCD40L5c8-CT<2IZ-hCD40L5c8FAB片段3.5实施例5各种抗体的Fc受体亲和力从野生型IgG1Fc域工程化BMS-986004的Fc域(称为“CT-L2”；SEQIDNO:3)以保留结合FcRn但破坏对Fcγ受体的结合的能力。为了确认经工程化的分子具有期望的Fc受体结合概况，使用SPR测量了BMS-986004对人FcRn，和人Fcγ受体CD64(FcγRI),CD32a(FcγRIIa),CD32b/c(FcγRIIb/c),CD16a(FcγRIIIa),CD16b(FcγRIIIb)的结合亲和力，与5c8-IgG1和5c8-CT比较。对于这些实验，BMS-986004通过域抗体域捕获在biot-IZ-hCD40L传感器表面上，并测试可溶性Fc受体蛋白对暴露的Fc域的结合。相似的，5c8-IgG1和5c8-CT通过FAB域捕获在biot-IZ-hCD40L上，其中可溶性FcR结合。在pH6.0(其为内体中结合的相关pH)，BMS-986004以670nM的Kd结合FcRn，表5。然而，在中性pH，结合显著降低(Kd>5000nM)，提示在这些条件下从FcRn的高效释放。BMS-986004以0.6nM的Kd结合CD64，并对于CD32a,CD32b/c,CD16a和CD16b具有统计学上弱的亲和力(Kd>3000nM)。5c8-IgG1和5c8-CT两者都与BMS-986004具有相似的FcRn亲和力。5c8-CT，其具有与BMS-986004相同的“CT”Fc区，也具有与BMS-98600相似的FcγR结合特性，而具有野生型IgG1Fc域的5c8-IgG1对FcγRs更强的结合，表5。表5使用SPR(Biacore)确定的Fc受体亲和力*CD32a对5c8-IgG1结合是双相性的(biphasic)。甚至基于对优势结合的稳态拟合，估算Kd为～10-7M(Kdwasestimatedas～10-7Mbasedonsteadystatefittodominantbindingeven)。该Kd在CD32a对IgG1结合的文献报道的KD范围内。实施例6基于细胞的体外测定在多种原代免疫细胞测定中评估了BMS-986004的效能，以确保在不同细胞类型之间强劲的效能。以两种方式进行了原代人B细胞增殖测定，如实施例3中详细描述的：(1)重组CD40L三聚体用于驱动B细胞增殖；和(2)在膜上表达CD40L的CHO细胞(CHO-CD40L)用于诱导B细胞增殖。CHO-CD40L细胞的效用是特别重要的，以确保当与可溶性CD40L三聚体相比时，来自膜结合的CD40L的信号被同样好地抑制。CHO-CD40L细胞也用于驱动原代人DC的活化，所述DC在GM-CSF和IL-4的存在下从培养的PBMC来源的单核细胞分化。相似的，T-BMLR(混合的白细胞反应)测定测量由活化的T细胞上存在的CD40L驱动的B细胞的活化。在所有的上述主要测定中，BMS-986004与基准5c8mAb效能相等；取决于测定，效能范围从个位数nM至亚nM(sub-nM)(表6)。表6多种原代细胞测定中BMS-986004的效能实施例7全血受体占有率(RO)的评估开发了受体占有率(occupancy)方法以测量猕猴全血样品中BMS-986003，和随后在人全血样品中BMS-986004对CD40L靶标的接合(engagement)。BMS-986003是除了在其氨基末端的非天然甘氨酸残基外，与BMS-986004共享相同氨基酸序列的dAb。使用抗CD40LmAb通过流式细胞术在CD4+T细胞上测量了占有率，所述抗CD40LmAb与BMS-986003/BMS-986004竞争对CD40L的结合。在结合的dAb存在下，以浓度依赖的方式对该抗CD40L检测mAb阻断结合CD40L，提供了靶标占有率的测量。考虑到在外周血中的静息T细胞上，基础CD40L以低水平表达，在未刺激的血液样品和使用植物凝集素(PHA)诱导T细胞表面上CD40L上调的样品两者中都评估了RO。使用BMS-986003和BMS-986004处理离体全血后，生成了结合效能曲线。得到的平均EC50和EC90示于表7中。表7离体全血受体占有率测定中BMS-986003和BMS-986004在CD4+T细胞上的结合效能BMS-986003n平均EC50,nM平均EC90,nM人(基础)10.93人(PHA诱导的)60.89Cyno(基础)30.63Cyno(PHA诱导的)30.42BMS-986004人(基础)30.43人(PHA诱导的)30.75对于BMS-986003和BMS-98600，全血中的靶标结合效能在人和猕猴之间紧密相关。当结合至基础和PHA诱导的CD40L时，BMS-986003和BMS-98600的EC50值也相似。另外，这些值与基于人体外细胞的测定中获得的那些相当(见表4)。基于测量的EC90值，应当在浓度≤10nM达到外周血中充分靶标饱和。为了支持BMS-986003和BMS-986004的临床前PK/PD概况，在使用BMS-986003的猕猴KLH研究(使用钥孔戚血蓝素免疫)和使用BMS-986004的IV桥接研究两者中都评估了RO。这些发现的进一步细节可以在以下实施例中找到。实施例8体内药理学为了显示CD40LdAb在小鼠疾病模型中的效力，使用小鼠IgG1Fc格式化小鼠CD40LdAb，2m126-24，所述IgG1Fc具有D265A点突变以进一步降低Fc效应器功能。该小鼠替代dAb2m126-24-Fc表现出与BMS-986004和MR-1(一种仓鼠抗小鼠CD40L抗体)可比的效能(表8)。表8体外效能比较小鼠CD40LdA对KLH诱导的抗体反应的抑制在第0天，雌性BALB/c小鼠腹膜内(i.p.)注射250μgKLH。在第-1和第6天，以指定剂量对小鼠皮下(s.c.)给药MR-1或BMS-2m-126-24-Fc。收集血液并通过ELISA分析血清第7天的抗KLHIgM和第14天的IgG。将使用KLH免疫后第14天收集的来自BALB/c小鼠的血清汇集，并用作阳性比较物，且数据表示为测试血清的滴度对汇集的BALB/c血清的滴度的比率。如图6中所示，BMS-2m-126-24-Fc表现出对IgG滴度的剂量依赖的抑制，其中在3mg/kg表现出最大效果，其中EC50计算为0.26mg/kg。CD40LdAb和该抗体两者都以1mg/kg测试，分别显示出IgG反应中70％相对于30％的降低。在1mg/kg观察到了dAb和该抗体的相似的暴露，提示dAb比抗体在抑制KLH诱导的IgG反应方面稍有效力。总之，在抑制T细胞依赖的抗体反应方面，CD40LdAb已经表现出与抗CD40L抗体至少相同水平的效力。小鼠CD40LdAb对TNBS诱导的结肠炎的抑制雄性SJL/J小鼠通过插于肛门远端4cm的导管直肠内施用2.5mg溶于50％EtOH的三硝基苯磺酸(TNBS)。在TNBS注射前4小时，小鼠使用MR-1或BMS-2m-126-24-Fc以指示的剂量s.c.给药一次。图7呈现了使用PBS/IgG或不同剂量水平的MR-1或dAb处理的小鼠组的平均体重和百分比存活的变化。阿巴西普用作阳性对照(20mg/kg,i.p.每隔一天)。IgG对照组中示出TNBS诱导的结肠炎的典型概貌：体重减轻，在第3-4天达到顶峰；在第3天和以上发生结肠炎相关的死亡；且存活的小鼠在第4天后显示出恢复的迹象。使用CD40LdAb或抗体处理(两者都以2,8和20mg/kg测试)导致剂量依赖的对体重减轻的抑制和存活率的增加；8mg/kg的两种化合物产生一定程度的效力，其与20mg/kg的阿巴西普可比。总的来说，在急性TNBS诱导的结肠炎模型中，小鼠CD40LdAbBMS-2m-126-24-Fc已经表现出与抗CD40L抗体MR-1可比的效力。小鼠“心脏至耳朵”移植物模型中CTLA4Ig和小鼠CD40LdAb之间的协同效果将来自新生(48-72hrs)C57Bl/6小鼠的心脏移植物移植到BALB/c小鼠耳廓中创建的皮下口袋中。小鼠使用指示剂量的CTLA4-Ig(i.p.2x/wk),BMS-2m126-24-Fc(皮下,s.c.1x/wk)或两者的组合处理，其中在移植前一天起始第一次给药。通过连续三天心肌收缩力的缺失定义排斥前的时间，如通过同种移植物的心电图(ECG)装置每天评估的。如预期的，没有任何治疗的情况下，接受新生BALB/c心脏的C57BL/6小鼠在此不久之后排斥移植物，其中中值存活时间(MST)为12天。使用3,20mg/kg的dAb或25mg/kg的CTLA4-Ig的单一疗法在延长同种移植物的存活方面无影响或影响不大(MST：分别为12，15和13天)。然而，在使用20mg/kg的dAb和25mg/kg的CTLA4-Ig的组合处理的组中，移植物的存活显著延长，表现出35天的MST(图8)。该数据提供了在人肾移植患者中组合CD40LdAb与贝拉西普的基本原理。实施例9体内非临床药代动力学(PK)和药效学(PD)在非临床设置中，进行了多种体内研究以表征BMS-986004,BMS-986003，和小鼠CD40LdAb-F替代物，BMS-2m-126-24-CT的PK和PD。关键发现总结如下。测量BMS-986004dA的ELISA开发了基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的生物分析方法以支持小鼠中的PK研究，急性和慢性效力研究，和采用猕猴的探索性PK/PD研究。在所有的情况下，获得全血并在EDTA的存在下制备血浆，然后该样品进行ELISA分析。使用ELISA测定测量BMS-986004的血浆浓度，所述ELISA测定利用人CD40L抗原以从测试样品中捕获分析物。测试样品在4℃解冻，充分混合，并以1:100稀释到测定稀释液中，所述稀释液由1×PBS,0.05％Tween-20,和1％BSA(PTB)组成。使用1％正常猴血浆/PTB作为稀释液完成样品的后续稀释。这允许测试分析物在几种稀释度(102–105)测定同时将样品基质保持在1％。从ProteinStructureandScience(PSS)，LVL获得重组三聚体人CD40L并以终浓度2μg/mL的终浓度结合至96孔板。使用以下项检测测试样品，质量控制(QC)样品和标准品：在PTB中稀释至0.25μg/mL浓度的亲和纯化的兔抗重链(Vh)域框架多克隆抗体(CovanceResearchProducts,Denver,PA)，然后辣根过氧化物酶标记的驴抗兔多克隆二抗(JacksonImmunoresearch,WestGrove,P)和添加的底物(TMB–四甲基联苯胺)，并使用1M磷酸终止酶促反应。在450nm波长测量吸光度。使用标准曲线进行测试样品中BMS-986004的分析。在每次运行的当天在1％猴血浆中制备的标准曲线校正器用于确定生物分析方法的动态范围。在100％血浆中所得的标准曲线的范围为10-1200ng/mL。从BiologicsProcessandProductDevelopment(BPPD),HPW获得BMS-986004的参考标准。参考标准材料是制造批次的代表并用于研究方案。使用≤20％(认为其对于测定表现是可以接受的)的准确度和精确度标准评估标准曲线和QC。使用4参数逻辑拟合回归模型定量测试样品，所述模型通过源自校正器的倒数浓度(1/x)加权。QC样品的性能(其通过计算的浓度与其名义值的偏差来测量)表明参考材料当在-70℃储存超过2个月时，以30-1000ng/ml的浓度在纯的猴血浆中稳定。非临床药代动力学表9总结了在非临床动物物种中，BMS-986004,BMS-986003,和小鼠BMS-2m-126-24-CT的PK参数。表9来自两种非临床动物物种的单剂量PK参数(平均值±SD)在猴中，BMS-986004和BMS-986003表现出可比的PK概况(图9A和图9B)。IV施用后，BMS-986004和BMS-986003的血浆浓度表现出双指数(bi-exponential)下降，分别直至504和408h。在参与两项研究的猴的50％中后来观察到了加速的清除。对BMS-986004处理后38天收集的血浆样品的免疫原性测试提示所有的猴形成了抗药物抗体(ADA)；且具有较高ADA水平的猴表现出较快的清除。尽管没有对使用BMS-986003的IVPK研究进行免疫原性测试，在PK/PD研究中使用BMS-986003皮下给药后的猴中观察到了相似水平的免疫原性，提示两种蛋白在猴中都是免疫原性的。因此，测定BMS-986004和BMS-986003的124和106h的终末半衰期，其仅使用收集直至两周(336h)的暴露进行。因此，BMS-986004和BMS-986003的分布稳态体积(Vss)分别为0.098和0.074L/kg。该值比血浆体积(0.06L/kg)大但比细胞外液的体积(0.2L/kg)小，提示该蛋白很大程度上存在于细胞外空间中。BMS-986004和BMS-986003的总机体血浆清除(CLTp)分别为0.59和0.65mL/h/kg。将BMS-986004在猴中的PK参数与阿巴西普，一种相似大小的蛋白(78.5对78-kDaBMS-986004，基于氨基酸序列)的那些比较，所述阿巴西普具有相同的经修饰的人IgG1Fc形式。如预期的，BMS-986004的参数与阿巴西普的那些几乎相同(CLTp为0.6mL/h/kg,Vss为0.087L/kg,T1/2为5d)，提示BMS-986004和阿巴西普的人PK很可能相似。在猴PK/PD研究中评估了皮下(SC)施用后BMS-986003的吸收。在使用钥孔戚血蓝素，一种T细胞依赖抗原免疫前24h，所述猴施用作为0(载体对照),0.2,2和20mg/kg的单皮下剂量的BMS-986003。给药后，BMS-986003被缓慢吸收，其中Tmax范围从6-96h(图10)。BMS-986003的暴露似乎小于所有剂量水平间的剂量比例。使用1:10:100的剂量比率，平均Cmax和AUC0-inf比率分别为1:12:80和1:7:44。使用IV剂量(2mg/kg)后的暴露作为参考，并假设IV给药后的线性PK，0.2,2,和20mg/kg的BMS-986003的SC生物可用性分别为88％,74％,和44％。终末T1/2被在给药后2至5周时在大多数猴的情况中观察到的免疫原性混淆。因此，估算在0.2,2和20mg/kg，T1/2分别为85,66,和105h。在20mg/kgIV施用后，评估5c8-IgG1，在PK/PD研究中用作阳性对照的抗人CD40L单克隆抗体的PK(图11)。当与相同剂量SC给予的BMS-986003比较时，5c8-IgG1表现出高10倍的血浆暴露和长4倍的T1/2(表9)。在单次IV和SC施用后，在小鼠中评估了小鼠替代物dAb-Fc融合蛋白BMS-2m-126-24-CT的PK(表9)。单次IV(1mg/kg)后，血浆浓度遵循单指数下降，其中终末T1/2为101h(图11)。CLTp为1.85mL/h/kg；而Vss在0.26L/kg，指示细胞外分布。在1和10mg/kg单次SC给药后，BMS-2m-126-24-CT被缓慢吸收，其中Tmax为24h。系统性暴露以剂量成比例的方式增加。使用1：10的剂量比率，Cmax和AUC0-inf以1：11的比例增加。1和10mg/kg的终末T1/2分别为100和120h。SC和IV施用后，剂量调整的暴露(AUC0-inf)的比率大于1，提示SC施用后的完全吸收。药代动力学/药效学建模在PK/PD研究中，作为对抗KLH抗体反应的抑制测量BMS-986003的PD。在最高的剂量20mg/kg，BMS-986003抑制了70％的对KLH的抗体反应在2和0.2mg/kg，发生微小的(15％)对抗体反应的抑制和无对抗体反应的抑制。作为对比，5c8-IgG1表现出比相同剂量水平(20mg/kg)的BMS-986003高10倍的血浆暴露和长4倍的T1/2。因此，5c8-IgG1抑制97％抗KLH抗体反应。为了比较BMS-986003和5c8-IgG1之间的体内效能，使用SAAMII(版本1.2.1,Seattle,WA)进行了PK/PD建模。使用与2室模型(2-compartmentmodel)偶联的一阶吸收动力学描述了SC施用后BMS-986003的血浆浓度，其中在中央和周围区室两者中发生消除。由于来自免疫原性和可能的非线性吸收的复杂性，在每个剂量个别拟合PK数据。对于5c8-IgG1，使用了具有中央消除的二室模型。使用6室信号转导模型对抗KLH抗体反应(表示为IgG滴度的平均值)进行建模。将机体中的KLH的动力学假设为1室模型。使用Imax模型描述BMS-986003和5c8-IgG1对IgG产生的抑制，其中最大抑制等于100％。如图12中所示，该模型拟合的曲线能够描述PK和PD概况两者。对于抑制KLH诱导的IgG产生，BMS-986003和5c8-IgG1的血浆IC50分别估算为74±14和60±18nM。这些结果证明了这两种分子的效能在体内可比。在IVPK模型中测量了BMS-986004的CD40L受体占有率(RO)。11mg/kgIV施用后，BMS-986004在外周血单核细胞上(PBMC)的RO是时间和浓度依赖的。进行了PK/PD建模以评估ROEC50。使用修改的二室模型对血浆浓度进行建模，其中在给药后504h引入另外的ADA介导的一阶消除常数；且使用Emax模型对RO进行建模。如图13中所示，拟合的曲线能够描述暴露和RO两者，其中估算的ROEC50为3.4±0.3nM，而γ(hill因子)为3.1±0.1。作为对比，ROEC50比74±14nM的抗KLH抗体反应低约22倍，提示为了实现察觉的(>50％)抗KLH抗体抑制，需要>95％RO。实施例10TE/血栓形成的风险评估据推测与抗CD40L单克隆抗体的施用相关的TE是由抗CD40mAb-CD40L免疫复合物(IC)介导的血小板的交联所介导的，由IC对FcgRIIa(一种IgGFc受体)的结合推动，引起活化和聚集。因此，阻断IgG的Fc部分与FcgRIIa的相互作用预期减轻血小板交联和血栓形成。设计了以下方法和办法来评估TE和/或血栓形成的风险。体外血小板活化测定进行了几种体外测定以测试血小板被CD40LMab/sCD40LIC以FcgRIIa依赖的方式活化的假设。阳性对照5c8-IgG1用于在测试BMS-986003和BMS-986004之前验证测定。来自人类供体或在血小板上表达hFcgRIIa受体的小鼠的血液用于这些研究。通过流式细胞术使用针对良好验证的血小板活化标志物P-选择素(CD62P)和PAC-1(活化的GPIIb/IIIa)检测血小板活化。简短的说，将血液以1:25稀释于含有1mMCaCl2的经修改的Tyrodes-HEPES中，向其添加检测抗体和测试试剂，孵育，并分析血小板活化。初始实验确定了sCD40L或5c8IgG1单独不活化血小板，但5c8:sCD40L的1：1至1：8的不同免疫复合物比率显著活化血小板。后续实验使用5c8-IgG1或5c8-mIgG2aIC，主要以5c8:sCD40L为1：3的摩尔比率。通过5c8/sCD40LIC的血小板活化可以被抗FcgRIIa抗体阻断使用FcgRIIa阻断抗体IV.3进行了研究以测试通过5c8/sCD40LIC的血小板活化是否确实是FcgRIIA介导的。将来自人供体的血液与0.5μg/μl的FcgRIIa阻断抗体IV.3预孵育，之后稀释和与检测抗体孵育，如上文描述。腺苷二磷酸(ADP)，一种通过不同机制的血小板活化子，用作阳性对照。如图14中所示，通过5c8/sCD40IC的血小板活化被IV.3完全阻断，而通过ADP的活化不被阻断抗体抑制，指示通过IC的活化是FcgRIIa介导的。惰性Fc尾的选择对于潜在的候选分子的要求是不存在对FcgRIIa的结合以防止潜在的血小板活化。表达了含有来源于IgG1(例如，5c8-CT和N297Q)或IgG4(例如5c8-S228P)的不同突变的几种5c8构建体并筛选不活化血小板的Fc尾，使用不同的sCD40L比mAbs的摩尔比率。野生型和大多数突变的构建体活化血小板，除了5c8-CT和5c8-N297Q之外(图15)。Fc(5c8-Fab2)的缺乏也不活化血小板，进一步确认了IC-血小板活化是Fc介导的。选择了CT尾来格式化dab候选物BMS-986003和BMS-986004。FcgRIIa多态性对血小板活化的影响FcgRIIa的基因在密码子131处可变，导致His-Arg(CAT/CGT)多态性。在约100个个体(具有约相等的高加索人和非洲裔美国人分布)中的基因型分布为对于高加索美国人为A/A(His纯合；14％),A/G(His/Arg杂合；60％),和G/G(精氨酸纯合；26％)和对于非洲裔美国人为A/A(30％),A/G(51％),和G/G(19％)。Reilly等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1:640-644(1994)。当使用mIgG2或mIgG1Fc形式的抗CD9处理时，注意到来自R131个体的样品中Fc依赖的血小板聚集，而来自H131个体的血小板仅在使用mIgG2形式的抗CD9时聚集；这提示使用IgG1mAb的Fc依赖的聚集可以潜在地将患者群体分离为低和高响应者，这先前已经报道为具有这种多态性。Tomiyama等人，Blood80:2261-2268(1992)。为了解决使用IgG1和CTFc尾的血小板活化中的任何潜在差异，将19名供体对hFcgRIIa多态性进行基因型分型，并对样品测试血小板活化。供体合并物多态性(RR；42％,HH；21％,HR；37％)足以评估对IgG1形式的血小板活化中的任意潜在差异。代表性的文献报道，使用5c8-IgG1/sCD40LIC的血小板活化在所有基因型分析的个体中相似。使用5c8-CT/sCD40LIC没有发现活化(图16)，提示使用经CT尾格式化的抗体在患者群体中无增加的TE风险或最小化的增加的TE风险。BMS-986004：人血液供体中的血小板活化使用5c8的上述实验支持选择CT-尾作为BMS-986004的最佳形式(也称为BMS2h-572-633-CT-L2)。从6名供体获得的血液使用5c8-IgG1,5c8-CT,F(ab)2,和BMS-986004处理。血小板被5c8-IgG1活化，但不被任意其它构建体活化，包括BMS-986004(图17)，提示该dAb对于在临床研究中导致血小板活化和TE无风险或具有低风险。BMS-986003：来自表达hFcgRIIa的小鼠的血液中的血小板活化为了进一步确认通过抗CD40L抗体的血小板活化是由FcgRIIa介导的，来自表达人受体(R131基因型)的转基因小鼠的血液使用5c8-IgG1,5c8-IgG2a,dAb-IgG1,5c8-CT,和BMS-986003(也称为BMS-2h572-633-CT)处理。在来自表达hFcgRIIa的小鼠，而不是野生型同窝小鼠(littermates)的血液中，血小板被5c8-IgG1,5c8-IgG2a,和dAb-IgG1/sCD40LIC特异性活化。5c8-CT和BMS-986003不活化血小板，进一步确认了使用现在公开的抗体对于TE的低风险(图18)。实施例11免疫抑制方案在猕猴中进行了移植研究以评估在非人灵长类肾移植模型中单独以及与贝拉西普组合的BMS-98600的效力。对于这些研究，将猴分为以下剂量反应组和治疗方案：第1阶段-第1部分：仅BMS-986004的剂量反应(猴的n＝9)A组(高剂量)：BMS-986004，20mg/kg静脉内(n＝6)在手术后天数(POD)0,7,14,21,28,35,42,49,56和70时施用(每周一次)在POD77时处死B组：(中等剂量)：BMS-986004，10mg/kg静脉内(n＝1)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70时施用(每周一次)C组：(低剂量)：BMS-986004dAb，2mg/kg静脉内(n＝2)每周施用直到POD70第1阶段-第2部分：与贝拉西普的组合治疗(n＝6)BMS-986004单独，20mg/kg静脉内在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70时施用(每周一次)BMS-986004，20mg/kg静脉内+贝拉西普，20mg/kg静脉内在POD0,7,14,21,28,4256,和70时施用第2阶段-第1部分：对仅BMS-986004的剂量反应(n＝5)A组(高剂量)：BMS-986004，20mg/kg静脉内(n＝3)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70施用(每周一次)B组(高剂量)：BMS-986004，30mg/kg静脉内(n＝2)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70施用(每周一次)跟踪动物的存活直到端点。如以下实施例中所证明的，有些猴没有存活到期望的端点。这些动物不能完成计划的剂量方案。在以下实施例中讨论了结果。实施例12移植物功能在猕猴中进行了移植研究以评估CD40LdAbBMS-986004的合适给药。为了理解根本机制，完成了BMS-986004对存活的影响的评估和任意排斥反应的表征。实验室评估进行了血清肌酸酐研究以测试在使用BMS-986004治疗的猕猴中随时间的同种移植物功能。同种移植物失效定义为肾衰竭的形成，所述肾衰竭在临床设置中足以要求透析(即，BUN>100mg/dL或高血钾症>7.0伴随升高的肌酸酐)，其中BUN和血清肌酸酐水平用作肾衰竭的生物标志物。图19-21示出了第1阶段-第1部分使用高剂量(20mg/kg)，中等剂量(10mg/kg)，和低剂量(2mg/kg)的BMS-986004治疗的肾移植猕猴的血清肌酸酐水平。在移植后约6天后，低剂量和中等剂量组表现出高血钾症>6.0，伴随着升高的肌酸酐水平。在移植后60天以前，高剂量组中没有一只猴表现出高血钾症>7.0。记录了接受体存活时间，并在同种移植物失效的时候对猕猴实施安乐死。以下表10提供了第1阶段-第1部分接受体存活数据和临床评估：表10接受体存活-低，中等，和高剂量*计划的Sac＝计划的处死对于第1阶段-第2部分使用甚至更高剂量(30mg/kg)治疗的肾移植的猕猴进行了相似的实验。图22提供了治疗的猕猴的肌酸酐曲线。以下表11提供了第1阶段-第2部分接受体存活数据和临床评估：表11接受体存活-剂量递增在另外的研究中，在五个接受体中观察到了以下结果。对于使用20mg/kgBMS-986004组或20mg/kgBMS-986004+20mg/kg贝拉西普处理的阶段2肾移植的猕猴进行了相似的研究。图23提供了处理的猴的肌酸酐曲线。以下表12提供了第II阶段-第1部分接受体存活数据和临床评估。最后一剂抗CD154dAb在移植后第70天，而最后一剂贝拉西普在移植后第168天。表12接受体存活-组合疗法肾同种移植物活组织检查为了进一步评估同种移植物功能，猕猴在移植后第35和70天进行那个了经皮肾活组织检查。由具有肾移植专业知识的兽医病理学家进行了初步组织学分析。通过用于鉴定肾同种移植物排斥的标准化的Banff标准表征活组织检查。该Banff标准定义于以下表13-16中：表13急性T细胞介导的排斥的标准表14单核细胞间质性炎症的量化标准(“i分数”)i0无或微不足道的间质性炎症(<10％的无疤痕薄壁组织)i110至25％的发炎的薄壁组织i226至50％的发炎的薄壁组织i3大于50％的发炎的薄壁组织表15小管炎的量化标准(“t分数”)表16动脉内膜炎的量化标准(“v分数”)经皮肾活组织检查的结果包括在下表中。表17经皮肾活组织检查组织学分析*Bx＝活组织检查；*Sac＝处死实施例13通过流式细胞术的细胞表型确定从第II阶段猕猴收集外周血样品并进行细胞表型分析以评估白细胞组分(免疫表型)和与免疫活化一致的其它细胞标志物。第II阶段-20mg/kgBMS-986004组和20mg/kgBMS-986004+20mg/kg贝拉西普组的初步均值组T细胞亚群流式细胞术数据示于图24-31中。在实施安乐死的时候，也收集了肾同种移植物，脾，淋巴结和骨髓样品。同种移植物薄壁组织经处理用于组织浸润细胞的提取，并通过流式细胞术和基因阵列表达序型分析来分析。实施例14BMS-986004和贝拉西普的水平进行了研究以确定从第I阶段-第1部分使用2mg/kg(n＝2),10mg/kg(n＝1),或20mg/kg(n＝6)的BMS-986004和贝拉西普的猕猴收集的血浆样品中抗BMS-986004和抗贝拉西普的水平。在各个剂量给予前即刻获得样品，所述剂量在第0天(移植前)；在移植结束时(移植前输注后2hrs)；移植后第4、7、14、28和此后两周一次给予。实施例15病毒载量测定已经显示了当患者处于免疫抑制的状态时，移植后发生病毒再活化。使用先前已经描述的实时PCR技术，监控使用20mg/kg的BMS-986004治疗的猕猴的巨细胞病毒(CMV)病毒再活化的存在。在任意治疗的猴中，没有巨细胞病毒(CMV)病毒再活化的证据。(见图32)。该数据提供了进一步的支持，即免疫系统被BMS-986004充分地抑制而不存在CMV的再活化。通过分析猕猴全血，监控使用20mg/kg的BMS-986004治疗的猕猴的猕猴巨细胞病毒(RhCMV)，猴肾病毒40(SV30)，和淋巴细胞隐病毒(LCV)的存在。实施例16血栓栓塞潜力的分析分析来自多个时间点的猕猴血浆样品的分析D-Dimer，纤维蛋白原，和抗凝血酶水平，以及PT/aPTT(凝血酶原时间/活化部分凝血原酶时间)。每周从完全血液计数(CBC)记录血小板计数。还记录血小板分布宽度。血小板分布宽度是用作血栓栓塞诊断的标志物的指数。血小板分布宽度由于与血栓栓塞相关的血小板活化增加。收集时间最初集中于手术程序左右，然后贯穿猴的剩余生命以定期时间点间隔。在肾切除术前的两个时间；肾切除术后第1和7天；移植后第0,1,4,7,14,21,28天，然后每2周一次直到安乐死时并包括安乐死时收集血浆样品。实施例17尸体剖检评估在猕猴上进行尸体剖检以确认它们是否表现出任何血栓栓塞综合症样的症状。进行了标准的总体检查(grossexamination)。从所有的猴收集组织，包括肾同种移植物，肾上腺，脑，结肠，十二指肠，心脏，回肠，腹股沟淋巴结，纵膈淋巴结，空肠，肝脏，肺，肠系膜淋巴结，胰腺，甲状旁腺，皮肤，脾，胃，胸腺，甲状腺组织。在10％中性缓冲的福尔马林中收集这些样品。收集并储存肾同种移植物，心脏，皮肤，肺，脾，胸腺，纵膈淋巴结和腹股沟淋巴结的另外的组织。还收集任何严重异常的组织区，以及如果可能的话来自正常对照猴的组织的对应区域。处死后，没有血栓栓塞(TE)的总体或组织学证据。测定的多种T细胞分析证明维持了动物的保护性免疫。发现治疗是安全且有效的，并具有与先前的抗CD154疗法相似的效能。实施例18单一疗法，单一疗法+常规疗法，和组合疗法遵循如上文所述的相同的指导方针和使用相同的动物，施用单独或在一些组合疗法中的20mg/kg抗CD28dAb。对于使用单独贝拉西普的单一疗法或与常规疗法组合或与抗CD28dAb组合，在肾移植前以10mg/kg的剂量施用贝拉西普，接着在肾移植后第4天以15mg/kg和第7,14,18,42,56,84,112,140和168天以20mg/kg再次施用。常规疗法由以下组成：A)在第0天和此后不久施用抗IL-2R；B)从第0天至第28天开始20mg/天的甲强龙，第29天至第84天降低至2mg/天的甲强龙，在这一点甲强龙降低到1mg/天；和C)从第0天至第28天b.i.d.(一天两次)施用15mg吗替麦考酚酯(MMF)然后此后15mg.q.d.(每天一次)。对于施用各种疗法的动物，结果示于表18-20中。表18表19表20对于组合的抗CD154dAb和常规疗法，从POD0至POD70每周30mg/kg静脉内施用抗CD154dAb，然后从POD70至POD140两周一次施用抗CD154dAb而没有常规疗法。然后在POD140之后以30mg/kg每月静脉内施用抗CD154dAb。抗CD28dAb在本文中称为BMS-931699，其为共同转让的美国专利号8,168,759中所述的PEG化的抗CD28dAb。PEG部分为40kDa支链聚乙二醇。抗CD28dAb的序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRHGVPSRFSGSGSGTCFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR(SEQIDNO:26)尽管参考以上实施例描述了实施方案，应当理解不偏离这些实施方案的精神可以完成多种修改，并将是本领技术人员容易知道的。当前第1页1 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